Name: 징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 C-III 녹아웃 토끼의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 학습하세요 아포지단백 C-III 녹아웃 토끼 생산 방법을 징크 핑거 뉴 클레아 제를 이용하여 심혈관 질환 연구에 활용하는 기술입니다. 이 방법은 대형 동물 모델 유전자 편집에 효율적입니다.

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이 작품은 부분적으로 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 (HL105114, HL088391, NS066652 및 YEC에 HL068878), 미국 심장 협회 (JZ에 국가 과학자 개발 0835237N). YEC는 재정적 미시간 의료 센터의 대학 (UMMC)에서 심장 혈관 의학 부여 프레드릭 Huetwell 교수로 지원됩니다. 이 작품은 번역 상 과학 및 UMMC에서 치료학 (CAMTraST)의 고급 모델에 대한 센터에서 지원하는 핵심 서비스를 이용했다.

모든 동물의 유지 보수, 관리 및 사용 절차는 미시간 대학의 동물의 사용 및 관리에 대한 검토 및 대학위원회에 의해 승인되었다. 1. ZFN 디자인하고 <ol><li> 제조 업체에 관심의 유전자 (예를 들어 토끼 ApoCIII)의 게놈 서열 정보를 제공합니다. ZFN 점수에 따라 실험을 위해 ZFN 세트 (들)을 선택합니다. </li></ol> 2. 토끼 배아 컬렉션 <ol><li> Superovulate 성적 (6-18개월) 성숙 뉴질랜드 화이트 (NZW) 처음 두 주사, 다음 두 주사 6 밀리그램 5 밀리그램 3 밀리그램의 복용량과 난포 자극 호르몬 (FSH)의 피하 (SC) 주사 회 / 일까지 여성 토끼 지난 주사에 대한. </li><li> 배란을 유도하는 최초의 난포 자극 호르몬 주사 후 72 시간에서 200 IU hCG의 단일 정맥 주사 (IV) 주사를 관리. 바로 hCG의 주입 후 남성 토끼 교배 여성 메이트. </li><li> Euthani&#39;제 펜 토바 비탈 나트륨과 교배 기증자 토끼 (150 ㎎ / kg, IV) 16 ~ 18 시간 포스트 인공 수정 (PSI)에. </li><li> 조심스럽게 전체 난관과 난소 구조를 수집하여 난관 ampullae을 복구 할 수 있습니다. </li><li> HEPES 10 ㎖ 조작 배지로 각각 수란관 플​​러시 TCM 199 수란관의 자궁 단부로부터 매체를 주입하여, 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 버퍼링. 페트리 접시에 난관의 난소 엔드 오프닝에서 플러시 매체를 수집합니다. </li><li> 관찰하고, 플러시 매체에 복구 된 배아를 식별하는 조작 매체에 배아를 세 번 씻어, 공기 38.5 ° C에서 조작 매체에 보관하고, 수정의 발생에 대한 실체 현미경을 관찰합니다. 전핵 단계의 배아에 미세 주입을위한 준비 19 ~ 21 시간 PSI </li></ol> 3. ZFN의 mRNA의 준비 <ol><li> RNase가없는 0.1X TE (1 mM 트리스로-C1 pH의 재 부상하기 전에 생성 된 mRNA의 정화8.0, 0.1 mM의 EDTA). 농도를 측정하고 사용할 때까지 -80 ° C에서의 mRNA를 저장합니다. </li><li> 10 ㎕의 작은 유리 병에 ZFN 쌍 (산도 7.5에서 1 mMTris로-C1, 0.1 mM의 EDTA에 4-10 NG / μL), 나누어지는 인코딩의 mRNA를 준비합니다. 사용 준비가 될 때까지 -80 º C에서 보관하십시오. 미세 주입하기 전에 RNA 유리 병 (들)을 해동하고, 얼음에 보관. </li></ol> 4. 배아 미세 주입 <ol><li> 제거 미디어 챔버가 1 잘 챔버 슬라이드 조작 매체의 5 μL 드롭을 배치하여 미세 주입 플랫폼을 준비합니다. 가열 현미경 단계에 미네랄 오일과 장소와 매체 드롭을 커버. </li><li> 미세 조작기의 홀더 팔에 들고 피펫 (120 μm의 직경)를 배치하고 조작 매체의 드롭에 위치. </li><li> 마이크로 피펫 끌어 당기는 장치에 붕규산 유리 모세관 튜브를 가열 당겨 주입 마이크로 피펫을 제작합니다. 주입 피펫으로 주입되는 mRNA를 넣습니다. </li><li>microinjector에 연결되어있는 압축 공기 공급 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 조작 매체의 드롭에 미세 조작기와 위치를에 넣어 주입 홀더에 주입 피펫을 놓습니다. </li><li> 설치 다음과 같은 제안 매개 변수를 사용하여 microinjector : holdP = 2 PSI, InjP = 20 PSI, ClearP = 60 PSI, 1-5 (PL)의 주입 부피가 발생합니다 Injtime = 1 초. </li><li> 부드럽게 고정 용 피펫에 대해 그것을 감청하여 주입 피펫의 팁을 엽니 다. </li><li> 플랫폼의 미세 조작 드롭에 배아 (30 ~ 50)를 전송합니다. 배아를 캡처하고 주사 바늘, 배아 및 x-축을 따라 홀딩 피펫을 정렬하는 홀딩 피펫을 사용한다. </li><li> 400 배 배율에서 배아를 주입 피펫을 진행. 핵 않도록주의하십시오. 세포막을 관통되면, 눌러 발 페달을 주입한다. 주사 후, 바늘을 철회 배아를 놓습니다. 나머지 그들에 대한 과정을 반복합니다bryos. </li><li> 비 필수 아미노산 (NEAA), 필수 아미노산 (EAA), 1 ㎜의 L-글루타민, 0.4 mM의 피루브산 나트륨, 10 %로 보충 얼의 균형 소금 용액 (EBSS)로 구성 배아 배양액에 주입 배아 세 번 씻으 FBS. </li><li> 그들은 수술 동기화 된받는 여성 NZW 토끼 (단계 5.1 참조)의 난관에 전송하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 공기 중 5 % CO 2에서 38.5 ° C에서 배아를 품어. 