뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 대뇌 전이 형성 중에 직접 신경교세포의 상호작용을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐에서 유기형 뇌 절편을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 유기형 뇌 절편을 암종 세포와 공동 배양합니다.

그런 다음 기질 세포는 특정 마커로 형광으로 염색됩니다. 마지막으로, 종양 침습 정도는 형광 현미경으로 평가합니다. 궁극적으로 면역형광 표지 및 타임 랩스 또는 컨포칼 현미경을 통해 신경교세포의 상호 작용 및 공동 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

암종 세포의 뇌내 주입과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 쉬운 대안이며 종양 진행 중 세포 상호 작용을 관찰할 수 있는 좋은 플랫폼을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 함의는 암 치료를 위한 새로운 선택적 치료법의 발견에 대한 10입니다. 외상 세포는 전이에 중요한 역할을 하고 암 치료의 잠재적 표적이 될 수 있기 때문에 이 기술을 시연하는 것은 Eugenia가 내 실험실의 박사후 연구원에게 건네는 것이 될 것입니다 수술 절차 전에 0.2 밀리몰 글루타민, 밀리리터 스트렙토마이신당 100 밀리그램, 그리고 출생 후 6일째 사이에 마우스 균주에서 마우스를 참수한 후 포도당 밀리리터당 4.5 밀리그램이 보충된 최소 필수 배지로 구성된 해부 배지를 준비합니다. 8.

무균 상태를 신속하게 사용하여 두개골에서 뇌를 제거하고 해부 매체로 옮깁니다. 뇌에서 전두엽과 소뇌를 제거합니다. 그런 다음 냉동 접착제와 5%agros를 사용하여 대뇌로 구성된 나머지 뇌 조직을 고정하고 안정화합니다.

비브람(Vibram)의 수평 슬라이스를 사용하는 무대에서, 350미크론 두께의 절편은 쥐의 종류와 나이에 따라 하나의 뇌에서 4개에서 6개의 전체 뇌 절편을 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배양 배지를 준비한 후, 6웰 트랜스 웰 플레이트의 각 하단 웰에 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 각 유기형 뇌 절편을 0.4미크론 폴리카보네이트 트랜스웰 멤브레인에 놓고 플레이트의 웰에 삽입합니다.

이산화탄소 5%와 섭씨 37도의 가습된 분위기에서 밤새 조각을 배양합니다. 다음 날, 15%RPMI 배지 및 85%ECM 겔로 구성된 20마이크로리터의 겔 매트릭스에 5번째 GFP 형질 주입된 종양 또는 기타 세포 10개를 삽입합니다. MCF 7 겔 매트릭스 믹스를 유기형 뇌 절편의 피질 영역에 바로 인접한 멸균 금속 스페이서에 넣고 배양 후 2시간 동안 배양하고 스페이서를 제거하고 3D 종양 PHE가 24-96시간 동안 뇌 절편과 함께 배양하도록 합니다.

원하는 경우 격일로 배양 배지를 교체하십시오. 10배 배율 물체와 함께 타임 랩스 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행하여 뇌 절편 공동 배양을 염색합니다. PBST에서 5분 동안 샘플을 세척하기 전에 섭씨 4도에서 8시간 동안 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다.

그런 다음 샘플을 차단하려면 PBST에 일반 염소 혈청을 실온에서 1시간 동안 사용합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 36시간 동안 항신경교섬유산성 단백질 또는 GFAP 단일클론항체로 공동 배양물을 배양한 후 실온에서 1시간 동안 염소 항 마우스 염색을 수행하여 성상세포를 염색합니다. PBST로 샘플을 5분 동안 3회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 I LB 4 LOR 647로 미세아교세포를 염색한 후 실온에서 3분 동안 DPI로 카운터 염색합니다.

형광 장착 매체를 사용하여 공동 배양 샘플을 장착한 후 25배 배율의 형광 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 마지막으로, 다음 점수 시스템에 따라 종양 침습 등급을 평가합니다. 그것은 먼저 종양 플러그와 절편 사이의 접촉 단면의 길이를 측정한 다음 침입하는 세포가 감지할 수 있는 접촉 비율을 측정합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 테스트된 모든 암종 세포주는 유기형 마우스의 뇌 절편을 침범했으며, 이는 침입 과정이 종에 독립적임을 시사합니다. 이 동영상은 직접적인 신경교세포(glia tumor cell) 상호작용을 타임랩스로 기록한 것입니다. 기질 세포가 세포 플러그를 포함하는 종양에 침입하여 암 세포와 상호 작용하는 것이 관찰되었습니다.

장기간에 걸친 타임 랩스 이미징을 통해 뇌 절편의 생존 가능성을 확인했으며, 3차원 구체에 진입하는 미세아교세포와 뇌 절편에 침입하는 암세포를 시각화할 수 있었습니다. 더욱이, 우리가 이전에 보여준 바와 같이, 미세아교세포는 여전히 수수께끼 같은 메커니즘에 의해 암세포를 수송하고 면역형광 표지를 사용하여 암종 침입을 돕습니다. 우리는 뇌 조직과 종양 세포 플러그 모두에서 종양과 기질 세포의 공동 국소화를 입증했으며, 이는 침입 과정에서 이러한 세포 간의 긴밀한 상호 작용을 시사합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 마우스 뇌 절편을 인간 또는 소변 암 세포와 공동 배양했을 때 유사한 결과가 얻어졌으며, 이는 다양한 종, 유전자형 및 균주의 세포를 연구하기 위한 광범위한 응용 분야를 지원합니다. 이 기술은 암 전이 분야의 연구자들이 먼 곳에서 종양 집락화 중 미세환경의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 직접 생리학적 접촉 시스템에서 세포 뇌 전이 형성 중 GL 암세포 반응을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.