Name: 역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 배우세요 미세 유체 온칩 캡처-고리화 반응을 이용하여 소분자와 기능화된 나노입자를 센서 칩 표면에 빠르고 가역적으로 고정하는 방법을. 이 기술은 표면 플라즈몬 공명 연구에서 생체 분자 상호작용 분석의 응용 범위를 확장합니다.

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우리는 NIH (NHLBI 계약 번호 HHSN268201000044C이, SH 및 SYS를 RW하는)에서 자금을 인정합니다.

1. GST 및 나노 입자 (NP) 결합체의 제조 <ol><li> GST-TCO 준비 : <ol><li> GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 100 μL로 TCO-NHS 솔루션의 8 μL (DMSO에 50 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어. </li><li> Zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거합니다. GST-TCO 복합체를 포함하는 복구 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다. </li></ol></li><li> GST-는 TZ 준비 : <ol><li> GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 75 μL에 TZ-NHS 용액을 6 μL (DMF 25 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어. </li><li> PBS 25 μL로 반응 혼합물을 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제. GST-는 TZ 접합체를 포함하는 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다. </li></ol> 참고 : 질량 분석 (MALDI-TOF)이 평균 10 ~ Tz 일 또는 TCO 분자가 GST에 접합 된 것으로 나타났다. </li><li> NP-TCO 준비 : <ol><li> 에 TCO-NHS 용액 100 μL (DMSO에 50 mm)를 추가150 아미 노화 나노 입자 (NP-NH 2, PBS에 8.7 밀리그램 철 / ㎖, 3 nm의 철심 ~ 8,000 페 / NP)의 μL와 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어. </li><li> PBS 버퍼로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 과잉 시약을 제거합니다. NP-TCO 제품을 포함하는 컬러 밴드를 수집합니다. </li><li> 원심 분리 필터 장치 (100 K MWCO)를 이용하여 ~ 150 μL의 최종 부피로 여과 액을 농축. </li><li> NP-TCO 용액에 숙신산 무수물 50 μL, (DMSO 중 0.1 M)를 첨가하고 1 시간 동안 RT에서 동요 (무수물 단자 카르 복실 산을 형성하기 위해 남아있는 아민들과 반응한다.이 덱스 트란 표면에 비특이적 상호 작용을 방지한다). </li><li> PBS로 용출 NAP-10 컬럼을 사용하여 NP-TCO 생성물을 정제 하였다. 사용하기 전에 4 ° C에서 NP-TCO의 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li></ol> 2. 표면 처리 모든 표면 플라즈몬 공명 분석법에 비아 코어 T100 악기 (GE 헬스 케어)에서 수행됩니다25 ° C는 실행 버퍼로 CM5 센서 칩과 PBS-P를 사용하여 별도의 언급이없는 한. 악기와 함께 제공되는 비아 코어 제어 및 평가 소프트웨어는 실험을 설정하고 데이터를 분석에 이용된다. 두 가지 동작 모드, 응용 프로그램 마법사 및 수동 실행은 표면 처리 및 모니터링 온칩 캡처 - 사이클로 사용됩니다. 방법 빌더 모드는 역방향 방향 결합 실험을 설치와 고리 화 반응 속도를 측정하는데 사용된다. 데이터를 두 번 참조 감산 및 운동 분석이 1:1 랭 뮤어 결합 모델을 사용하여 수행됩니다. <ol><li> 흐름 세포에 아민 고정화 마법사 템플릿을 선택 고정 1 (참조), 2 (검출)를 사용합니다. 0.4 M EDC의 1:1 용액을 주입하여 표면 카르 복실 그룹을 활성화하는 방법을 수정 아민 : 480 초 동안 0.1 M NHS를 10 μL / 분의 유속. 