Name: DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 배우세요 8-oxoguanine DNA glycosylase의 글리코실레이스 활동을 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 조건에서 측정하는 방법을. 퀜치 플로우 기법과 급격한 동역학 기술을 사용하여 효소 활성을 분석합니다.

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우리는 도움이 제안과 토론 원고 박사 라젠 드라 프라 사드의 중요한 읽기 박사 줄리 K. 호튼 감사합니다. 본 연구의 일부는 원래 생물 화학, 사사 등의 저널에 발표되었다. 알., &quot;인간 8 Oxoguanine DNA의 Glycosylase의 Glycosylase 활동에 DNA 시퀀스 컨텍스트 효과.&quot;J BIOL 화학. 287, 36702-36710 (2012) 2. 이 작품은 교내 연구 프로그램에 건강 연구 프로젝트 그랜트 Z01-ES050158의 국립 연구소, NIEHS에 의해 전체 또는 일부를 지원 하였다.

1. 효소와 DNA 기판의 제조 <ol><li> E.의 GST 융합 단백질 등을 통해 표현 OGG1 대장균, 정화 GST-태그를 사용하고 HRV-3C 프로테아제 (그림 1) 6 절단하여 GST-태그를 제거합니다. </li><li> 단일 8 oxoG 잔류 물을 포함하는 화학적으로 합성 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM)로 표시 올리고 뉴클레오티드 및 그 보완 레이블 올리고 뉴클레오티드 가닥을 구입할 수 있습니다. 34 메르 올리고 뉴클레오티드는 5&#39;-말단의 위치 17에서 8 oxoG가 포함되어 있습니다. 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동하여 이러한 올리고 뉴클레오티드를 정화. </li><li> 어닐링 버퍼에 1:1.2의 몰비 (10 MM 트리스 - 염산, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨, 1에서의 보완 가닥 혼합 5&#39;-6-FAM 표시 올리고 뉴클레오티드에 의해 8 oxoG를 포함하는 이중 가닥 DNA 기판을 준비 1.5 ML의의 microfuge 튜브 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 5 분 동안 끓는 물에 부유물에 튜브를 놓습니다. R에 천천히 물이 식지 그 장소에 관두고움 온도 (이 약 2 시간 소요). </li><li> 형광 라벨의 photobleaching에 최소화 할 수있는만큼 낮거나 최소한의 조명 조건 하에서 시료 준비와 실험을 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 정상 상태 시간 코스 및 OGG1의 활성 부위의 적정 측정 2.1. 샘플 준비 및 정상 상태 시간 코스 <ol><li> 얼음에 1.5 ML의의 microfuge 튜브 (50 MM의 HEPES, 산도 7.5, 20 MM의 KCl을, 0.5 mM의 EDTA, 0.1 % 소 혈청 알부민) 반응 버퍼에 별도로 DNA 기판 및 OGG1 솔루션을 준비합니다. DNA의 농도는 400 nm의이며 OGG1의 명백한 농도는 60 30, 90, 또는 120 nm의은 브래드 포드 단백질 분석에 의해 결정됩니다. 37 열 블록 세트의 반응 튜브를 놓습니다 ° C. 37 미리 부화 효소 및 따로 DNA 기판 솔루션 ° 1 분 C. </li><li> pipetting하여 OGG1 및 DNA 기판 솔루션의 동일한 볼륨을 혼합하여 반응을 시작합니다. 이러한 솔루션을 혼합 한 후화 : 1시 1분 (V / V)의 최종 농도는 200 nm의 DNA와 15, 30, 45, 또는 60 nM의 OGG1, 각각입니다. 시간 간격으로 분주 (10 μL)를 제거하고 1 M NaOH를 1 μL와 혼합하여 반응을 끄다. 시간 과정, 효소없이 반응 혼합물의 10 μL에 대한 제어는 1 M NaOH를 1 μL와 혼합 때문입니다. </li><li> 다니엘 5 분 결과물 AP-사이트 90 ° C 열 블록에 반응 샘플을 놓습니다. 