活体小鼠中表达荧光蛋白的亚细胞结构成像的活体显微镜技术

本实验的总体目标是可视化小鼠唾液腺中的亚细胞结构。首先通过外科手术暴露唾液腺，且不对其造成损伤；第二步，将麻醉后的动物固定在显微镜载物台上。

接下来，需小心放置唾液腺，以确保其在最终步骤中的功能不受影响。使用定制的固定装置稳定小鼠，以最大限度减少因动物心跳或呼吸引起的各种运动伪影。最终，可通过活体显微镜成像来观察亚细胞结构的动态变化。

在麻醉前，称量小鼠体重以确定合适的麻醉剂剂量。随后，通过吸入异氟烷诱导麻醉。动物失去意识后，每隔15分钟通过脚趾夹捏试验确认镇静状态，并在整个手术过程中将小鼠置于加热灯下保温。

使用直肠探头温度计监测动物的体温。现在用电动剪刀剃除小鼠颈部的毛发，然后用浸有乙醇的纱布擦拭颈部腹侧，并用无尘纸擦干多余的乙醇。接下来，使用一把钝头弯镊子在咬肌下端外侧提起一小块皮肤，并做一小切口。

将剪刀插入切口，刀尖朝上，朝向皮肤下方，反复张开刀片数次，直至皮肤与下方组织分离。然后从唾液腺基部附近开始，此处神经导管和血管将腺体与身体其余部分相连。用剪刀剪下一条已松解的皮肤条，宽3毫米，长10毫米。

清洁伤口区域后，形成的切口呈椭圆形，大小约为 8 毫米 × 12 毫米。两侧的唾液腺均可见。使用注射器将光学耦合凝胶涂抹于切口中央，然后用新的无菌纱布将凝胶向外擦拭，直至清除所有血液和松散毛发。

现在使用一对7号镊子找到右侧唾液腺的尖端，在腺体顶端上方几毫米处的结缔组织上进行夹持。然后撕除腺体周围的结缔组织，注意不要损伤实质组织。一旦唾液腺暴露，轻柔地将结缔组织从腺体上分离，并用生理盐水冲洗掉任何出血。

确保所有结缔组织均已分离，腺体完全暴露。在将动物置于显微镜下之前，先在显微镜载物台上放置一块厚纱布和一个加热包，并在加热包顶部再覆盖一层薄纱布。将盖玻片置于载物台中央。

然后将小鼠右侧朝上放置在纱布上，用一片医用胶带固定其右前肢腹侧，并用丝线缝合线钩住门齿。在缝线与前肢之间施加一定张力，并将其固定于载物台上。使用更多医用胶带，使唾液腺自然放置。

在盖玻片中央。使用连接到显微镜载物台的塑料楔块进一步固定小鼠的头部和胸廓。然后将一小块镜头清洁纸放在腺体上方。

轻轻拉伸腺体，并将定制的固定器置于腺体上方。然后使用金属夹和医用胶带将稳定器牢固地固定在载物台上。用纱布和加热垫覆盖动物，并使用配备柔性热电偶探针的温度计实时监测暴露腺体的温度。动物稳定后，立即采用落射荧光照明，聚焦于腺体表面。

评估毛细血管中的血流情况以及组织的整体形态。使用 488 纳米激光激发 GFP 基因。将峰值功率设为 0.5 毫瓦，以避免对 tandem tomato 蛋白造成光漂白。

使用561纳米激光，将峰值功率设置为1毫瓦。现在通过预扫描选定区域来评估组织的稳定性。如果样本不稳定，需相应调整动物位置，以找到合适的焦平面。

在预扫描模式下，逐渐移动物镜靠近盖玻片，直至分泌颗粒、分泌颗粒结构和质膜清晰可见。随后，为观察分泌颗粒的动态变化，采用每帧0.5至2秒的扫描速度，图像分辨率为256 × 256像素，空间尺度为0.2微米/像素。

为了最佳地观察颗粒和质膜，将光学厚度设置在0.9至1.2微米之间。接着，记录视野图像作为参考点。最后，通过皮下注射0.1毫克/千克新鲜配制的异丙肾上腺素和生理盐水，刺激胞吐作用。

注射后一分钟。分泌颗粒与质膜的融合将通过颗粒周围GFP荧光的增强以及串联番茄肽在其限制膜中的扩散而被检测到。在GFPM番茄小鼠中，这些颗粒呈现为清晰可辨的结构，表达胞质GFP和膜定位的串联番茄肽，如虚线所示。

在单个胰岛δ细胞中，由串联的番茄肽标记出细胞边界，如箭头所示。同时可在胰岛δ细胞内清晰可见的细胞核中检测到GFP。胞质中的GFP（由箭头指示）被排除在分泌颗粒之外，这些分泌颗粒呈现为直径约1至1.5微米的圆形暗泡状囊泡。

为观察外排事件，在异丙肾上腺素注射后，显示了一个由星号标示的富含分泌颗粒的质膜代表性区域。可见靠近质膜的一些分泌颗粒周围绿色荧光蛋白（GFP）荧光水平升高，以绿色箭头指示。此外，分泌颗粒与质膜融合后，串联番茄肽扩散至分泌颗粒的限界膜中，如红色箭头所示。

30至40秒后，分泌颗粒逐渐崩解，其边界膜被整合到顶膜质膜中。本文所介绍的方法代表了细胞生物学领域的一项重大突破，因为它能够在活体小鼠中对特定的膜运输过程动态进行成像。