에서 420 초 접촉 시간에 남아있는 활성 에스테르를 해소하기 위해 에탄올의 주입을 설​​정10 μL / 분의 유속. </li><li> 입력 리간드 이름, 항-GST (아세테이트 완충액, pH 5.0으로 18 μg / ㎖) 및 10 μL / 분의 유속으로 420 초 접촉 시간 동안 주입 세트. </li><li> 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 시약 랙 2에 필요한 솔루션 튜브를 놓습니다. 저장 및 고정화를 시작합니다. 참고 : ~ 14,000 17,000 RU의 범위에서 안티 GST 고정화 수준에서이 방식으로 결과에 고정화 마법사를 실행합니다. </li><li> 참고 흐름 전지 (1)에 5 μL / 분에서 420 초 (20 ㎍ / ml) 용액을 GST 리간드를 주입​​하는 고정 마법사를 편집합니다. </li></ol> 3. 기능화 분자의 모니터링에 칩 캡처 - 사이클로 <ol><li> 온칩 실시간으로 캡처 - 사이클로 (그림 2) 모니터링. <ol><li> GST-TCO (20 ㎍ / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 사람을 선택연간 실행 방법은 5 μL / 분으로 유량을 설정하고 셀 2 흐름 경로를 흐른다. </li><li> 420 초 동안 GST-TCO의 솔루션을 주입한다. </li><li> 600 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다. </li><li> 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생. </li></ol></li><li> 리얼 타임 (그림 3)의 다 성분 구조의 온 - 칩 어셈블리를 모니터링 : <ol><li> GST-Tz 일 (20 ㎍ / ㎖), NP-TCO (100 μg 철 / ㎖), TZ-BnNH 2 (10 μM) 및 재생 (10 mM의 글리신, pH가 2.0) 시약 랙 2 솔루션 튜브를 놓습니다. 악기 수동 운전 방법을 선택, 셀 2 흐름에 5 μL / 분 유로에 유량을 설정합니다. </li><li> 60 초 동안 GST-Tz 일의 용액을 주입한다. </li><li> 60 초 동안 NP-TCO의 솔루션을 주입. </li><li> 60 초 동안 TZ-BnNH 2 용액을 주입한다. </li><li> 재생 용액의 두 개의 30 초 주사하여 표면을 재생. </li></ol></li></ol> 4. 엠사이클로 환율의 고정화 밀도 및 결정을 onitoring <ol><li> 작은 분자 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성. <ol><li> 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 새로운 단계로 이름 샘플을 만들 수 있습니다. 목적을 설정하고 샘플에 기본 설정을 연결합니다. </li><li> 사이클 유형 패널에서 새로운 사이클 단계를 작성하고 다음 명령을 삽입, 캡처, 샘플, 재생 1과 재생 2. </li><li> 캡처 명령을 선택, 입력 리간드 이름 (GST-TCO, 20 ㎍ / ㎖) 5 μL / 분으로 설정 유로의 접촉 시간 120 초 : 초. 샘플 명령을 선택, 입력 180 초 접촉 시간, 60 초 해리 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로 : 양쪽 모두. 재생 1 명령을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생이 명령에 대해 동일한 작업을 반복합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 선택 및 분석 솔루션 (TZ-BnNH 2) 농도 시리즈 (0.3 ~ 10 μM 1:2 희석)와 샘플 목록을 입력합니다. 위치 패널 랙 옆에 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다. </li></ol></li><li> NP 고리 화 반응 속도 (그림 4)의 특성. <ol><li> 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 다음 매개 변수를 변경합니다. [캡처] 패널을 선택, GST-Tz 일, 20 ㎍ / ㎖의로 변경 리간드 이름입니다. 견본 패널을 선택, 변화의 접촉 시간 120 초 접촉 시간 및 분리 시간 120 초에. </li><li> 샘플 목록을 선택, NP-TCO 및 농도 시리즈 (7 nm의 224에 1:2 희석)에 분석을 변경할 수 있습니다. 시약 랙에 배치 솔루션 유리 병2와 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하는 96 - 웰 플레이트에 희석 시리즈. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 데이터 바인딩 및 운동 분석은 그림 4에 나타내었다. </li></ol></li></ol> 5. 