가열 후, 각각의 샘플을 중화하기 위해 1 M 염산 1 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응 샘플 겔 로딩 버퍼의 동일한 볼륨을 (12 μL) (95 % 포름 아미드, 20 mM의 EDTA, 0.02 %의 브롬 페놀, 0.02 %의 크실렌 cyanol)를 추가하고 95 ° C에서 설정 열 블록에 혼합 배치 2 분 후, 즉시 얼음에 튜브를 놓습니다. </li><li> 89 MM 트리스 - 염산, 산도 8.8, 89 MM의 붕산, 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 8 M의 요소를 포함하는 15 % 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔에 샘플을 (10 μL)을로드합니다. 기판 절단 된 제품은 잘 후 분리젤을 실행할 수 있습니다. </li></ol> 2.2. 젤의 영상 <ol><li> 찬란 분류 DNA를 감지하고 기판과 제품의 밴드를 시각화 할 수있는 영상을 사용하여 젤을 검사합니다. </li><li> 영상 젤 후 밴드를 정량화. 몇 가지 배경 분열은 수산화 나트륨 (그림 2A)와 기판 자체의 치료 후 관찰 할 수도 있습니다. 각 반응 생성물의 측정 금액에서 이러한 배경을 뺍니다. </li></ol> 2.3. 데이터 분석 <ol><li> 각 반응 시간 (t) (그림 2B)에 형성된 제품의 양을 플롯합니다. 버스트 (0, y 절편) 및 선형 정상 상태 상 (V SS)의 기울기의 크기를 결정하기 위해 식 1을 사용하여 원시 데이터를 분석합니다. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> 줄거리효소의 활성 분획의 측정을 제공, y 절편 총 단백질 농도 (그림 2C 즉, 명백한 효소 농도)을 기준. 활성 효소의 비율을 결정하기위한 보정 계수를 제공하는 제로 절편과 선형 피팅을 사용합니다. </li><li> 제품의 해리 속도 상수 제공하는 활성 효소의 농도 (그림 2D)를 기준으로 정상 상태 속도 플롯 (적합 선 즉 기울기). </li></ol> 3. 전 정상 상태 시간 코스의 측정 그림 2, 버스트 단계에서 제품의 형성에 표시하는 설명서를 혼합하고 냉각에 의해 측정하기에는 너무 빠릅니다. 따라서, 빠른 급냉 흐름 악기 밀리 초 시간 간격 (그림 3) 5에서 발생하는 빠른 반응을 측정 할 수있는 강력한 방법을 제공 할 수 있습니다. 기기는 급속하게 혼합하는 컴퓨터 제어 드라이브 모터를 사용ND는 특정 반응 시간 후 반응을 끄다. 예를 들어, 초기 버스트 위상과 OGG1에 의해 촉매 제품의 형성 이후 정상 상태 위상을 측정하는 Kintek RQF-3 빠른 담금질 - 흐름 악기를 사용합니다. 빠른 담금질 유량 계측기는 여러 제조 업체에서 사용할 수 있습니다. 3.1. 시료의 준비 별도로 2-1에서 설명한대로 1.5 ML 튜브에 DNA 기판 및 OGG1 솔루션을 준비합니다. DNA와 활성 OGG1의 농도는 각각 400 nm의 80 nm의 수 있습니다. 최종 200 nm의 DNA의 농도 및 40 nm의 혼합 1시 1분 (V / V)의 활성 OGG1이 발생합니다. 3.2. 빠른 담금질 흐름 악기 준비 <ol><li> 온도 제어를위한 빠른 담금질 흐름 악기 (37 ° C)에 순환 물 목욕을 연결합니다. </li><li> 기기의 매개 변수를 조정하고 원하는 시간에 적절한 반응 루프를 선택하면 제조업체의 지시에 따라 포인트화 :. 반응 루프는 다른 반응 시간을 제공하기 위해 변수의 길이입니다. </li><li> 반응 버퍼를 준비하고 NaOH를 10 ML 루어 잠금 일회용 주사기에 솔루션을 냉각 및 드라이브 포트에이 주사기를 연결하고 반응 버퍼 (주사기 B) 및 142 mM의 수산화 나트륨 (주사기 Q) (LOAD 위치에 주사기 부하 밸브)로 드라이브 저수지를로드 . 주사기에서 공기 방울을 제거하려면 여러 번 앞뒤로 솔루션을 작동합니다. </li><li> 스테퍼 모터를 내리고 그것을 접촉 주사기의 상단 (FIRE 위치에 주사기로드 밸브 및 샘플 부하 밸브)까지. </li><li> 샘플 루프, 반응 루프, 물과 메탄올 종료 선을 세척하십시오. 완전히 플러시 지역 (FLUSH 위치에서 밸브) 건조. </li></ol> 3.3. 전 정상 상태 시간 코스 <ol><li> 16 게이지 바늘을 사용 덮인 1.5 ML 튜브의 상단에 구멍을 만든다. 침묵 반응을 수집하는 출구 라인에 튜브를 연결합니다. </li><li> 원하는 reactio을 설정키패드를 사용하여 해당 시간 (초)입니다. 일정 급냉 볼륨을 유지하기로 스테퍼 모터, 그래서 루프 볼륨을 조정하는 백업합니다. 드라이브 포트에 부착 된 일회용 주사기로 버퍼를 추가하여 스테퍼 모터 플랫폼에 주사기 B에 대한 위치 플런저. </li><li> DNA 기판에 1 ML 루어 잠금 일회용 주사기 및 OGG1 솔루션, 각각 (LOAD 위치에 샘플 밸브)를 입력합니다. 