그들은 체외 유효성 검사 또는 분석에 사용되기 전에 다른 방법으로, 문화 배아들은 배반포 단계에 도달 할 때까지. </li></ol> 5. 배아 전송 <ol><li> 약 무게 건강에 5~12개월 된 여성 NZW 토끼를 선택합니다. 받는 사람 동물로 4.0-5.0 kg. 생식샘 자극 (단계 2.2 참조) 공여체 동물 발 행 hCG의 주입의 것과 동일한 시점에서 수신자에게 호르몬 (GnRH에) 주입 근육 내 (IM, 50의 mcg / ㎖, 0.3 ㎖ / 동물)을 떼면 관리. </리&gt; <li> 미세 주입을 완료 한 후, 배아 전송 (성선 자극 호르몬 방출 호르몬 주사 후 일반적으로 16 ~ 24 시간)에 대한받는 사람 토끼를 준비합니다. 10 ~ 40 ㎎ / kg 케타민 (IM)과 토끼를 마취 및 / 또는 증발 이소 플루 란 (2-4 %) 흡입에 의한. 멸균 안과 연고의 응용 프로그램에서 과도한 건조 토끼의 눈을 보호합니다. 그것은 즉, 완전히 의식이 될 때까지 동물을 관찰한다. 발 패드는 적절한 마취의 표시입니다 페달 반사의 부족을 확인하는 데 사용됩니다 압박, 페달 반사에 응답하지 않습니다. </li><li> 토끼의 복부를 면도, 소독액 다음, 살균 스크럽, 세척 및 멸균 거즈 스폰지와 면도 영역을 닦습니다. </li><li> 무균 조건 하에서 수술을 시행, 수술 전반에 걸쳐받는 사람 토끼마다 약 15 분의 생체 신호를 기록한다. </li><li> 배아의 사용 가능한 수에 따라받는 사람의 동물에 10-25 배아를 전송합니다. </li><li> 끝에수술 절차는 코팅 흡수성 봉합사와 근육층을 닫는다. 흡수성 봉합사를 사용하여 봉합 subcuticular 하나 또는 nonabsorable 봉합 (예를 들어, 모노 필라멘트 나일론 또는 유사)를 사용하여 간단한 중단 피부 봉합사로 피부를 봉합. </li><li> 동물을 따뜻하게 유지 및 흉골 드러 누움이 달성 될 때까지 모니터링합니다. </li><li> 매일 동물을 모니터링합니다. 동물 돌보는 수의사의 지시를 따릅니다. 통증을 완화 및 / 또는 수의사에 의해 필요한 결정하면 발열 매일 게시 작업을 줄이기 위해 멜 록시 캄 (SC 1.0 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 대략 10-14 일 게시 작업에 nonabsorable 피부 봉합사를 제거합니다. </li></ol> 6. ZFN 유도 유전자 중단의 검출 <ol><li> 체외 검증의 경우, 체외 배양 된 배아에 유전자형을 수행합니다. 5 μL의 NP40 용액 (1 % NP40 + 1 UG에 morula / 배반포 단계로 개발 / ㎖의 Taq 버퍼에 테 K를 Lyse 개별 배아) 55 ° C에서 0.5 시간, 95 ℃에서 10 분 동안 </li><li> 자손의 유전자형를 들어, 신생아 키트에서 귀 피부 샘플을 수집 게놈 DNA를 추출하고 PCR 시퀀싱을위한 템플릿으로 사용합니다. 출혈을 멈추게과 불편을 줄이기 위해 수집 한 후 샘플링 영역에 KWIK 스톱을 적용합니다. </li><li> LA-DNA 형성 촉매 및 ZFN 대상 사이트의 상류에 위치 (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;)와 (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 하류&#39;)하는 PCR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을위한 템플릿으로 단계 6.2 또는 6.3에서 용해를 사용 . </li><li> PCR 제품을 정화하고 시퀀싱 프라이머 (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;)로 시퀀스. </li><li> 타겟팅 사이트 주위의 시퀀스 다이어그램에서 두 곡선을 찾아 돌연변이 샘플을 확인합니다. &quot;긍정적&quot;으로 두 배 곡선에 그들 레이블을 지정합니다. </li><li> , TA 클로닝 벡터에 &quot;긍정적 인&quot;PCR 제품을 복제 10-20 클론, 순서 삽입을 선택하고, T 주위에 돌연변이를 확인argeting 사이트. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 ZFN 기술을 사용하여 생성되었다. 이전 GTT 토끼의 생산만을보고는 또한 ZFN 기술 (18)을 사용했다. 본 작품은 ZFN 효과적으로 토끼의 유전자를 대상으로 유용하다는 것을 확인했다. 본 연구에서, 토끼의 이전 ZFN 보고서 (30.8 %, 52분의 16) (18)에 필적하고, 그보고 형질 전환 속도 (긍정적 키트 / 총 출생) is23.8 % (5 / 21), 얼룩말 물고기 19, 쥐 20, 쥐 (21)와 돼지 (17) 등 다른 동물 종에 ZFN을 사용. 이 비율은 5-20 %의 범위에 빠질 많은 종래의 트랜스 제닉 토끼 생산 연구의 속도보다 더 높은 사실이다. 예를 들어, 기존의 DNA의 미세 주입을 통해 제품 ApoCIII 형질 전환 토끼하기위한 노력의 일환으로, 종소리 등. (5.6 %) 22 태어난 새끼 54 개 만점에 3 개 양의 설립자를 얻을. 이전의 연구 결과와 일치, 대상 사이트의 돌연변이 (다섯 KO 토끼에서 1-21까지) 기지의 다른 번호로 구성된 삭제 또는 삽입 등의 변수입니다. 설립자 동물의 특정 서열 정보를 바탕으로, 그것은 (Δ1, +1, +1, 또는 Δ20 돌연변이를 함유하는, 즉.) ApoCIII의 기능 손실이있을 것입니다 적어도 네 개의 예측된다. 이 돌연변이는 일곱 아미노산의 유일한 원인이 손실을 예측하지만, 독서 프레임 변화되지 않는 동물 R-16 Δ21와 함께, 기능 손실이 표시되지 않을 수 있습니다. 궁극적으로, 표현형 분석이 설립자 동물이 진정 ApoCIII 기능의 손실을 표시 여부를 확인하기 위해 필요합니다. 본 연구에서 생성 된 다섯 KO 토끼 중 어느 것도 biallelic 수정 사항을 포함하지 않습니다. 흥미롭게도,이 또한 이전 ZFN 토끼 보고서의 경우입니다. 