고정화 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정 반전 지향 결합 연구는 고정 된 리간드와 분석 및 복합 AP1497 (그림 5)로 FKBP12를 사용합니다. 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이 분석의 일반적인 방법은 설정되어 있습니다 : <ol><li> 새로운 방법 및 입력 일반 매개 변수를 선택합니다. 분석 단계 패널에서 생성하고 이름을 캡처, 샘플 및 재생 단계. 해당 목적을 선택하고 기본 설정을 연결합니다. </li><li> 사이클 종류의 패널을 선택하고 3주기 단계 생성 : 캡처, 샘플 및 재생을. </li><li> 캡처주기 단계에서 두 번 캡처 명령을 삽입합니다. variabl로 캡처 한 패널을 선택 캡처 솔루션을 선택둘째, 전자, 5 / 분 μL 및 설정 유로의 유량으로 접촉 시간을 300 초로 설정합니다. 둘째로 5 μL / 분으로 설정 유로의 유량으로 250 초에 접촉 시간을 설정 변수로 캡처 2 패널 선택 캡처 솔루션을 선택합니다. </li><li> 샘플주기 단계에서 샘플 명령을 삽입합니다. 견본 패널을 선택, 60 초에 설정 접촉 시간, 30 μL / 분의 유량으로 설정 유로에서 200 초에 분리 시간 : 양쪽 모두. </li><li> 재생주기 단계에서 두 번 재생 명령을 삽입합니다. 재생 1 패널을 선택, 입력 재생 용액 이름 (10 mM의 글리신 - 염산의 pH 2.0), 30 μL / 분으로 설정 유로에서 30 초 접촉 시간 : 초. 재생 2 패널에 대해 동일한 작업을 반복합니다. </li><li> 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음 입력 캡처 솔루션 이름 (GST-TCO와 AP1497-Tz 일), 샘플 이름 (FKBP12), 농도 시리즈 (0.020-5 ㎍ / ㎖의 1:2 희석)와 MW (13,000)을 선택합니다. R의 장소 솔루션 유리 병96 - 웰 플레이트에 eagent 랙 2 희석 시리즈는 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다. </li></ol> 6. 고정화 된 국민 연금 첨부 AP1497에 FKBP12의 결합을 측정 나노 입자의 고정화, 작은 분자 유도체 및 FKBP12 결합 분석을위한 일반적인 방법은 셋업하는 방법 작성 도구를 사용하여 다음과 같이 <ol><li> 위의 저장 방법 서식 파일을 열고 수정합니다. 캡처주기의 단계에 따라 추가 캡처 명령을 삽입합니다. 캡처 한 패널을 선택, 변수 이름 캡처 솔루션 1 (GST-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 60 초에 설정 접촉 시간. 캡처 2 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 2 (NP-TCO)으로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 고정 접촉 시간 5 μL / 분의 유속으로 90 초 및설정 유로로 두 번째. 캡처 3 패널을 선택, 변수 이름을 캡처 솔루션 3 (AP1497-Tz 일)로 캡처 솔루션의 선택을 취소합니다. 5 μL / 분의 유량과 두 번째로 설정 유로에서 180 초까지 설정 접촉 시간. </li><li> 선택 설치 실행과로 설정 유로 : 2-1. 다음을 두 번 선택합니다. 96 - 웰 플레이트에있는 시약 랙 2 희석 시리즈 플레이스 솔루션 유리 병은 콘텐츠 목록과 위치를 일치시켜야하고. 방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 키네틱 분석 데이터는도 5에 나타낸다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 캡처 - 사이클로 방법은 라벨이없는 칩 기반의 상호 작용과 운동 연구에 대한 수정 된 나노 입자와 작은 분자의 빠른 가역적 고정 할 수 있습니다. 고정화 프로토콜 &lt;저분자 리간드 10 μM 농도가 필요한 분에서 수행 될 수있다. 리간드 농도 및 접촉 시간 고정화 밀도를 변조함으로써 가깝게 제어 할 수있다. 우리의 데이타는 온칩 bioorthogonal 반응 그들의 표적과 상호 작용하는 동일계 기능화 된 나노 입자 또는 고정화 작은 분자의 능력을 보존하는 것을 보여준다. 우리는 또한 낮은 분자량이 작은 분자, (TCO와 Tz 일) 사이에 이분자 사이클로 속도를 특징으로하고 있습니다. 우리는 유사한 분석이 다른 빠른 bioorthogonal 반응의 속도를 측정하고 비교하기 위해 수행 할 수있는 상상. 뒤집을 수있는, 지속적인 흐름 온칩 나노 입자의 고정화 및 원위치 작용 홍보ovides 모든 정화, 고정 및 검사에 대한 여러 ...