샘플로드 포트의 각 DNA 기판 및 OGG1 솔루션과 주사기를 연결하고 (LOAD 위치에 샘플 부하 밸브)는 각각 DNA 기판 및 OGG1 솔루션 샘플 루프를 입력합니다. </li><li> 화재 위치로 모든 주사기로드 밸브 및 샘플로드 밸브를 설정합니다. 키패드 치기 ( &quot;G&quot;또는 &quot;START&quot;키의 예를 누름)하여 반응을 시작합니다. DNA 기판 및 OGG1 솔루션 (18 μL 각각) 즉시 반응 루프에 혼합한다. </li><li> 반응이 자동으로 R의 36 μl를 혼합하여 원하는 반응 시간에 소멸 될 때까지 기다립니다142 밀리미터의 NaOH 86 μL와 eaction 혼합물. 냉각 반응 후, 샘플은 출구 줄에서 배출된다. </li><li> LOAD 위치와 FLUSH 위치에 샘플로드 밸브에 주사기로드 밸브를 설정합니다. 샘플 루프, 반응 루프, 물과 메탄올 종료 선을 세척하고 3.2에 설명 된대로 건조. 각 시점에 대해 위의 절차를 반복합니다. </li><li> 수동으로 또는 급속 급냉 장비로 수행 할 수있는 백그라운드 교정을 결정하는 효소가없는 컨트롤 실험을 수행 할 수 있습니다. 급속 급냉 장비와 제어를 수행하기 위해 DNA 기판에 DNA의 샘플 루프를 채울하지만 OGG1 빈에 대한 샘플 루프를 유지합니다. 반응 시간을 설정, 혼합 된 작업을 수행하고 3.3.4-3.3.6에 설명 끄다. </li><li> 2 M NaOH를 2 M 염산, 물 및 메탄올로 샘플 루프와 반응 루프를 세척하고 세척 선을 건조. 홈 위치로 스테퍼 모터를 설정 한 후,로드 positio에 주사기로드 밸브를 전환n과 물 드라이브 저수지를 씻는다. </li><li> 그 침묵 반응 열을 샘플 및 2.1에 설명 된대로 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동을 변성 15 % 별도의 기판과 제품 DNA를 취급합니다. </li><li> 시각화 및 2.2에 설명 된대로 젤의 밴드를 정량화. </li></ol> 3.4. 데이터 분석 일정 1 차 속도 (K OBS), 버스트 (0)의 크기를 제공하는 상승 지수 및 선형 조건 (식 2)와 식을 비선형 회귀 분석하여 제품 형성의 시간 과정에 맞게, 그리고 선형 속도 (V SS). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. 단일 회전율 시간 코스 <ol><li> 2-1에서 설명한대로 별도의 1.5 ML 튜브에 DNA 기판 및 OGG1를 준비합니다. 농도DNA와 활성 OGG1의 화 :은 각각 100 nm의 500 nm의이다;이 금리 혼합 1시 1분 (v / v)의 후 50 nm의 DNA와 250 nm의 OGG1의 최종 농도. </li><li> 빠른 담금질 흐름 악기를 준비하고 3.2 및 3.3에 설명 된대로 반응 샘플을 준비합니다. </li><li> 열을 냉각 된 반응 샘플을 처리하고 2.1에 설명 된대로 15 %가 별도의 기판과 제품 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동을 변성 그들을 변경 될 수 있습니다. </li><li> 시각화 및 2.2에 설명 된대로 젤의 밴드를 정량화. </li><li> 식 3에 주어진 1 차 속도 상수 (K OBS)을 결정하는 하나의 지수로 제품 형성의 시간 코스를 맞 춥니 다. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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운동 방법은 초등학교 운동 상수를 정의하는 방법을 설명 여기에 설명. 제품 형성의 시간 코스의 첫 번째 효소 매출이 빠르게 발생과 이상성 경우, 화학 후 단계 이후의 촉매 턴 오버 중에 속도 제한됩니다. OGG1의 경우, 최초의 회전율도 (S &lt;E) 또는 (S&gt; E 높음) DNA의 농도를 제한하는 높은 효소 농도를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 첫 번째 경우, 반응은 &#39;단일 매출&#39;로 제한되며 효소의 활성 부위에 촉매 속도 측정을 제공합니다. 후자의 경우, 여러 효소 회전율을 평가한다. 이후 회전율이 촉매 순환을 제한 단계의 측정을 제공하면서 첫 매출 중 발생하는 제품 형성의 버스트는 효소의 활성 부위에 화학 이벤트의 측정을 제공합니다. 또한, 제품 형성의 버스트의 진폭은 적극적으로 관여 효소의 측정을 제공합니다. 이것은 정상 상태 속도 (K 오프 = V SS / E)에서 지속적인 제품의 해리 속도를 계산하기 위해 알고 있어야합니다...

