역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

다음 실험의 전반적인 목표는 센서 칩 표면에서 작은 분자와 기능화된 나노 입자를 가역적으로 고정할 수 있는 빠르고 일반화 가능한 전략을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 센서 표면에 항 GST 항체를 고정시킴으로써 달성됩니다. GST 항원의 두 번째 단계 포획으로.

트랜스 사이클로, 옥틴 또는 테트라 진 그룹으로 기능화되면 소분자 테트 사인 유도체 또는 나노 입자 트렌드 사이클로 옥탄 콘주게이트를 사용한 후속 사이클로 에디션 반응을 위한 반응성 표면을 제공하며, 이는 이후에 소분자 테트 사인 유도체로 기능화됩니다. 다음으로, 기능화된 표면은 원하는 가용화 타겟과의 상호 작용 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 마지막 단계에서는 표면이 재생되어 후속 캡처가 가능하고, cyclo edition cycles 결합 결과가 선박에 표시되며, 생체 직교 반응이 고정화된 소분자 또는 두 개의 기능화된 나노 입자가 FK BP 12 표적과 상호 작용하는 능력을 보존하고, 이 접근 방식이 SPR의 응용 범위를 어떻게 확장할 수 있는지 보여줍니다.

이 온칩 캡처 사이클 에디션 기술의 주요 장점은 배향 및 I 동원 밀도를 제어하여 작은 분자의 빠른 가역성 및 동원을 가능하게 한다는 것입니다. 일반적으로 캡처 주기 편집 프로세스는 몇 분 내에 수행될 수 있어 표면 준비 시간이 크게 단축되며, 우리 실험실의 학생인 Jason Sandler는 DMSO의 50밀리몰 T-C-O-N-H-S 용액 8마이크로리터에서 PBS의 밀리리터당 1밀리리터 GST 솔루션 100마이크로리터로 이 절차를 시작합니다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 흔든 후 Zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 여분의 시약을 제거합니다.

다음으로, DMF의 25 밀리 몰 테트라 NHS 에스테르 용액 6 마이크로 리터를 PBS의 GST 1 밀리리터 용액 75 마이크로 리터에 첨가하고 1 시간 후에 실온에서 혼합물을 흔든다. 반응 혼합물을 25마이크로리터의 PBS로 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 50 밀리 몰 T-C-O-N-H-S 용액을 150 마이크로 리터의 발산 나노 입자 용액에 넣고 이전과 같은 방식으로 혼합물을 흔듭니다.

혼합 후 NAP 10 컬럼을 사용하여 겔 여과로 여분의 시약을 제거합니다. PBS 버퍼와 관련이 있습니다. N-P-T-C-O 제품이 들어 있는 컬러 밴드를 수집합니다.

순화된 표본을 100, 000의 분자량 커트오프를 가진 원심 여과기 장치를 포함하는 분리기 관으로 옮깁니다. 그런 다음 원심분리 후 샘플을 약 150마이크로리터의 최종 부피로 농축합니다. DMSO의 0.1 몰 cynic 무수물 용액 50 마이크로 리터를 N-P-T-C-O 용액에 첨가합니다.

혼합물을 실온에서 1시간 동안 흔든 후, 공명 기기의 표면 플라즈마를 사용하여 PBS를 사용하지 않는 NAP 10 컬럼을 사용하여 N-P-T-C-O 제품을 정제하고, AM 부동화 마법사 템플릿에서 플로우 셀 1 및 2의 고정을 선택합니다. 0.4 몰 EDC와 0.1 몰 NHS의 일대일 용액을 480초 동안 주입하여 표면 카르복실기를 활성화하도록 Amin 방법을 수정합니다. 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 에탄올 아민 주입을 설정하여 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 나머지 활성 에스테르를 422 번째 접촉 시간으로 담금

리간드 이름 anti GST를 입력하고 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 420 초의 접촉 시간 동안 주입하도록 설정하십시오. 다음으로, 이전에 준비된 용액 바이알을 시약 랙 2에 놓습니다. 데이터가 저장될 파일 이름과 대상을 할당한 후 위치 를 콘텐츠 목록과 일치하는지 확인합니다.