효율적인 결합 반응은 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 표면에 생체 활성 분자를 연결하는 중요한 도구입니다. 최근 매우 빠른 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)은 세포 표면, 세포 내 구조, 항체 및 나노 입자를 레이블로 사용 된 1. - 여기에 7, 우리는 표면 플라스 몬 공명 (SPR)의 상호 작용 분석을위한 다 성분 구조의 가역적 인 온 - 칩 합성 항원 / 항체 캡처 (GST / 안티 GST)와 함께 [4 +2] 고리 화 반응을 사용하여 모니터 실시간 프로세스 (그림 1). 새로운 분석의 다양한 리간드의 방향과 밀도를 제어 안정 센서 표면의 결과, 어셈블리로 8,9 특히, 캡처 - 사이클로 전략 수립 프로토콜을 사용하여 표면의 재생을 가능하게한다. 8 형식은 지금 가능합니다. 사용이 전략은 우리는 TCO / TZ-유도 된 작은 분자의 고정화를 설명하고 버퍼 다양한 조건에서 사이클로 속도를 특징. 우리는 직접 고정 된 GST 항원에 부착 할 때 캡처 - 사이클로 전략 목표와 상호 작용하는 작은 분자의 기능을 유지하는지 확인하기 위해 예를 들어 FKBP12 10-12 바인딩 FKBP12 및 분자 AP1497의 잘 알려진 상호 작용을 선택했다 또는 고정 된 나노 입자 공단에. 이 방법은 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 센서 칩에 작은 분자의 가역적 고정이 가능하게되었습니다. 둘째, 작은 분자의 TCO /는 TZ 고정화는 정식 SPR 연구의 방향을 반전 라벨없는 상호 작용의 연구를 가능하게하고, 결합 상호 작용의 상보적인 뷰를 제공 할 수있다. 셋째,이 방법은 대상 나노 입자의 미세 합성, 그들의 bindin의 즉각적인 평가를 가능하게G 속성. 이는 대상 입자를 평가하거나 선별 효율을 향상시키고, 또한 필요한 나노 입자의 양을 감소 약속한다. 넷째 13-15,이 방법은 연속 흐름 하에서 실시간 bioorthogonal 고리 화 반응의 반응 속도를 측정 할 수있다. 마지막으로, TCO /는 TZ 고정화 화학 혈청의 존재하에 강력하다. 이와 함께, 우리는이 다양한 접근 방식은 크게 생체 외 및 생체 내 세포의 응용 프로그램에서의 관련성과 미세 유체 연구의 다양한 안정 센서 표면의 구축을 용이하게 할 것으로 예상.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>센서 칩 CM5</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아민 커플링 키트</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST 캡처 키트</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAP-10 열</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, 동결건조된 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D 시스템</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>계면활성제 P-20</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글리신 2.0</td><td>GE 헬스케어</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K 원심 필터</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synthesized in-house</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synthesized in-house, *Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td>에서 시판할 수 있습니다.