호기성 환경 게놈 불안정성을 서둘러. 산화 스트레스로 인한 주요 promutagenic DNA 병변은 7,8 - 디 하이드로-8-oxoguanine (8 oxoG)입니다. 이 8 oxoG의 모호한 코딩 가능성 때문이다. 인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 8 oxoG의 기본 절단 복구를 시작 책임이 있습니다. OGG1의 glycosylase 활동 apurinic 사이트 (AP 현장)과 제품 DNA의 결과로 8 oxoG베이스 소비세. OGG1의 약한 분해 효소 활동은 어떤 경우에 AP-사이트를 절개 할 수 있습니다. DNA의 glycosylases의 운동 특성은 일반적으로 그들이 이상성 시간 과정을 나타내는 것을 발견. 제품 형성의 초기 빠른 단계 (즉, 버스트) 한 후, 선형 정상 상태 위상은 1-3 관찰된다. 이 동작은 가시 반면, 화학 (즉, 구조적 변화 또는 제품 릴리스) 시간 코스의 직선 부분을 진행하는 동안 속도 제한되고 다음 단계의 지표입니다종종 과도 단계로 불리는 세인트 단계, 반응의 첫 번째주기 동안 효소 활성 부위의 제품 형성에 해당합니다. 제품 출시가 정상 상태 단계 속도 제한되면 활동 측정 제품 DNA 결합력의 질적 측정을 제공하지만, 효소 활성 부위 (즉, 화학)에서 이벤트에 관한 운동 정보를 제공하지 않습니다. 따라서, 지수 전 정상 상태 버스트 위상을 분리하고 측정하는 방법은 효소의 활성 사이트 4에서 처음 효소 매출액 동안 이벤트를 조사하기 위해 필요합니다. (1) 정상 상태 (2) 전 정상 상태, (3) 단일 매출 OGG1의 촉매 동작을 특징 짓는 세 가지 표준 운동 방법이 있습니다. 이러한 방법은 반응 혼합물에있는 효소의 농도와 각 방법의 활용 기판의 비 효소 서로 다릅니다. 일반적으로 정상 상태 접근,때로는 여러 회전율 반응 속도라고도 효소의 낮은 농도는 제품의 형성을 따라하는 데 사용됩니다. 여러 효소 회전율이 크게 기질 농도에 영향을주지 않도록 기질 농도가 크게 효소 농도를 초과합니다. 이 상황에서, 시간 코스는 직선이어야하며, 그 폭발이 방법에 사용되는 낮은 효소 농도에 의한 최초의 매출액 동안 발생했는지 여부를 식별하는 것이 어려운, 참고 버스트 진폭이 효소의 농도에 해당합니다. 이 높은 효소 농도를 사용하여 첫 번째 효소 매출이 빠르게 발생 여부를 감지하는 시간 제로에 선형 시간 과정을 외삽하여 극복 할 수 있습니다. 좌표에 절편 (y 축)은 효소 농도에 비례 적극적으로 기판 종사하는 효소의 측정을 제공합니다. 이 방법은 원칙적으로 버스트 위상의 존재에 대한 증거, DIF를 제공 할 수 있지만,ferent 접근 방식은 버스트 단계의 반응 속도를 측정하기 위해 필요합니다. 많은 경우에 버스트 위상은 수동 혼합 및 냉각 기술로 측정하기에는 너무 빠릅니다. 이 상황에서, 이전 정상 상태 및 단일 매출 운동 (즉, 일시적인 운동)은 종종 반응을 5 초 시점을 따라 급속 혼합 및 냉각 장비를 필요로 접근한다. 전 정상 상태 접근 방식 효소의 높은 농도는 제품의 상당한 양의 첫 매출이 형성되도록 사용됩니다. 여러 개의 턴 오버가 촉매 순환 (즉, 버스트를 다음과 선형 위상) 관찰하기 위해 다음되기 때문에, 기질 농도는 효소 농도 ([효소] &lt;[기질])보다 큽니다. 촉매 순환하지 않고 효소의 활성 사이트에서 이벤트를 분리하려면 단일 매출 조건을 활용하고 있습니다. 이 경우, 기판은 기판의 내가 참여 할 수 있도록 (E &gt;&gt; S) 효소 포화N &#39;단일 매출&#39;과는 일반적으로 단일 지수 시간 경과를 전시 할 예정이다. 버스트 위상, 제품 릴리스 (K 오프) 전시 효소에 대해 위에서 언급 한 바와 같이 종종 시간 코스의 정상 상태 단계의 속도를 제한합니다. 제품 출시 (V SS, 진한. / 시간)의 비율은 선형 정상 상태 위상의 기울기에서 확인할 수 있습니다. 활성 효소의 농도 (E)는 일정한 고유 속도로 제품 릴리스의 속도를 변환하는 데 필요한 곳에 K 오프 = V SS / [E]. 중요한 것은, 활성 효소 농도는 불순물에 의한 측정 단백질 농도, 비활성 효소, 효소가 아닌 생산적으로 기판에 바인딩 단백질 농도를 결정하는 데 사용하는 방법보다 일반적으로 낮다. 제품 출시 속도가 느린 경우 활성 효소 농도는 버스트 진폭에서 확인할 수 있습니다. 따라서,에 대한 정상 상태 시간 과정을 외삽시간 제로 관찰 된 정상 상태 속도에서 K 오프 (제품 출시)를 계산하는 데 필요한 활성 효소의 견적을 제공합니다. 버스트의 반응 속도를 측정하기 위해, 사전에 정상 상태 방법은 선형 안정 상태 단계 이전에 발생하는 첫 번째 매출 중 제품의 형성을 따를 필요가있다. 버스트 속도론은 효소 제품 중간의 형성을 다음과 같습니다. 반응이 기판과 혼합 효소에 의해 시작하면 반응이 정상 상태 단계에 도달 할 때까지, 효소 제품의 양이 급격히 증가합니다. 