대조적으로, ZFNs α1 ,3-갈 락토을 타겟팅은 돼지에 적용된세포, 23 어 내고 biallelic 한 단계를 만드는 돌연변이의 약 3 분의 1로, 7~46% 원거리 하나의 대립 유전자를 표적으로의 주파수. TALEN 돼지는 섬유 아세포에 도포 할 때와 일관되게, biallelic 변형은 전체 포지티브 클론 (14)의 약 15-40%에서 발견되었다. 또한, 본 연구에서 biallelic KO 토끼를 생성하는 오류가 표적 핵산 분해 효소 유전자를 기반으로 같은 용량의 종 차이 (즉, 토끼 대 돼지)를 나타낼 수있을 수 있습니다. 그것은,이 프로젝트에서 생성 KO 토끼의 수는 상대적으로 작기 때문에이 단순히이라고하지만, 가능성이 높습니다. 우리는 ZFN은 ZFN 기반 GTT 토끼 생산의 또 다른 잠재적 인 이점으로 간주되어야 토끼 bialleic 돌연변이를 생성 할 수 있다고 생각합니다. 추가 실험은 토끼 ZFN 같은 용량을 확인하기 위해 필요합니다. 결론적으로, 본 연구는 보여주는 Z접근을 대상으로 FN 기반의 유전자는 KO 토끼를 생산하는 효과가 있습니다. 특히, 우리는 23.8 %의 만족 형질 전환 속도와 다섯 ApoCIII KO 토끼를 생성합니다. 이 동물은 해당 마우스 모델보다 인간의 지질 대사에이 단백질의 역할에 대한보다 의미있는 정보를 제공 할 것으로 생각된다. 우리는 ZFN 기반 유전자 타겟팅뿐만 아니라, TALEN 및 RGEN 등의 핵산 분해 효소 기반의 기술을 예측, nonmurine 동물에 상당히 다양한 인간의 질병을 연구하는 새로운 동물 모델의 개발을 촉진 할 것이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. ZFN 기술을 사용하여 녹아웃 토끼의 생산 흐름도. ZFN 기술을 사용하여 KO 토끼의 생산은 그 유전자의 선택과 함께 시작합니다. 시퀀스 정보는 ZFN 세트 설계되어 제공되고, 피사체된다ected 효모 자체 유효성 검사를 기반으로. 체크 포인트 (CP) 1 (CP-1)에서 자체 검증 (내부 양성 대조군의 50 % 이상)을 통과 세트 만이 선택을 사용자에게 제공됩니다. 제공된 세트 CP-1을 통과하지 않으면, 추가적인 시퀀스 효과적인 ZFN 세트를 설계를 위해 필요할 수도있다. 체외 배아 검증 선택한 ZFN 세트가 선택한 사이트 (CP-2)에서 돌연변이를 유도 할 수 있도록하기 위해옵니다. 이 (시험관 배아&gt; = 10 %의 돌연변이 비율) CP-2를 통과하면 ZFN 세트 (들) 만 사용됩니다. CP-2의 실패는 ZFN 세트의 재 설계가 필요합니다. 배아 기증자 준비하고 전핵 단계의 배아는 검증 ZFN 세트 미세 주입됩니다. 이러한 미세 주입 배아는 동기화 배아받는 사람에게 전송됩니다. 한 달 임신 기간 후에, 신생아 (CP-3) 유전자형됩니다. 신생아 중에 긍정적 없으면 추가적인 미세 주입이 수행 될 것이다. 그것은 N 가정, CP-2 프로젝트의 시작부터 2-3개월 소요과정에서 입출력 오류가 발생했습니다. 이 CP-3 CP-2에서 추가 2~3개월 걸립니다. 그러므로 ZFN 기술을 사용하여 4 ~ 6 개월의 시간 프레임에서 녹아웃 토끼를 생성 할 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. ZFN 디자인. 세 ZFN 세트 (2 세트 1, 3)은 엑손 1 또는 토끼 ApoCIII (A)의 엑손 2에 다른 시퀀스를 대상으로 설계되었습니다. 세 세트 ZFN 활동을 결정하는 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 제조의 프로토콜에 따르면, 제조의 내부 양성 대조군의&gt; 50 %를 보여 ZFNs 활동은 시험 관내 및 생체 게놈 편집 실험에 유용한 것으로 간주된다.ZFN 활동 따라서 (1) 본 연구에서 선택한 설정, 설정 1 224.2 %, 세트 2 196.9 % 및 3 종 세트 (B)에 대한 177.8 %였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> ZFN의 그림 3. 시험관 배아 검증. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (A)의 세포질에 미세 주입 하였다. 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. BL 개발 속도가 대조군에서 77.4 %였다. 미세 주입 군에서는 BL 비율은 51.4 %였다. PCR 시퀀싱을 실시 16 BLS의, 8 (50 %)가 긍정적으로 확인하고, 설정 1을 나타내는 것은 타지에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다팅 사이트 (B, apoc3wt.seq, 블랙 박스) 토끼 ApoCIII의. 돌연변이를 함유 BLS는 BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 그리고 17의 (B, 붉은 밑줄). 나머지 BLS는 (# 1 에이 팍-2, 6, 9, 10, 12, 14, 16)는 표적 사이트에 돌연변이가 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> 그림 4. ApoCIII KO 토끼의 제조. ZFN 세트 1의 mRNA와 미세 주입 한 백 사십 오 배아는 7 의사 임신받는 사람 토끼 (A)에 전달했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 실험 그룹의 총 기간 키트 / 전체 배아로 계산 기간의 비율은 14입니다0.5 % (145분의 21), 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 ​​반면, (A). 미세 주입 군, 오 (R1, R9, R11, R12 및 R16)에서 태어나 21 키트 중 PCR 시퀀싱 (B) 후 긍정적 KO 키트를 확인 하였다. 타겟팅 사이트에서 삽입이나 삭제는 두 개의 삽입 (R9 및 R11 모두 +1)와 세 개의 삭제 (각각 Δ1, Δ (20), R1, R12와 R16에 대한 Δ 21) 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