<td>사내에서 합성한</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Synthesized in-house, *Commercially Available from Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synthesized in-house</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synthesized in-house</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE 헬스케어</td><td>비아코어 T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

방향과 고정 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 빠른 표면 고정화하는 방법은 바이오 센서 및 마이크로 어레이 응용 프로그램에 매우 바람직하다. 이 연구에서, 우리는 TCO / TZ-유도체 분자의 미세 고정을 가능하게하는 매우 효율적인 공유 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)를 사용 . 우리는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 연속적인 유동 조건에서 실시간으로 프로세스를 모니터링한다. 리버시블 고정화를 활성화 센서 표면의 실험 범위를 확장하기 위해, 우리는 고리 화 반응과 비공유 항원 항체 캡처 컴포넌트를 배합. 교대 센서 표면에 TCO 또는 Tz 일 잔기를 제시함으로써, 다 캡처-사이클로 공정은 다 성분 다양한 구조의 온 - 칩 어셈블리와 상호 작용 연구를 위해 하나의 센서면에 지금은 가능하다. 우리 나작은 분자, FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)를 결합 AP1497, 2 개의 바이오 센서 칩에 다른 고정화 실험으로이 방법을 llustrate과 같은 작은 분자 고정화에 현장 기능화 나노 입자의 일환으로.

데이터 및 수치는 기준 8에서 적응되었습니다. 방향과 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 효율적인 가역 고정 새로운 바이오 센서의 응용 프로그램의 개발에 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. TCO와 Tz 일 사이 빠른 bioorthogonal 반응을 이용하여, 우리는 단계적 어셈블리 및 생물학적 활성의 유지와 리간드 표면의 재생을위한 방법을 설명한다. 2 TZ-BnNH이 고정화의 실시간 모니터링을 나타낸 것이다. GST-TCO의 용액 님 ~ 400 RU 상승의 결과 미리 고정화 된 항-GST 표면 위에 분사된다. TZ-BnNH 2 번째 주사는 응답 빠르고 ~ 15 RU 상승을 보여줍니다. 유도 된 항원의 어떠한 해리는 구조 안정성에 대한 증거를 제공하는 버퍼를 실행으로 전환 한 후 관찰되지 않습니다. 표면은 다수의 캡처-사이클로 사이클을 활성화 사이클의 마지막 단계에서 재생...

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

다음 실험의 전반적인 목적은 센서 칩 표면에 저분자 화합물 및 기능화된 나노입자를 가역적으로 고정화하는 신속하고 일반화 가능한 전략을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 센서 표면에 anti GST 항체를 고정화한 후, 두 번째 단계로 GST 항원을 포획함으로써 달성됩니다.trans-사이클로옥틴(trans-cyclo-octine) 또는 테트라진(tetrazine) 그룹으로 기능화하면, 저분자 테트라진 유도체 또는 이후 저분자 테트라진 유도체로 기능화된 나노입자 트랜스-사이클로옥텐(trans-cyclo-octene) 접합체와의 후속 사이클로 첨가 반응을 위한 반응성 표면이 제공됩니다. 다음으로, 기능화된 표면을 사용하여 원하는 가용성 표적과의 상호작용 분석을 수행할 수 있습니다. 마지막 단계에서 표면을 재생하여 후속 캡처 사이클로 첨가 사이클을 가능하게 합니다. 