촉매 훨씬 더 빠른 제품 출시보다는 더 많은 것 인 경우에, 버스트의 진폭은 가정 제품 기판의 화학 변환의 속도에 해당하는 평형에 적극적으로 관여 효소와 관찰 지수 방식 (K OBS)와 동일합니다 그 반대 비율 화학 무시할 수 있습니다. 어떤 경우에는 촉매 CY에서집착은 화학 제품 출시 가격의 진폭은 유의 한 차이가없는 경우로 사전에 정상 상태 분석을 방해합니다. 이 경우, 기판에 과도한 효소 상대를 채용하는 것은 하나의 회전율 효소 결합 촉매 순환 및 제한 기판을 방지 할 수 있습니다. 1 차 속도 상수 (K OBS)로 따라서, 반응의 첫 번째 화학적 단계는 분리 할 수 있으며 정확하게 결정했다. 일정이 비율은 OBS K 유사한 위에서 설명한 사전 정상 상태 접근법을 결정해야한다. 여기에서 우리는이 운동 방법은 OGG1의 glycosylase 활동을 분석하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>5'-6-FAM 표지된 올리고뉴클레오티드도 단일 8-oxoG</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>5'-P32 방사성 표지 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔 정제 등급이 권장됩니다. </td></tr><tr><td>비표지 올리고뉴클레오티드(상보적 가닥)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>폴리아크릴아미드 겔 정제 등급이 권장됩니다. </td></tr><tr><td>1ml BD Luer Lock 일회용 주사기</td><td>BD Medical</td><td>309628</td><td>다른 공급업체의 Lue Lock 일회용 주사기도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10ml BD Luer Lock 일회용 주사기</td><td>BE Medical</td><td>309604</td><td>다른 공급업체의 Luer Lock 일회용 주사기도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Circulating water bath</td><td>모든 벤더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td><td>KinTek Corporation</td><td></td><td>Rapid Quench-Flow Instrument도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr>다른 공급업체의 <td>Typhoon PhosphorImager 8600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td>Imager도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna의 glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 DNA에서 돌연변이 산화 DNA 병변 8 - 옥소-7 ,8-dihydroguanine (8 oxoG를) 소비세. OGG1의 운동 특성은 8 oxoG 절단 및 제품 릴리스의 속도를 측정하기 위해 실시된다. OGG1 농도가 기질 DNA보다 낮은 경우, 제품 형성의 시간 코스는 이상성이다, 제품 형성의 급속한 지수 단계 (즉 버스트) 선형 안정 상태 단계가옵니다. 제품 형성의 초기 버스트가 제대로 기판에 종사하는 효소의 농도에 해당하고 버스트 진폭은 효소의 농도에 따라 달라집니다. 버스트의 정수 1 차 비율은 8 oxoG 절단의 고유 속도에 대응하고 느린 정상 상태의 속도는 제품 릴리스 (일정한 제품 DNA 분리 속도, K 해제)의 속도를 측정합니다. 여기, 우리는 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 접근법 SP를 분리하고 측정하는 기술OGG1 촉매 순환하는 동안 ecific 단계. 형광 표지 병변을 포함하는 올리고 뉴클레오티드 및 정제 OGG1은 정확한 운동 측정을 용이하게하기 위해 사용됩니다. 낮은 효소 농도가 정상 상태 측정, 반응 시약의 혼합 수동 및 냉각을 만드는 데 사용되기 때문에 정상 상태 속도 (K 해제) 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 또한, 시간 제로의 좌표에 점으로 정상 상태 속도의 추정 제품 형성의 버스트는 첫 번째 회전율 (즉, y 절편이 양수) 동안 발생했음을 나타냅니다. 지수 버스트 위상 상수 1 차 속도는 정상 상태 단계 전에 짧은 시간 간격 (&lt;1 초)에 형성된 제품의 양을 검사하고 8의 비율에 해당하는 빠른 혼합 및 냉각 기술을 사용하여 측정 할 수있다 - oxoG 절제 (즉, 화학). 촉매 순환이 어디에 화학적 단계는 단일 매출 방식을 사용하여 측정 할 수있다효소 (E&gt; S)과 포화 기판 DNA에 의해 못했습니다. 이 방법은 DNA 병변의 제거 효율에 영향을 미치는 초등학교 속도 상수를 측정 할 수 있습니다.