아포 지단백 (아포) C-III (ApoCIII)은 간과 소장에서 주로 합성되는 작은 O-당화 분비 단백질이다. 그것은, 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. ApoCIII 심혈관 질환 1의 위험 인자로 인식되고있다. ApoCIII의 유전 적 결함을 가진 환자는 낮은 혈장 중성 지방 (TG) 수치 감소 무증상 관상 동맥 죽상 경화증 2,3있다. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은, 반면에, 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및 (HTG) 4,5과 상관. 유전자 녹아웃 (KO)는 유전자의 기능을 연구 할 수있는 강력한 수단이다. 인간의 돌연변이 집단의 관찰과 일치, 생쥐의 ApoCIII 유전자의 녹아웃은 플라즈마 TG의 감소와 식후 HTG 6으로부터 보호되었다. ApoCIII의 이러한 긍정적 인 역할 등장아포과 ApoCIII 모두의 결핍 생쥐도 식후 고지혈증 7에서 보호 될 때, 아포 지질 단백질 E (아포) 독립적이어야합니다. 이러한 ApoCIII KO 마우스 모델은 인간의 ApoCIII의 가능한 기능에 대한 귀중한 정보를 제공하고 있지만, 그것은 쥐의 지방 단백질의 신진 대사가 여러 측면에서 인간의 그것과 다르다는 것을 알 수있다. 예를 들어, 마우스 혈장 콜레 스테 릴 에스테르 전달 단백질 (CETP), VLDL, LDL의 수송에 관련된 주요 효소 및 HDL 8 부족하다. 따라서, 상기 생체 ApoCIII의 생리적 역할을 이해하기 위하여 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 필요하다. 토끼는 클래식 모델 동물 종 9-11입니다. 그것은 짧은 임신 기간 (30-31일), 대형 쓰레기의 크기 (4-12/litter)가 실내 시설에서 편리하게 수납 할 수 있습니다. 마우스에 비해, 토끼 인간 10 계통 발생 학적으로 더 가깝다. 중요한 것은, 같은 HU남자는하지만, 마우스와 달리, 토끼는 LDL이 풍부한 포유류 및 CETP (10, 12)의 상당한 수준을 가지고. 게다가, 그들은 인간 아테롬 13에서 본 것과 유사한 병변 콜레스테롤이 풍부한식이 유도 아테롬에 민감하다. 이러한 이유로, 우리는 ApoCIII KO 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화에 ApoCIIIplay의 역할을 조사하기 위해 자신의 마우스에 비해 더 나은 모델이 될 수 있다는 가설을 세웠다. 유전자의 생산 (GTT) 토끼가 도전을했습니다 유전자를 대상으로. 이는 배아 줄기 세포 (ESC)를 전송하는 생식 세포의 부족, 그리고 토끼의 체세포 핵 이식 (SCNT)의 매우 낮은 효율에 주로 기인한다. 및 SCNT가 성공적으로 돼지, 양, 소,하지만 토끼 등의 생식 전송 줄이고 ESCs를, 부족한 종에 KO 동물을 생성하기 위해 적용된 반면 ESC는 GTT 마우스를 생성하는 기본 도구입니다. 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN), 트란scription 활성제 - 드 이펙터 클레아 제 (TALEN) (14), 및 RNA 유도 효소 (RGEN) (15)는 게놈 편집을위한 강력한 수단을 나왔다. 그래서 &quot;분자 가위&quot;라는이 클레아는 ​​대상 유전자의 기능 KO로 이어질 나있는 게놈의 특정 현장에서 DNA 시퀀스를 통합 할 수있는 게놈에있는 이중 가닥 휴식 (DSB)를 생성하는 효율적인 종 (16)의 수. 2011 년, ZFN 기술을 적응 첫번째의 사이에서, 우리는 SCNT 17 일이 세포를 사용한 후이 방법을 성공적으로 생성 된 PPARγ KO 돼지를 통해 페 록시 솜 증식 자 활성화 수용체 감마 (PPARγ) KO의 돼지 세포를 생성합니다. 같은 해, 효율적인 면역 글로불린 유전자의 중단도 ZFN을 사용하여 토끼를 대상으로 교체가 18보고되었다. (그림 1 참조 ZFN 세트를 사용하여, PCR 시퀀싱에 의해 확인 된 본 연구에서는 다섯 ApoCIII KO 토끼는 생성 된 </strong&gt;. 플로우 차트 그림). 이 동물은 지질 대사에 ApoCIII의 역할을 연구하는 새로운 자원입니다.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>타겟 유전자: APOC3, 로트 번호: 12201118MN</td></tr><tr><td>mMESSAGE 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>mRNA 합성</td></tr><tr><td>MEGAclear 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>mRNA 정제</td></tr><tr><td>난포 자극 호르몬</td><td>Bioniche 생명 과학</td><td>Folltropin-V</td><td>배아 기증자 토끼 치료</td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>배아 기증자 토끼 치료</td></tr><tr><td>성선 자극 호르몬 방출 호르몬</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>배아 수혜자 토끼 치료</td></tr><tr><td>얼스 밸런스드 솔트 솔루션(EBSS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>배아 배양, 기본 매체</td></tr><tr><td>MEM (비필수 아미노산)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>배아 배양,</td></tr><tr><td>BME AMINO ACIDS 용액</td> 보충 <td>Sigma Aldrich</td><td>B6766</td><td>배아 배양,</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>배아 배양 보충,</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 보충&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>배아 배양,</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td> 보충제 <td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>배아 배양,</td></tr><tr><td>HEPES 완충 TCM 199 보충;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>배아 조작 매체</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>배아 배양 장비</td></tr><tr><td>Micromanipulator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>배아 조작 장비</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>배아 조작 장비</td></tr><tr><td>마이크로인젝터&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td>배아 조작 장비</td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 모세관 튜브&nbsp;</td><td>월드 정밀 기기, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>배아 조작 공급</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbitol 나트륨)</td><td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>배아 기증자 토끼의 안락사</td></tr></tbody></table>