고정을 시작합니다. immobilization wizard를 편집하여 reference flow cell 1에 대해 분당 5마이크로리터로 420초 동안 GST 리간드 용액을 밀리리터당 20마이크로그램만 주입합니다. 이전에 준비한 10마이크로몰 TERAZ 올라인 용액과 재생 용액이 들어 있는 G-S-T-T-T-C-O-A가 들어 있는 바이알을 시약 랙 2에 놓습니다.

수동 실행 방법을 선택하고 유속을 분당 5마이크로리터로 설정하고 유동 경로를 플로우 셀 2로 설정합니다. G-S-T-T-C-O 용액을 420초 동안 주입한 다음 Teraz Benz Lamine 용액을 600초 동안 주입합니다. 그런 다음 재생 용액을 두 번의 32차 주입으로 표면을 재생합니다.

GST TERAZ 진, N-P-T-C-O, teraz 벨라민 및 재생 용액 바이알을 시약 랙 2에 배치한 후 기기 수동 실행 방법을 선택한 다음 유속을 분당 5마이크로리터로 설정하고 유동 경로를 플로우 셀 2로 설정합니다. GST Tetra zine 용액을 60초 동안 주입한 다음 N-P-T-C-O 용액을 60초 동안 주입합니다. 마지막으로 테트라스 진 벨라민 용액을 60초 동안 주입합니다.

완료되면 이전과 동일한 방식으로 표면을 재생성합니다. 그런 다음 새 방법을 선택하고 데이터 수집, 속도 감지, 시료 격실, 온도, 농도 단위 및 버퍼 설정을 포함하는 일반 매개변수를 입력합니다. Assay steps 패널에서 새 단계를 만들고 이름을 sample로 지정합니다.

그런 다음 사이클 유형 패널에서 샘플에 대한 목적 및 연결 기반 설정을 설정하고 새 사이클 단계를 만들고 다음 명령을 삽입합니다. 시료 재생 1 및 재생 2를 캡처합니다. capture 명령을 선택하고 G-S-T-T-C-O를 리간드로 입력합니다.

접촉 시간으로 120초, 유량으로 분당 5마이크로리터의 이름을 지정합니다. 그리고 흐름 경로를 두 번째로 설정합니다. 그런 다음 샘플 명령을 선택하고 182번째 접촉 시간, 62번째 해리 시간, 분당 30마이크로리터 유량을 입력하고 흐름 경로를 둘 다로 설정합니다.

그런 다음 regeneration one 명령을 선택하고 재생 솔루션을 입력합니다. 분당 30마이크로리터에서 32번째 접촉 시간의 이름을 지정하고 흐름 경로를 초로 설정합니다. 재생에 대해 동일한 절차를 반복합니다.

두 명령 선택 설정, 실행 및 흐름 경로를 두 개의 대시 1로 설정합니다. 다음을 선택하고 테트라 벨라민 분석물 용액과 1-2 희석으로 1.5-20 마이크로몰의 농도 시리즈로 샘플 목록을 채웁니다. 그런 다음 랙 위치 패널 옆을 선택합니다.

용액 바이알을 시약 랙 2에 세팅한 후 희석 시리즈를 놓습니다. 96 웰 플레이트에서. 위치가 콘텐츠 목록과 일치하는지 확인합니다.

분석법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 예를 들어, 새로운 분석법과 일반 파라미터가 선택되면 분석 단계 패널에서 캡처 샘플 및 재생 단계를 생성하고 이름을 지정합니다. 그런 다음 해당 목적을 선택하고 기본 설정을 연결합니다.

그런 다음 사이클 유형 패널을 선택하고 세 개의 사이클 단계를 만듭니다. 캡처, 샘플링 및 재생. 캡처 주기 아래에 capture 명령을 두 번 삽입합니다.

capture one 패널을 한 단계씩 실행합니다. 캡처 솔루션을 변수로 선택합니다. 그런 다음 분당 5마이크로리터의 유속으로 접촉 시간을 300초로 설정하고 Capture Two 패널에서 흐름 경로를 초로 설정합니다.

캡처 솔루션을 변수로 선택합니다. 분당 5마이크로리터의 유속에서 접촉 시간을 250초로 설정하고 흐름 경로를 초로 설정합니다. 다음으로, 샘플 주기 단계 아래에 샘플 명령을 삽입합니다.

샘플 패널을 선택하고 접촉 시간을 60초로 설정합니다. 해리 시간은 분당 30마이크로리터의 유속에서 200초로 설정하고 흐름 경로를 둘 다로 설정합니다. 재생 주기 단계에서 재생 명령을 두 번 삽입하고 재생 하나를 선택한 다음 재생 솔루션을 입력합니다.