칩 상의 바이오 직교 반응 결과는 고정화된 저분자 또는 제자리(in situ)로 기능화된 나노입자가 FKBP12 표적과 상호작용하는 능력을 유지함을 보여주며, 이러한 접근 방식이 SPR의 응용 범위를 어떻게 확장할 수 있는지를 설명합니다.이 온칩 캡처 사이클 에디션(on-chip capture cycle edition) 기술의 주요 장점은 배향과 동원 밀도를 조절하면서 소분자를 신속하고 가역적으로 동원할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 캡처 사이클 에디션 과정은 수분 내에 수행될 수 있어 표면 준비 시간을 크게 단축할 수 있으며, 본 절차는 저희 연구실의 학생인 Jason Sandler가 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 DMSO에 녹인 50 mM TCONHS 용액 8 µL를 PBS에 녹인 1 mg/mL GST 용액 100 µL에 첨가하십시오. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 흔들어 섞은 후, Zeba spin 탈염 컬럼을 사용하여 과잉 시약을 제거하십시오.다음으로, DMF에 녹인 25 mM tetra NHS Ester 용액 6 µL를 PBS 내 1 mg/mL GST 용액 75 µL에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 혼합물을 흔들어 섞어줍니다. 반응 혼합물을 25 µL의 PBS로 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제합니다. 그 후, 50 mM T-C-O-N-H-S 용액 100 µL를 방출된 나노입자 용액 150 µL에 첨가하고 이전과 동일한 방식으로 혼합물을 흔들어 섞어줍니다.혼합 후, PBS 버퍼로 평형화된 NAP 10 컬럼을 이용한 젤 여과(gel filtration)를 통해 과량의 시약을 제거합니다. N-P-T-C-O 생성물이 포함된 유색 밴드를 수집합니다.정제된 시료를 분자량 컷오프가 100,000인 원심분리 필터 장치가 포함된 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 원심분리를 통해 시료를 최종 부피 약 150 µL까지 농축합니다. N-P-T-C-O 용액에 DMSO에 녹인 0.1 M cynic anhydride 용액 50 µL를 첨가합니다.혼합물을 실온에서 1시간 동안 흔들어 섞은 후, NAP 10 컬럼을 사용하여 PBS로 용리시켜 N-P-T-C-O 생성물을 정제합니다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 장비를 사용하여 AM 고정화 마법사 템플릿에서 플로우 셀 1과 2의 고정화를 선택합니다. 0.4 M EDC와 0.1 M NHS의 1:1 혼합 용액을 480초 동안 주입하여 표면 카복실기를 활성화하도록 Amin 방법을 수정합니다. 10 µL/min의 유속으로 에탄올아민을 주입하여 잔류 활성 에스테르를 퀀칭(quench)하도록 설정하며, 접촉 시간은 422초, 유속은 10 µL/min로 설정합니다.리간드 이름에 anti GST를 입력하고, 유속 10 µL/min에서 접촉 시간 420초로 주입하도록 설정하십시오. 다음으로, 미리 준비한 솔루션 바이알을 시약 랙 2에 배치하십시오. 파일 이름과 데이터 저장 경로를 지정한 후, 내용 목록과 위치가 일치하는지 확인하십시오.고정화를 시작합니다. 고정화 마법사를 편집하여 참조 플로우 셀 1(reference flow cell one)에 20 µg/mL의 GST 리간드 용액을 5 µL/min의 속도로 420초 동안만 주입하도록 설정하십시오. 이전에 준비한 10 µM TERAZ olaine 용액과 재생 용액이 담긴 G-S-T-T-C-O-A 바이알을 시약 랙 2에 배치하십시오.수동 실행 방법을 선택하고, 유량을 5 µL/min으로, 유로를 flow cell 2로 설정하십시오. G-S-T-T-C-O 용액을 420초 동안 주입한 후, Teraz Benz Lamine 용액을 600초 동안 주입하십시오. 