2.7: 박테리아 형질변환: 전기 천공법

박테리아 형질전환은 박테리아가 외부 DNA를 섭취한 다음 증폭하거나 복제하는 자연적으로 발생하는 과정입니다. 실험실에서는 고전압 전기장 펄스를 사용하여 박테리아 세포막에 구멍을 만들어 플라스미드 DNA가 통과할 수 있는 구멍을 생성함으로써 이 과정을 인위적으로 유도할 수 있습니다. Electroporation은 이 방법을 참조하며 다음 비디오는 그 원리, 단계별 절차 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

박테리아의 전기천공에 대해 이야기하기 전에 이러한 실험에 사용된 DNA의 유형인 플라스미드를 이해하는 것이 중요합니다. 플라스미드(plasmid)는 염색체외 DNA의 작은 원형 조각으로, 특정 DNA 염기서열의 운반체인 매개체 역할을 합니다.

이 염기서열이 해파리의 형광 단백질을 위한 유전자이든 식물의 효소이든 상관없이, 다중 클로닝 사이트(multiple cloning site) 또는 MCS라고 하는 영역을 통해 플라스미드에 삽입됩니다. 이 영역에는 제한 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소에 의해 절단된 특정 서열이 포함되어 있습니다. 동일한 제한 효소를 사용하여 관심 염기서열을 절단하여 말단이 플라스미드의 새로 절단된 말단과 상보적이 되도록 할 수 있습니다.

플라스미드는 또한 복제될 지점을 나타내는 ORI로 약칭되는 복제의 기원을 포함합니다. 형질전환에 있어서는 항생제 내성 유전자가 매우 중요합니다. 이름에서 알 수 있듯이 이 유전자는 박테리아가 항생제를 중화하는 효소를 생성하여 항생제가 함유된 배지에서 생존할 수 있도록 합니다.

Electroporation은 electroporator라고 하는 특수 장치를 사용합니다. 일반적으로 세포는 전기천공법 큐벳에 배치되며, 큐벳의 양쪽에 전극이 있어 삽입되면 기계와 전기적 접촉을 합니다.

DNA와 혼합된 박테리아 세포를 전기천공법 큐벳에 로드하고 1000-10,000볼트/센티미터의 전기장을 몇 밀리초 동안 적용합니다. 이로 인해 멤브레인 양단의 전압이 0.5-1볼트에 도달하게 되며, 이는 세포막을 구성하는 인광 이중층의 재배열로 이어져 기공이 형성되는 것으로 여겨집니다. 이 상태에서 플라스미드 DNA는 멤브레인을 통과하고 펄스가 완료되면 이중층이 스스로 복구됩니다.

플라스미드를 흡수한 박테리아는 항생제가 함유된 한천 플레이트에서 자랄 수 있습니다.

이제 우리는 플라스미드와 electroporation 메커니즘에 대해 배웠습니다. 절차가 어떻게 수행되는지 살펴 보겠습니다.

DNA를 쉽게 흡수할 수 있는 세포를 유능 세포(competent cell)라고 합니다. 분자 생물학 연구에서 변형되는 가장 흔한 유형의 유능한 박테리아는 대장균(E. coli)으로, 이는 하부장에 서식하는 원핵 박테리아입니다. 전기천공을 위해 준비된 대장균을 전기 수용 세포(electrocompetent cell)라고 합니다.

박테리아를 다룰 때마다 작업 영역이 가능한 한 깨끗한지 확인하십시오.

박테리아를 다루려면 무균 기술을 연습해야 합니다. 일반적으로 이것은 분젠 버너를 사용하여 기기를 살균하고 대류 전류를 생성하는 것을 포함합니다. 공기 중 오염 물질이 작업 공간에서 멀리 떨어지는 것을 방지합니다.

전기천공법 직전, 매체를 실온으로 예열하고 항생제가 함유된 한천 플레이트를 37로 가져오십니까? C, 얼음 위에 시원한 전기천공레이션 큐벳을 올려주세요.

다음으로, 세척된 전기 컴피턴트 셀을 얼음 위에서 해동합니다.

1ng/의 1-5uL 추가? L 박테리아 세포에 염분이 없는 저온 플라스미드를 부드럽게 섞은 후 차가운 큐벳에 혼합물을 첨가합니다. 거품이 없는지 확인하십시오.

electroporator의 전압 및 자기장 강도를 세포에 대한 올바른 설정으로 설정하십시오. 여기에서 electroporator가 1700V로 설정되고 17kV/cm의 전계 강도를 생성하는 것을 볼 수 있습니다.

큐벳 외부를 닦아 말리고 electroporator에 넣습니다. 삐 소리가 들릴 때까지 세포를 펄스합니다.

펄싱이 실패하면 전기 방전이 발생하며, 이는 눈에 보이는 스파크와 가청 팝으로 관찰할 수 있습니다. 아크(arcing)라고 하는 이 분비물은 유능한 세포나 DNA에 너무 많은 염분이 함유된 결과일 수 있습니다.

변환의 성공 여부는 펄스를 가한 후 전압이 감소하는 데 걸리는 시간인 시간 상수를 기록하여 예측할 수 있습니다. 소금이 존재하고 전기천공법이 전도성이 매우 높으면 부패가 빠르게 일어나 방전을 일으키고 그로 인해 많은 세포가 죽습니다. 박테리아의 경우 좋은 시간 상수 범위는 5-10밀리초입니다.