분당 30마이크로리터에서 30초의 접촉 시간을 명명하고 흐름 경로를 초로 설정합니다. 재생에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 두 개의 패널 선택, 설정, 실행 및 흐름 경로를 두 개의 대시로 설정하고 하나는 다음을 선택하고 G-S-T-T-C-O 및 teraz AP 1, 497 conjugate를 capture 용액으로 입력하고, FKBP 12를 샘플 이름으로, 1.5-96 nano molar를 1-2 희석으로 농도 계열로 입력합니다.

용액 바이알을 시약 랙 2에 놓고 희석 시리즈를 96웰 플레이트에 넣은 후 분석법 템플릿을 저장하고 결합 분석을 시작합니다. 방향과 밀도를 제어하는 생체 활성 소분자의 효율적이고 가역적인 고정화는 새로운 바이오센서 응용 분야의 개발에 중요한 역할을 합니다. 여기에 표시된 것은 teraz zine Benzoin 고정화의 실시간 모니터링입니다.

G-S-T-T-C-O 용액을 사전 고정 된 안티 GST 표면 위에 주입하여 약 400 R RU 상승을 일으킨다. 이에 대한 응답으로 Teraz zine Benzo Lamine을 두 번째로 주입하면 15RU가 빠르게 상승합니다. 실행 중인 버퍼로 전환한 후 dert 항원의 해리가 관찰되지 않아 구조 안정성에 대한 증거를 제공합니다.

표면은 여러 캡처 cyclo edition 주기를 가능하게 하기 위해 주기의 마지막 단계에서 재생성되었습니다. 이 절차를 사용하여 테트라 진, 벤질 라민 부분을 테라즈 진 AP 1, 497 접합체로 대체하여 표적과의 상호 작용 연구에 사용되는 생체 활성 표면을 생성합니다. FK BP 12는 항체 항원 상호작용을 중단하여 항 GST 표면을 재생하여 새로운 분자 어셈블리를 구축할 수 있습니다.

이 경우, GST TERAZ 진 주입 후 N-P-T-C-O 주입을 통해 나노 입자를 센서 표면에 효과적으로 고정시킵니다. 나노 입자에 대한 Unre 반응 TCO 그룹은 주입 된 teraz zine benzo lamine을 사용한 cyclo edition에 사용할 수 있습니다. 또는 TET INE AP 1, 497 접합체를 사용하여 기능화된 나노 입자 FK BP 12 상호 작용을 모니터링합니다.

다성분 구조의 해리는 관찰되지 않았으며, 실시간 고정, 반응 모니터링 및 표면 재생을 위한 기능과 함께 구조 안정성 및 생체 활성에 대한 증거를 제공했습니다. 연관 비율 KA의 간단한 특성화는 다음과 같이 수행됩니다. 반응 역학에 대한 지식은 부동화 밀도 및 바이오센서 분석을 위한 중요한 파라미터를 제어하기 위한 지침을 제공합니다.

G-S-T-T-C-O 또는 GST teraz zine 표면에 증가하는 농도의 teraz BELAMINE 또는 N-P-T-C-O를 각각 중복으로 주입하면 결합 데이터가 생성됩니다. 동일한 표면에서 동일한 농도의 두 개의 순차적 분석물 샘플에 대한 결합 데이터는 항체 결합 용량의 최소 손실을 반영하여 거의 초강력입니다. capture cyclo edition 및 재생의 여러 주기로 인해 평가 소프트웨어는 cyclo edition 반응 속도에 가장 적합한 역학 분석을 제공합니다.

당사는 항체 항원 포획을 활용하여 teraz zine과 트랜스 사이클린 간의 빠르고 매우 특이적인 cyclo edition 반응을 활용하여 소분자의 신속한 가역적 고정화를 가능하게 하는 접근 방식을 개발했습니다. SPR 칩 기반 연구의 경우, capture cycle edition 방법은 10마이크로몰 미만의 저분자 리간드 농도로 짧은 접촉 시간을 필요로 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 capture cyclo edition 방법을 사용하여 센서 표면에서 작은 분자 또는 다성분 구조를 고정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이를 달성하기 위해서는 접합 반응에 우수한 품질의 시약을 사용하고 SPR 기기에서 분석 파라미터를 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.