징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 c-iii 녹아웃 토끼의 생산

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

아포지 단백질 (아포) C-III (ApoCIII)는 플라즈마 카이로 미크론 (CM)의 표면에 초 저밀도 지단백질 (VLDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)을 상주. 그것은 인식 된 심장 혈관 질환에 대한 플라즈마 ApoCIII의 constitutea 위험 인자 (CVD)의 높은 수준. 상승 된 혈장 ApoCIII 레벨은 종종 인슐린 내성, 비만, 고 중성 지방 혈증 및과 상관. 그러나,이 마우스에서 지방 단백질의 대사는 많은 측면에서 인간의 다른 지적되고 ApoCIIIin 지질 대사와 CVD의 역할에 대한 귀중한 지식 ApoCIII 녹아웃 (KO) 마우스 등의 유전자 변형 마우스 모델에서 얻은되었습니다. 그것은 지금 상승 플라즈마 ApoCIII 직접 동맥 경화 여부까지 알 수 없습니다. 우리는 토끼는 인간의 지질 대사 및 동맥 경화증을 공부 reasonablemodelfor 역할을 할 수있는 가설에 기초하여 본 연구에서 ApoCIII KO 토끼를 개발했다. 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN) 세트 대상 토끼 AP 통신oCIIIgene 전에 배아 미세 주입에 체외 검증을 실시 하였다. mRNA의 35 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 주입하고, 배반포 상태의 변이 속도를 평가 하였다. 분석 하였다 십육 배반포, 표적 부위에서 만족 50 % 돌연변이율 (8 / 16)가 생체 내 실험을위한 한 세트의 이용을 지원하고, 달성 하였다. 다음으로, 우리는 세트 1의 mRNA 145 배아를 미세 주입하고, 7받는 사람 토끼 이러한 배아를 전송. 30 일 임신 후 21 키트는 다섯이 PCR 염기 서열 분석 후 ApoCIII KO 토끼로 확인되었다 밖으로있는, 태어났다. KO 동물 속도는 (# KO 키트 / 전체 출생) 23.8 %였다. 전체적인 생산 효율 (5 kits/145 배아 전사) 6.8 %이다. 본 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다. 이 ApoCIII KO 토끼는 지질 대사에 ApoCIII의 역할을 연구하는 새로운 자원입니다.