정상 상태 운동 분석은 브래드 포드 단백질 분석이 결정에 따라 200 nm의 DNA 기판 및 OGG1의 네 가지 명백한 농도 (15, 30, 45, 60 nm의)를 사용하여 수행되었다. 제품 형성의 시간 코스는 2.2이었다 y 절편, 11, 15, 각각의 단백질 농도 (그림 2B)에 비해 각각 26 nm의, 결정하는 선형 방정식 맞게되었다. Y-차단은 더욱 각 실제 단백질 농도 (그림 2C)를 기준으로 꾸몄다되었다. 활성 효소의 비율은 그림 2C에서 직선의 기울기에서 38 %로 결정 하였다. 정상 상태 속도, 그림 2B의 선형 적합으로 결정 V SS를 확인하려면 Y-차단합니다 (그림 2D)를 기준으로 꾸몄다되었다. 그림 2D에서 직선의 기울기는 일정 해리 속도에 해당하는 0.0028 초 <su...

8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

다음 실험의 전반적인 목적은 신속한 반응 속도론적 기법을 사용하여 인간 eight OXO Guine DNA glycosylate의 eight OXO Guine 절단 및 생성물 방출 속도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 낮은 효소 농도에서 정상 상태 시간 경과를 측정하여 첫 번째 회전(turnover) 동안 신속한 단계가 발생하는지 확인 함으로써 달성됩니다. 만약 첫 번째 회전이 신속하게 일어난다면, 정상 상태 시간 경과는 0으로 외삽되지 않으며, 대신 두 번째 단계로서 활성 효소 농도를 반영하게 됩니다.전정상 상태(pre steady state) 동안의 생성물 형성 속도는 효소 농도를 높인 급속 혼합 및 퀜칭(quenching) 기술을 통해 측정하여 첫 번째 회전(turnover) 동안 상당한 양의 생성물을 관찰할 수 있습니다. 다음으로, 기질이 효소로 포화된 단일 회전 조건에서 화학적 단계를 모니터링할 수 있습니다. 촉매 사이클링 없이 효소의 활성 부위에서 일어나는 사건들을 분리하기 위해 분석한 결과, 시간 경과에 따른 생성물 양이 0시간에서 0으로 외삽되지 않는다는 관찰 내용을 바탕으로 정상 상태 동안 효소로부터의 생성물 방출이 속도 결정 단계임을 보여줍니다.이 방법은 DNA 립 수리(lip repair) 분야의 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 DNA 구조의 영향, 활성 부위 잔기의 역할, 금속 이온의 효과, 그리고 세포 보조 단백질이 화학 반응 및 생성물 방출에 미치는 영향 등이 포함됩니다. 먼저, 1.5 mL 마이크로 퓨지 튜브 내의 어닐링 완충액(annealing buffer)에서 5'-FAM 표지 올리고뉴클레오타이드를 상보적 가닥과 1:1.2 몰 비율로 혼합하여 8개의 OXO G를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 준비하십시오.튜브를 끓는 물 속의 플로트에 넣고 5분 동안 유지합니다. 튜브를 플로트에서 꺼내기 전, 물이 실온까지 천천히 식도록 둡니다. DNA 기질과 OG G1 용액을 각각 반응 버퍼에 준비하여 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 담아 얼음 위에 둡니다.DNA 농도는 400 nM이며, Ogg1의 겉보기 농도는 Bradford 단백질 정량법으로 결정된 30, 60, 90 또는 120 nM임에 유의하십시오. 반응 튜브를 얼음에서 꺼낸 후, 37 °C로 설정된 히트 블록에 튜브를 넣어 각 용액을 1분간 사전 배양합니다. 그다음, DNA 기질과 Ogg1 용액을 동일한 부피로 혼합하여 DNA 최종 농도 200 nM, Ogg1 최종 농도 15, 30, 45 또는 60 nM가 되도록 하여 반응을 시작합니다. 명시된 시간 간격으로 10 µL씩 분취하여 채취하고, 1 M 수산화나트륨 1 µL와 혼합하여 반응을 중단시키며, 이를 시간 경과에 따른 대조군으로 사용합니다.효소가 포함되지 않은 반응 혼합물 10 µL를 1 M 수산화나트륨 1 µL와 혼합합니다. 반응 샘플을 90 °C 가열 블록에 5분 동안 두어 생성된 산물의 AP site를 절단합니다. 가열 후, 각 샘플을 중화시키기 위해 1 M 염산을 1 µL 첨가합니다.그 후, 각 반응 샘플에 12 µL의 겔 로딩 버퍼를 추가하고, 95 °C로 설정된 히팅 블록에 혼합물을 넣습니다. 2분 후, 튜브를 히팅 블록에서 꺼내 얼음 위에 둡니다. 