그 다음, 재생 용액을 32초 동안 두 번 주입하여 표면을 재생하십시오.GST TERAZ zine, N-P-T-C-O, teraz Belamine 및 재생 용액 바이알을 시약 랙 2에 배치한 후, 기기의 수동 실행 방법을 선택하고 유속을 5 µL/min으로, 유로를 플로우 셀 2로 설정하십시오. GST Tetra zine 용액을 60초 동안 주입하고, 이어서 N-P-T-C-O 용액을 60초 동안 주입하십시오. 마지막으로, tetras zine belamine 용액을 60초 동안 주입하십시오.완료되면 이전과 동일한 방식으로 표면을 재생성하십시오. 다음으로, 새로운 방법을 선택하고 데이터 수집, 속도 검출, 샘플 챔버, 온도, 농도 단위 및 버퍼 설정을 포함한 일반 매개변수를 입력하십시오. 분석 단계 패널에서 새로운 단계를 생성하고 이름을 sample로 지정하십시오.그 다음 사이클 유형 패널에서 목적과 연결 기반 설정을 샘플로 설정하고, 새로운 사이클 단계를 생성하여 다음 명령들을 삽입하십시오. 샘플 재생 1 및 재생 2를 캡처하십시오. 캡처 명령을 선택하고 리간드로 G-S-T-T-C-O를 입력하십시오.접촉 시간을 120 seconds로, 유속을 분당 5 µL로 설정하십시오. 그리고 유로를 second로 설정하십시오. 그런 다음 샘플 명령을 선택하고 접촉 시간 182 seconds, 해리 시간 62 seconds, 유속 분당 30 µL를 입력한 후 유로를 both로 설정하십시오.그 다음, 재생(regeneration) 명령을 선택하고 재생 용액을 입력합니다. 접촉 시간을 32분으로 설정하고 유량을 30 µL/min으로 지정하며, 유로(flow path)를 두 번째로 설정합니다. 재생을 위해 동일한 절차를 반복합니다.Command select set에서 run을 선택하고 유로를 2-1로 설정합니다. Next를 선택하고 샘플 리스트에 1.5에서 20 µM 농도 범위의 tetra Belamine 분석물 용액을 1:2 희석 시리즈로 채웁니다. 그런 다음 next를 선택하여 랙 위치 패널로 이동합니다.시약 랙 2에 용액 바이알을 배치한 후, 96-웰 플레이트에 희석 시리즈를 배치하십시오. 이때 콘텐츠 목록과 위치가 일치하는지 확인하십시오.방법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작하십시오. 새로운 방법과 일반 파라미터가 선택되면, 분석 단계 패널에서 캡처 샘플 및 재생 단계를 생성하고 이름을 지정하십시오. 그 다음, 해당 목적을 선택하고 기본 설정을 연결하십시오.그 다음 사이클 유형 패널을 선택하고 캡처(Capture), 샘플링(sample), 재생(regeneration)의 세 가지 사이클 단계를 생성합니다. 캡처 사이클 아래에 캡처 명령을 두 번 삽입하십시오.캡처 1 패널에서 단계를 설정하십시오. 변수로 캡처 용액을 선택하십시오. 그런 다음 유속을 5 µL/min으로 하여 접촉 시간을 300초로 설정하고, 캡처 2 패널에서 유로를 두 번째로 설정하십시오.포획 용액(capture solution)을 변수로 선택하십시오. 접촉 시간을 250초로 설정하고 유속은 5 µL/min으로, 유로(flow path)는 두 번째(second)로 설정하십시오. 그다음, 샘플 사이클 단계 아래에 샘플 명령을 삽입하십시오.샘플 패널을 선택하고 접촉 시간을 60 seconds로 설정하십시오. 해리 시간을 200 seconds로, 유속을 30 microliters per minute로 설정하고 유로를 양방향(both)으로 설정하십시오. 재생 주기 단계에서 재생 명령을 두 번 삽입하고, 재생 패널 1을 선택한 후 재생 용액을 입력하십시오.접촉 시간은 30초, 유속은 30 µL/min으로 지정하고 유로(flow path)를 second로 설정하십시오. 재생(regeneration) 과정에 대해서도 동일한 절차를 반복하십시오. 2개 패널 선택 설정을 수행하고, 유로를 two dash one으로 설정한 뒤 next를 선택하십시오. 