ZFN 쌍의 체외 검증에 열 여섯 ZFN 쌍은 초기 설계되었습니다. 세트 1의 표적으로 중단 시퀀스는 토끼 ApoCIII의 엑손 2 (그림 2A) 부근에 자리 잡고 있습니다. 세 쌍 (세트 1, 2, 3,도 2a)이 선택과 ZFN 활동 (도 2B)를 결정하기 위하여 효모 MEL-1 리포터 분석법을 행 하였다. 1 세트 2 (196.9 %)와 3 세트 (177.8 %)보다 높고 선택의 임계 값 (내부 양성 대조군의 예 : 50 %)보다 훨씬 높은 224.2 %의 ZFN 점수를 가지고 설정합니다. 따라서 세트 1은 체외 검증 실험을 위해 선정되었다. 특히 세트는 내부 검증 기준에 따라 체외 배아 유효성 검사를 통과하는 10 % 이상의 배아에 긍정적 인 요금 발생합니다. 세트 1의 mRNA의 (5 ㎍ / ㎖)을 35 전핵 단계 토끼 배아 (그림 3A &lt;의 세포질에 미세 주입 하였다/ strong&gt;을). 마이크로 인젝션 처리 (N = 31)없이 플러시 배아는 대조군으로 사용 하였다. 미세 주입 군의 여덟 배아 십육 시퀀싱 된 건, D5에 BL 단계로 발전하고, 팔은 (BL # 1 에이 팍-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17,도 3b, 적색 밑줄) 표시 변이 타겟팅 사이트 (블랙 박스, 그림 2B, 윗줄, apoC3wt.seq)의 순서. 미세 주입 군 (51.4 %)의 BL 속도는 미세 주입 배아의 발달이 약간 저하 능력을 나타내는 대조군 (77.4 %)보다 낮다. 미세 주입 배아 긍정적 돌연변이율이 선택 임계 값보다 훨씬 높은 50.0 % (8 / 16), (즉, 10 %)이다. 이러한 결과는 세트 1은 토끼 ApoCIII의 타겟팅 사이트에서 돌연변이를 유도 할 수있는 효과적인 ZFN 세트입니다 것으로 나타났습니다. 따라서 세트 1은 ApoCIII KO 토끼의 생체 내 생산을 위해 선택되었다. ApoCIII KO 토끼의 생산 mRNA의 오F ZFN 세트 1은 토끼 전핵 단계의 배아의 세포질에 미세 주입하고, 7 의사 임신받는 사람 토끼 (그림 4A)에 145 미세 주입 배아를 전송했다. ZFN의 미세 주입하지 않고 갓 플러시 배아 (N = 75)가 수신자에게 전송 된 (N = 6) 대조군으로. 임신 후 30 일 이후, 21 키트는 미세 주입 그룹에서 태어났다. PCR 연속 긍정적 KO 키트 (그림 4B)로 오 (apoC3-R1, R9, R11, R12 및 R16)을 확인했다. 속도가 대조군 (75분의 22) 29.3 % 인 반면 전체 용어 키트 / 전체 배아로서 산출 기간 비율은 14.5 % (145분의 21)이다. 총 KO 키트 / 총 기간으로 계산 KO 율은 23.8 % (5 / 21)입니다. 하나 KO 키트 (APOC-R16)는 5 일, 산후 (20.0 %, 2 / 10)를 사망했다. 타겟팅 사이트 indelsat 두 삽입과 세 개의 삭제를 포함, 그들은 토끼 각각 # R1, R9, R11, R12, 및 R16 (그림 4B)에 대해,, +1, +1, Δ20 및 Δ21을 areΔ1. 양성이전 17 설명한대로 oinformatics 분석, 1 순서를 설정하는 7 개 이하의 불일치와 오프 대상 가능성 ZFN을 식별하는 데 사용되었다. 하나만 14 번 염색체 상에 위치 가능한 오프 목표 부위를 예측은 7 일치 BPS로 확인되었다. PCR 분석은 창업자의 동물 중 하나에 오프 대상 이벤트를 감지하지 않습니다.

유전자 타겟팅 도구의 최근 발전은 녹아웃의 생산 (KO) 토끼가 가능하게한다. 본 연구에서는 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)를 사용하여 다섯 아포 지질 단백질 (아포) C-III KO 토끼를 생성합니다. 이 작품은 ZFN은 KO 토끼를 생산하는 매우 효율적인 방법이라고 설명했다.