각 샘플 5 µL를 15% 변성 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩합니다.겔 전기영동이 완료되면, 형광 표지된 DNA를 검출할 수 있는 이미저를 사용하여 스캔하고 기질 및 생성물 밴드를 시각화합니다. 겔 이미징 후 밴드를 정량화하며, 수산화나트륨으로 기질을 처리한 후 배경 절단이 관찰되는 경우, 각 반응 생성물의 측정값에서 이 배경값을 뺍니다. 그런 다음, 각 반응 시간별로 생성된 생성물의 양을 그래프로 나타냅니다.다음 식을 사용하여 원시 데이터를 분석함으로써 knot, burst의 진폭 및 선형 정상 상태 단계의 기울기인 VSS를 결정합니다. Y 절편을 총 단백질 농도에 대해 도식화하여 효소의 활성 분율 측정값을 구합니다. Y 절편이 0인 선형 회귀를 사용하여 활성 효소 분율을 결정하기 위한 보정 계수를 산출합니다.그런 다음 활성 효소 농도에 따른 정상 상태를 도식화하여, 두 개의 별도 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 생성물 결합 속도 상수를 제공합니다. 앞서 설명한 대로 반응 버퍼를 사용하여 400 nM DNA 기질과 80 nM 활성 ogg1 용액을 준비합니다. 급속 퀜치 플로우 장치에 순환 수조를 연결하고 온도를 37 °C로 설정합니다.그 다음, 기기 파라미터를 조정하고 원하는 시점에 맞는 적절한 반응 루프를 선택하십시오. 제조사의 지침에 따라 반응 버퍼와 142 수산화나트륨 퀀칭 용액을 준비하십시오. 10 milliliter 루어락 일회용 주사기에 담아 준비합니다.수산화나트륨이 담긴 시린지를 드라이브 포트에 연결하고 밸브를 로드 위치로 설정하십시오. 시린지 Q의 수산화나트륨으로 드라이브 리저버를 채워 시린지 내의 기포를 제거하십시오. 용액을 여러 번 앞뒤로 밀고 당기며 순환시키십시오.다음으로, 반응 버퍼가 담긴 주사기를 구동 포트에 연결하고 주사기에 버퍼를 충전합니다. B의 경우, 모든 밸브를 fire 위치에 둔 상태에서 스테퍼 모터를 주사기 상단에 닿을 때까지 내립니다. 샘플 로드 밸브를 flush 위치에 두고, 샘플 루프, 반응 루프 및 배출 라인을 물과 메탄올로 세척합니다.그 다음, 공기로 플러싱하여 루프와 배출 라인을 완전히 건조시킵니다. 캡이 닫힌 1.5 milliliter 튜브 상단에 구멍을 냅니다. 16 gauge 바늘을 사용하여 튜브를 튜빙으로 배출 라인에 연결함으로써 퀜칭된 반응물을 수집합니다.다음으로, 키패드를 사용하여 원하는 반응 시간을 초 단위로 설정하십시오. 스테퍼 모터가 후퇴한 후, 드라이브 포트에 부착된 일회용 시린지로 버퍼를 추가하여 시린지 B의 플런저를 스테퍼 모터 플랫폼에 밀착시키십시오.1mL 루어 락 일회용 주사기에 DNA 기질과 ogg one 용액을 각각 채웁니다. 샘플 밸브를 로드 위치에 두고, DNA 기질과 ogg one 용액이 담긴 주사기를 각각의 샘플 로드 포트에 연결한 다음 샘플 루프를 해당 용액들로 채웁니다. 모든 주사기 로드 밸브와 샘플 로드 밸브를 파이어 위치로 설정하고 G 키를 눌러 반응을 시작합니다.G 키를 누르면 스텝 모터가 시린지 상단을 밀어 반응을 시작하고 정지시킵니다. 반응 혼합물 36 µL가 142 mM 수산화나트륨 86 µL로 자동 정지된 후, 배출 라인에서 샘플을 수집합니다.반응이 완료되면 시린지 로드 밸브를 로드 위치로, 시료 로드 밸브를 플러시 위치로 설정하십시오. 시료 루프, 반응 루프 및 배출 라인을 물과 메탄올로 플러시하고 플러시한 영역을 완전히 건조시키십시오. 각 시점마다 이전 단계들을 반복하십시오.배경 보정값을 결정하기 위해, 신속 퀀칭 장치를 사용하여 효소 없이 대조군 실험을 수행합니다. DNA 샘플 루프는 DNA 기질로 채우되, ogg 샘플 루프 하나는 비워 둡니다.반응 시간을 설정합니다. 이전과 동일한 조건으로 혼합 및 퀜칭을 수행합니다. 샘플 루프를 2 M 수산화나트륨, 2 M 염산 수용액 및 메탄올로 세척한 후, 세척된 라인을 건조합니다.스테퍼 모터를 홈 위치로 설정한 후, 시린지 로드 밸브를 로드 위치로 전환하고 드라이브 리저버를 물로 세척합니다. 급냉시킨 반응 시료를 가열한 후, 15% 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 기질 및 생성물 DNA를 분리합니다. 그런 다음 설명된 대로 겔 상의 밴드를 시각화하고 정량화합니다.