그리고 포획 용액(capture solution) 이름으로 G-S-T-T-C-O와 teraz AP 1, 497 conjugate를, 시료 이름으로 FKBP 12를 입력하고, 농도 시리즈를 1:2 희석의 1.5에서 96 nM로 입력하십시오.용액 바이알을 시약 랙 2에 배치하고 희석 시리즈를 96-웰 플레이트에 담은 후, 메서드 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작하십시오. 배향과 밀도를 제어하면서 생체 활성 저분자 물질을 효율적으로 가역적 고정화하는 것은 새로운 바이오센서 응용 분야 개발에 핵심적인 역할을 합니다. 여기에서는 teraz zine Benzoin 고정화의 실시간 모니터링 과정을 보여줍니다.G-S-T-T-C-O 용액을 미리 고정된 anti GST 표면에 주입하여 약 400 R RU의 상승을 유도합니다. 이에 대응하여 Teraz zine Benzo Lamine을 두 번째로 주입하면 빠른 15 RU의 반응 상승이 나타납니다. 러닝 버퍼로 전환한 후 dert 항원의 해리가 관찰되지 않았으며, 이는 구조적 안정성의 근거가 됩니다.다중 캡처 사이클 반복을 가능하게 하기 위해 사이클의 마지막 단계에서 표면을 재생하였습니다. 이 절차를 사용하고 테트라진 벤질 라민 부위를 테트라진 AP 1, 497 접합체로 교체하면 생물학적 활성 표면이 생성되며, 이는 표적과의 상호작용 연구에 사용됩니다. FK BP 12에 의한 항체-항원 상호작용의 파괴는 anti GST 표면을 재생하여 새로운 분자 조립체를 구축할 수 있게 합니다.이 사례에서는 GST TERAZ zine 주입 후 N-P-T-C-O를 주입하여 나노입자를 센서 표면에 효과적으로 고정합니다. 나노입자 상의 반응하지 않은 TCO 그룹은 주입된 teraz zine benzo lamine과의 cyclo edition에 활용될 수 있습니다. 또는, 기능화된 나노입자 FK BP 12 상호작용을 모니터링하기 위해 TET INE AP 1, 497 접합체를 사용합니다.다성분 구조의 해리가 관찰되지 않아 구조적 안정성과 생물학적 활성이 입증되었으며, 이는 실시간 고정화 반응 모니터링 및 표면 재생 능력을 제공합니다. 여기에서 보여주는 바와 같이 결합 속도 상수 KA의 간단한 특성 분석이 수행되었습니다. 반응 속도론에 대한 지식은 고정화 밀도를 제어하기 위한 지침과 바이오센서 분석을 위한 중요한 파라미터를 제공합니다.G-S-T-T-C-O 또는 GST teraz zine 표면에 각각 농도를 높여가며 teraz BELAMINE 또는 N-P-T-C-O를 이중으로 주입하여 결합 데이터를 생성합니다. 동일한 표면에서 동일한 농도의 분석물 시료 두 개를 순차적으로 처리한 결합 데이터는 거의 완전히 겹쳐지며, 이는 항체 결합 용량의 손실이 최소화되었음을 나타냅니다. 캡처 사이클의 반복적인 포획 및 재생 과정으로 인해, 평가 소프트웨어는 포획 반응 속도에 대해 최적 적합(best fit) 동역학 분석을 제공합니다.우리는 항체 항원 캡처와 테라진 및 트랜스시클린 사이의 빠르고 매우 특이적인 사이클로 첨가 반응을 결합하여 저분자 화합물을 빠르게 가역적으로 고정할 수 있는 접근 방식을 개발했습니다. SPR 칩 기반 연구에서, 캡처 사이클로 첨가법은 10 µM 미만의 저분자 리간드 농도에서 짧은 접촉 시간만을 필요로 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 캡처 사이클로 첨가법을 사용하여 센서 표면에 저분자 화합물 또는 다성분 구조를 고정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.이를 달성하기 위해서는 접합 반응에 고품질의 시약을 사용하고, SPR 기기의 분석 파라미터를 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.

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연구

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화학

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