징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 C-III 녹아웃 토끼의 생산

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 심혈관 질환 연구를 위한 새로운 토끼 모델을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 표적 유전자를 겨냥하는 zinc finger nucleases를 설계하고 합성함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 ZFN RNAs를 전핵기(Pronuclear stage) 배아의 세포질에 미세 주입하는 것입니다.세 번째 단계는 배아를 수혜자 토끼에게 외과적으로 이식하는 것입니다. 마지막 단계는 신생 토끼의 유전자형을 분석하여 형질전환 동물을 식별하는 것입니다. 전반적으로 ZFN을 통한 유전자 타겟팅은 매우 효과적이며, 여기서는 A OC three knockout 토끼를 제작함으로써 이를 입증하였습니다.이 기술은 유전자 공학의 획기적인 이정표로, 코드 없는 토끼(no-code rabbit)의 생산을 최초로 가능하게 했습니다. 이 기술의 영향은 심혈관 질환과 같은 많은 인간 질병의 치료로 확대됩니다. 인간의 생리와 병리를 더 잘 모방하기 위해 대동물 모델이 필요하다는 인식이 점점 더 커지고 있습니다.우리는 2009년에 보고된 red에서의 유의미한 뉴클레아제를 이용한 성공적인 유전자 타겟팅 관련 논문을 읽었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 일반적으로 이 방법을 아는 사람들은 컨스트럭트의 세포질 미세주입이 포함되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 비록 이 방법이 토끼의 유전자 타겟팅에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 돼지와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.성적으로 성숙한 뉴질랜드 화이트 토끼를 준비하고, 3일 동안 하루 두 번 FSH를 피하 주사하여 과배란을 유도하며, 이때 투여량은 매일 증량합니다. 마지막 FSH 주사 72시간 후, HCG 200 IUs를 정맥 주사하여 개별적으로 배란을 유도하고, 직후에 과배란된 암컷을 준비합니다. 이 시점에 수용 동물 또한 함께 준비되어야 합니다.인공수정 16~18시간 후, 과배란 유도된 공여 토끼를 소듐 펜토바르비탈로 안락사시킵니다. 자궁 전체를 조심스럽게 채취하여 UCT를 회수합니다. 자궁각 및 난소 구조를 유지하며, UCT의 자궁 쪽 끝에서 조작 배지를 주입하여 각 UCT를 10 milliliters의 조작 배지로 플러싱합니다.UCT의 난소 끝단에서 배출된 배지를 페트리 접시에 수집하십시오. 회수된 배아는 배출된 배지 내에 들어 있습니다. 다음으로, 조작 배지를 사용하여 배아를 3회 세척하십시오.그 다음 배아를 일반 공기 조건의 38.5 °C 조작 배지에서 배양합니다. 수정 후 19~21시간이 되었을 때, 실체 현미경을 사용하여 배아를 선별합니다.각 주입 조건당 전핵기 단계의 배아를 약 30개씩 수집하며, 과배란 유도된 암컷 한 마리당 30~40개의 해당 배아를 얻을 수 있을 것으로 예상됩니다. 사전에 제조사로부터 표적 유전자에 대한 ZFN 세트를 확보하십시오.가장 우수한 ZFN 점수를 가진 것들을 선택합니다. 이 예시에서 관심 유전자는 A OC three입니다. ZFN mRNA를 준비하려면, 먼저 ZFN messenger RNA를 인비트로(in vitro) 전사하고 전사체를 폴리아데닐화합니다.다음으로, 생성된 mRNA를 정제하고 0.1 xte E RNA spree에 현탁합니다. 그 후 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고, 저장용 10 µL 바이알에 ZFN 쌍을 인코딩하는 mRNA를 4~10 ng/µL 농도로 분주하여 준비합니다. 미세주입 스테이지를 38 °C로 가열하는 것부터 시작하십시오.미세주입 플랫폼을 준비하려면, 먼저 1-웰 챔버 슬라이드에서 배양 챔버를 제거한 다음, 슬라이드에 조작 배지 5 µL 한 방울을 떨어뜨리고 미네랄 오일로 덮습니다. 준비된 슬라이드를 가열된 현미경 스테이지 위에 놓습니다.다음으로, 직경 120 micron의 홀딩 피펫을 마이크로 조작기에 고정하고 플랫폼 위의 배지 방울 속으로 피펫을 위치시킵니다. 이제 주입할 mRNA를 얼음 위에서 해동합니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관으로 제작한 주입 피펫에 mRNA를 로딩합니다.다음으로 마이크로 인젝터에 연결된 압축 공기 공급 장치를 켭니다. 그 다음, 주입용 피펫을 홀더에 고정하고 이를 두 번째 마이크로 조작기에 부착합니다. 이 피펫 또한 배지 방울 내부로 위치시킵니다.이제 마이크로 인젝터의 주입 부피를 1~5 picoliters로 설정하십시오. 주입 피펫의 팁을 열기 위해, 홀딩 피펫에 대고 가볍게 두드립니다.유리 피펫을 사용하여 30~50개의 배아를 미세 조작 장치로 옮깁니다. 플랫폼 위에 떨어뜨린 후, 100배 배율로 관찰합니다.홀딩 피펫을 사용하여 배아를 포획합니다. 이제 400배율 하에서 홀딩 피펫과 배아를 주입 바늘에 맞춥니다. 주입 피펫을 배아 내부로 진입시킵니다.핵을 건드리지 않도록 주의하십시오. 세포막을 관통하면 풋 페달을 눌러 mRNA를 주입하고, 주입 후 바늘을 뽑아 배아를 방출하십시오. 나머지 모든 배아에 대해 이 과정을 반복하십시오.모든 주입이 완료되면, 배아 배양액으로 배아를 30초씩 3회 세척합니다. 