이전에 비선형 회귀 분석을 통해 생성물 형성의 시간 경과를 상승 지수 항과 선형 항이 포함된 다음 방정식에 맞추어, 관찰된 1차 속도 상수 K, burst의 진폭, knot 및 선형 속도 VSS를 구하였습니다. 단일 회전 시간 경과 실험을 위해, 100 nM DNA 기질과 500 nM 활성 ogg1 용액을 각각 별도의 1.5 mL 튜브에 준비합니다.앞서 설명한 조건들을 사용하여 급속 퀜치 플로우(rapid quench flow) 장치를 준비하고, 전-정상 상태(pre steady state) 시간 경과 실험과 동일한 방식으로 반응을 수행합니다. 퀜치된 시료를 가열하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리한 후, 앞서 설명한 대로 겔 상의 밴드를 시각화하고 정량화합니다. 마지막으로, 생성물 형성의 시간 경과 데이터를 단일 지수 함수에 피팅하여 다음 방정식에 제시된 1차 속도 상수를 결정합니다.200 nanomolar의 DNA 기질과 네 가지 서로 다른 농도의 ogg를 사용하여 정상 상태 반응 속도론 분석을 수행하였습니다. 농도는 Bradford 단백질 정량법으로 결정하였습니다. 절단된 생성물과 절단되지 않은 기질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였습니다.생성물 형성의 시간 경과 곡선을 선형 방정식에 맞추어 y절편을 결정하였으며, 각 단백질 농도 대비 y절편은 각각 2.2, 1115, 26 nanomolar였습니다. 이 Y절편들을 실제 단백질 농도에 대비하여 다시 도식화하였습니다. 활성 효소의 분율은 정상 상태 속도를 결정하기 위한 직선의 기울기로부터 38%로 결정되었습니다. 이전에 결정된 VSS 값들을 Y절편에 대비하여 도식화하였습니다.직선의 기울기는 초당 0.0028이었으며, 이는 DNA Glycosylate liaise 활성에 의해 형성된 생성물의 해리 속도 상수에 해당합니다. 200 nM의 DNA 기질과 40 nM의 활성 OG one을 사용하여 정상 상태 이전의 시간 경과를 추적하였습니다. 생성물 형성의 시간 경과는 상승 지수 항과 선형 항이 포함된 방정식에 맞추어 피팅할 수 있습니다.Kay observed와 koff는 각각 0.75 및 0.0055 per second로 결정되었습니다. 단일 턴오버 조건에서, 여덟 번째 Oxo g 절제 반응은 6초 이내에 완료되었습니다. 생성물 형성의 시간 경과는 단일 지수 방정식에 적합되었으며, 0.74 per second의 K observed 값을 나타냈습니다.이 영상을 시청하고 나면, 촉매 사이클링 중의 핵심 단계를 분리하고 화학 반응 및 효소 회전율(turnover rate)을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

Msh2 - Msh6는 DNA의 복제 오류의 복구를 시작 책임이 있습니다. 여기 우리는이 중요한 단백질의 작동 방식 이해 향해 과도 속도론의 접근 방식을 제시한다. 보고서는 결합된 DNA 바인딩과 DNA 수리의 행동의 Msh2 - Msh6 메커니즘을 기본 ATPase의 속도론을 측정하는 정지 흐름 실험을 보여줍니다.

DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

박테리오파지 T7의 복제 단백질을 사용하여 지연 가닥 시작의 동역학을 조사하기 위해 민감한 겔 기반 불연속 분석법을 설명합니다.

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론<em&gt; 체외</em&gt;는 박테리오파지 T7 복제 단백질에 의해

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.

현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

배우세요 8-oxoguanine DNA glycosylase의 글리코실레이스 활동을 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 조건에서 측정하는 방법을. 퀜치 플로우 기법과 급격한 동역학 기술을 사용하여 효소 활성을 분석합니다.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

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