펄스 직후 큐벳을 제거하고 1ml의 배지를 세포에 직접 추가합니다. 배지를 포함하는 이 세포는 튜브에 넣고 37? 세포가 회복될 수 있도록 흔들면서 C를 1시간 동안 유지합니다.

그런 다음 무균 기술을 사용하여 세포의 20-200uL을 한천을 함유 한 항생제에 첨가합니다. 한천이 맨 위에 오도록 플레이트를 뒤집어 응축이 세포로 떨어지지 않도록 하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

플라스미드로 형질전환된 박테리아는 군체를 형성해야 합니다. 군체를 세고 성공적인 형질전환체의 수를 도금된 DNA의 총량으로 나눈 형질전환 효율을 계산합니다.

박테리아에 영양을 공급하는 한천과 배지는 미리 준비해야 하며 오토클레이브를 통해 멸균해야 합니다. 사용하기 전에 액체 매체를 실온으로 식히고 한천을 50-55도로 식히시겠습니까? C ? 항생제를 첨가하고 플레이트를 부을 수 있는 온도입니다. 그런 다음 플레이트를 실온으로 식혀 응고시킵니다.

형질전환에 사용되는 박테리아는 냉동고에 보관하기 때문에 먼저 얼음에서 해동하고 항생제 없이 한천 플레이트에 펴 바른 다음 37°C에서 하룻밤 동안 배양해야 합니다.

무균 기술을 사용하여 한천 플레이트에서 박테리아 군체를 선택하고 37도에서 하룻밤 동안 더 큰 500mL 배양액에서 성장합니까? C를 흔들어 인큐베이터에 넣었습니다.

세포가 자라는 동안 약 1리터의 탈이온수를 준비하고 10% 글리세롤과 물, 부피 대 부피 용액을 구성합니다. 용액을 오토클레이브하고 4°C에서 식히십시오.

흡광도 측정은 박테리아가 성장의 중간 단계에 있는지 여부를 결정하는 데 사용되며, 이는 박테리아가 DNA를 쉽게 흡수한다는 것을 의미합니다. 세포가 이 단계에 도달하면 얼음 위에 놓고 절차 내내 그대로 두십시오.

다음으로, 두 개의 큰 원심분리기 튜브에서 세포를 분리하여 세척하고 4에서 회전합니까? C, 상등액을 붓고 차가운 100mL 멸균 탈이온수에 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 이상 반복합니다. 이 단계 특정 단계의 목적은 소금을 제거하는 것이며, 이는 전기천공법 기술에 큰 영향을 미칩니다.

물에 10% 글리세롤 50ml를 두 번 더 씻고 마지막으로 동일한 용액에 박테리아를 재현탁시킵니다.

50을 추가하시겠습니까? L개의 세포를 여러 Eppendorf tube로 분할합니다. 이 세포는 이제 electroporation에 사용할 준비가 되었으며 4°C로 유지해야 합니다. 또는 급속 냉동하여 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

보시다시피 전기천공법에는 많은 응용 분야가 있습니다.

전기천공법의 대안은 열 충격 변환(heat shock transformation)으로, 이는 DNA를 세포에 도입하기 위해 박테리아가 염화칼슘과 열에 모두 노출되는 것에 의존합니다.

일반적으로 열 충격은 전기천공법보다 박테리아에 더 부드럽고, 낮은 염분을 필요로 하지 않습니다. 타겟 유전자를 플라스미드에 삽입하는 것과 관련된 결찰 반응은 열 충격 변환에 직접 사용될 수 있습니다. 열 충격 변환은 electroporation보다 저렴하며 값 비싼 장비나 큐벳에 의존하지 않습니다. 반면에 열 충격은 electroporation보다 변환 효율이 낮고 시간이 더 오래 걸립니다. 또한 박테리아, 효모 및 식물 원형질체에 국한되며 전기천공법은 포유류 세포에 적용될 수 있습니다.

여기에서 마우스 배아 섬유아세포가 전기천공법 큐벳에 로드되는 것을 볼 수 있습니다. 전기천공법이 완료되면 세포가 플라스미드에 의해 인코딩된 녹색 형광 단백질을 생산하는 정도를 관찰하여 형질전환 효율을 결정할 수 있습니다. 형질주입(Transfection)은 포유류 세포의 형질전환에 부여된 용어로, 일반적으로 박테리아 세포보다 낮은 전계 강도와 더 높은 시간 상수를 필요로 합니다.

전기천공법은 여기에서 본 발달 중인 닭 배아와 같은 전체 동물에서도 수행할 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 병아리의 뇌에 주입한 다음 전기천공법 프로브를 사용하여 뇌 조직에 전기장을 가합니다. 하루나 이틀 후, 플라스미드에 의해 암호화된 녹색과 적색 형광 단백질이 뉴런에 의해 만들어지고, 과학자들은 발달 중인 병아리 뇌의 구조적 변화를 관찰할 수 있다.

당신은 방금 전기천공법에 의한 박테리아 변형에 대한 JoVE 소개를 보았습니다. 이 비디오는 가장 일반적으로 변형되는 DNA 유형인 플라스미드를 소개하고, 전기천공법의 기초가 되는 것으로 생각되는 생물물리학적 메커니즘에 대해 논의하고, 전기천공법을 수행하기 위한 일반화된 절차를 보여주고, 포유류 시스템에서 전기천공법을 사용하는 방법을 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!