그 후, 동기화된 수용묘로 배아를 이식하기 전까지 38.5 °C, 5% carbon dioxide 공기 조건에서 1~2시간 동안 배아를 배양합니다.암컷 토끼. 배아를 포배 단계까지 배양하려면 인큐베이터에 가습 공기가 제공되어야 합니다. 건강 상태가 양호하고 체중이 4~5kg인 5~12개월령의 NZW 암컷 토끼를 선택하십시오.먼저 성선자극호르몬 방출호르몬을 근육 내로 투여하여 수용 동물을 준비합니다. 호르몬 주사 후 16~24시간이 지나면 케타민 또는 기화된 이소플루레인으로 토끼를 마취합니다. 토끼가 완전히 의식을 잃으면 발 반사가 나타나지 않습니다.수술 전 발바닥을 압박한 후, 안연고로 눈을 보호하고 복부를 준비합니다. 수술 중에는 토끼의 활력 징후를 기록하십시오. 15분마다 피부를 통해 약 2.5 centimeters 정도 절개한 다음 근육층을 따라 절개하며 시작합니다.엄지와 검지로 난소를 잡고, 부착된 자궁각과 함께 각 난소를 외부로 노출시킵니다. 멸균 피펫을 조심스럽게 삽입하여 배아를 난관으로 옮깁니다. 일반적으로 주입된 배아 30개당 10개에서 25개의 배아가 생존 가능하며, 이들을 모두 하나의 수용체에 이식할 수 있습니다.코팅된 흡수성 봉합사로 근육층을 봉합하여 수술을 마무리합니다. 피부는 흡수성 피하 봉합사 또는 단순 단속 비흡수성 피부 봉합사로 봉합합니다. 그 후 동물을 따뜻하게 유지하며 의식을 회복할 때까지 관찰합니다.리컴번트 상태가 달성되었다. 초기에 16쌍의 ZFN이 설계되었다. 첫 번째 세트의 표적 파괴 서열은 OC 세 세트 중 엑손 2에 위치한다.세트 1, 2, 3을 선정하여 효모 MEL1 리포터 분석법으로 ZFN 활성을 측정하였다. 그 결과, 세트 1의 ZFN 점수가 세트 2 및 3보다 224.2% 더 높았으며, 내부 양성 대조군의 50%인 선정 임계값보다 훨씬 높게 나타났다. 따라서 세트 1을 in vitro 검증 실험 대상으로 선정하였으며, 세트 1 mRNA를 35개의 토끼 배아에 미세 주입하였다.미세 주입군의 BL 비율은 미세 주입을 하지 않은 군에 비해 낮게 나타났으며, 이는 발달 능력이 약간 저하되었음을 나타냅니다. 미세 주입군의 배아 중 18개가 5일째에 BL 단계까지 발달하였으며, 그중 16개에 대해 시퀀싱을 수행하였습니다. 표적 부위에서의 4가지 돌연변이 빈도는 선택 임계값보다 훨씬 높았으며, 이는 첫 번째 ZFN 쌍이 효과적이었음을 보여줍니다. 총 145개의 배아가 사용되었습니다.set one ZFN mRNA를 미세 주입한 배아를 7마리의 가임기 수용 토끼에 이식하였습니다. ZFN 미세 주입을 하지 않고 갓 세척한 배아를 대조군으로서 수용 토끼에 이식하였으며, 임신 30일 후에 분만이 이루어졌습니다. 미세 주입군에서는 21마리의 새끼 토끼가 태어났습니다.PCR 시퀀싱을 통해 5마리가 양성 녹아웃으로 확인되었습니다. 표적 부위의 인델(indel)로는 2건의 삽입과 3건의 결실이 포함되었습니다. 생정보학 분석을 사용하여 세트 1 서열과 미스매치가 7개 이하인 잠재적 ZFN 오프 타겟을 확인한 결과, 단 하나의 가능한 오프 타겟 부위만 식별되었으며, PCR 분석 결과 파운더 동물 어느 개체에서도 해당 부위의 변이가 검출되지 않았습니다.이 영상을 시청하십시오. 아연 핑거 핵 미세주입법(zinc finger nucleus microinjection)을 통해 녹아웃 토끼를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.배아 수집, 미세주입 및 이식 과정에 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 주입 물질이 각별한 주의가 필요한 RNA라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 표적 유전자의 생물학적 규칙을 이해하기 위해 표현형 분석이 수행될 것입니다.

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

연구

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Medicine

의학

CompoZr 정의 아연 핑거 Nuclease (ZFN) 서비스는 사용자가 정의한 모든 현장에서 모든 유기체 또는 세포 라인의 정밀 게놈 수정을 가능하게합니다. 이 문서 CompoZr 정의 ZFN 서비스의 설계, 제조, 검증 및 구현을위한 프로세스를 설명합니다.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

우리는 다낭성 신장 질환의 가능한 제브라피시 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 신장 구조를 시각화하기 위해 Tg(wt1b:GFP) 물고기를 사용했습니다. wnt5a의 넉다운은 모르폴리노 주입에 의해 이루어졌습니다. wnt5a 녹다운 후 Pronephric 낭종 형성이 이 GFP 형질전환 제브라피시에서 관찰되었습니다.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운 wnt5a Zebrafish의 신장의 낭종 원인

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

학습하세요 아포지단백 C-III 녹아웃 토끼 생산 방법을 징크 핑거 뉴 클레아 제를 이용하여 심혈관 질환 연구에 활용하는 기술입니다. 이 방법은 대형 동물 모델 유전자 편집에 효율적입니다.

징크 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여 아포 지단백 C-III 녹아웃 토끼의 생산

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