성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

본 절차의 전반적인 목표는 이전에 기술된 두 가지 광유도 망막 변성 프로토콜을 결합하여 망막 전체의 간상 및 원추 광수용체 모두에 손상을 입히는 것입니다. 이는 먼저 암적응된 성체 제브라피쉬를 30분 동안 UV 광선에 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 UV 처리를 마친 물고기를 250W 할로겐 램프 4개로 둘러싸인 수조로 즉시 옮겨 최대 4일 동안 연속 광선에 노출시키는 것입니다.

마지막 단계는 물고기를 안락사시키고 추가 분석을 위해 안구를 적출하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 망막 전반에 걸쳐 간상 및 원추 광수용체가 일관되게 소실되었음을 보여줍니다. UV 광선 처리나 할로겐 램프 처리와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 이 두 가지 방법을 결합함으로써 망막 전체의 간상 및 원추 광수용체를 모두 절제할 수 있다는 점입니다.

광수용체 손상은 광범위한 증식 반응을 유도하며, 이는 궁극적으로 소실된 광수용체의 재생으로 이어집니다. 본 기술의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Jennifer Thomas가 진행하겠습니다. 우선, 거치대로 사용할 지름 15 centimeter 유리 페트리 접시를 뒤집어 실험대 위에 테이프로 고정하여 UV 광조사 준비를 합니다.

형광 실체 현미경에서 UV 광원 필라멘트를 제거합니다. 그다음, 뒤집어 놓은 페트리 접시 위에 UV 광원 필라멘트를 테이프로 고정하고, 필라멘트 끝부분이 페트리 접시 밖으로 약 2 mm 정도 나오게 합니다. 이후 250 mL 유리 비커의 바닥면 측면과 뒷면의 절반을 알루미늄 호일로 감싸되, 호일의 빛나는 면이 비커 내부를 향하도록 합니다.

다음으로, 비커에 어류 시설 시스템의 물 100 milliliters를 채웁니다. 이 비커를 4 liter 비커 안에 넣습니다. 그런 다음 4 liter 비커에 물을 채워 수위가 250 milliliter 비커의 100 milliliter 표시선과 일치하도록 합니다.

최대 10마리의 암처리된 물고기를 250 milliliter 비커에 넣고, 250 milliliter 비커를 작은 알루미늄 호일 조각으로 덮습니다. 그다음 비커 장치 전체를 UV 필라멘트 바로 옆에 배치합니다. 필라멘트는 4 liter 비커의 외벽에 닿아 있어야 하며, 250 milliliter 비커의 노출된 부분을 향해야 합니다.

250 milliliter 비커가 4리터 비커 바닥의 중앙에 위치했는지 확인하십시오. 그 다음, 4리터 비커 뒤에 커다란 불투명 스크린을 배치하여 동물들은 노출되되 실험실 인원이 UV 필라멘트의 끝부분을 볼 수 없도록 합니다. 그런 다음 UV 전원을 켭니다.

타이머를 30분으로 설정하고, 부주의한 실험실 인원이 실수로 UV 방사선에 노출되지 않도록 필요한 경고 라벨을 부착하십시오. 30분 후 UV 전원을 끄십시오. 그런 다음 물고기가 들어 있는 250 milliliter 비커를 꺼내십시오.

이 절차에서는 250 milliliter 비커에 있던 물고기를 1.8 liter 투명 아크릴 수조로 옮깁니다. 다음으로, 할로겐 램프 광처리 구역을 설정하기 위해 수조의 오버플로우 표시선까지 물을 채웁니다. 두 개의 250 할로겐 유틸리티 램프를 같은 방향으로 수조에서 29 centimeters 떨어진 곳에 배치합니다.

그런 다음 반대편에도 동일한 방식으로 나머지 두 개의 램프를 배치하고, 두 램프 세트 사이의 간격을 약 73 centimeters로 유지합니다. 그 후, 광처리 구역 바로 바깥쪽의 두 램프 세트 중간 지점에 팬을 등거리에 배치합니다. 이어서, 광처리 구역 중앙의 두 램프 세트 사이 등거리에 물을 채운 1.8 liter 탱크 두 개를 배치합니다.

그런 다음 각 수조에 산소 공급기를 설치합니다. 팬과 가장 가까운 끝부분에 2cm의 간격을 두고 각 수조를 투명 아크릴 뚜껑으로 덮습니다. 팬이 이 간격 사이로 공기를 불어넣도록 배치하고, 한 곳 또는 두 수조 모두에 온도계를 설치합니다.

다음으로, 조명, 팬 및 에어레이터의 전원을 켭니다. 광처리를 최대 4일 동안 유지합니다. 광처리 기간 동안 물고기에게 먹이를 주지 않아야 하는데, 이는 수질에 영향을 미치고 동물에게 더 많은 스트레스를 유발하기 때문입니다.

온도와 수위를 매일 모니터링하고, 온도를 30~33°C로 유지하십시오. 필요한 경우, 팬 속도와 탱크와 조명 사이의 거리를 조절하십시오. 또한, 매일 각 탱크에 시스템 워터를 채워 주십시오.

할로겐 광처리를 시작한 지 48시간 후에 물고기를 처리 구역에서 꺼냅니다. 그다음, 고정액으로 사용할 신선한 에탄올 포르말린을 준비하고, 트리오판옥시에탄올(Tricaine oxy ethanol)을 과량 투여하여 제브라피쉬를 안락사시킵니다. 이후 안락사시킨 제브라피쉬를 종이 타월 위로 옮긴 다음, 곡선 핀셋을 사용하여 안구를 적출합니다.

핵이 있는 안구와 고정액을 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하여 동결 보호합니다. 안구를 보호하십시오. 실온에서 5% sucrose 1X PBS로 30분 동안 세척합니다.

그런 다음 이를 신선한 5% sucrose, 1X PBS로 교체하고 안구를 2시간 동안 유지합니다. 2시간 후, 4°C에서 하룻밤 동안 30% sucrose, 1X PBS로 안구를 세척합니다. 다음 날, 4°C에서 하룻밤 동안 조직 동결 보존액과 30% sucrose, 1X PBS 용액을 1:1 비율로 혼합한 용액으로 안구를 세척합니다.

그 후, 조직 동결 매질 100%에 안구를 배측-복측 축(dorsal ventral axis)에 맞춰 매립합니다. 그런 다음 조직의 동결 절편을 만들기 전, 최소 2시간 동안 -80 °C에서 보관하십시오. 이제 조직을 동결 절편하여 유리 슬라이드 위에 올립니다.

그런 다음 슬라이드를 55 °C에서 2시간 동안 가온합니다. 그 후 슬라이드를 -80 °C에서 보관하거나 즉시 표준 면역조직화학 염색을 수행하고 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다. 이 그림은 다양한 빛 손상 패러다임에 따른 증식 반응의 변화를 보여줍니다.

다음은 성체 알비노 제브라피시의 망막 절편으로, 0시간 시점에서 서로 다른 빛 손상 패러다임 이후 망막의 등쪽과 배쪽 절반에서 세포 증식(빨간색으로 표시)을 보여주기 위해 PCNA로 면역 표지한 것입니다. 48 HLT에는 간세포층(interclear layer)에서 증식이 나타나지 않았습니다. 단일 전구 세포들은 등쪽 망막 전체의 INL과 배쪽 망막의 일부 영역에서 관찰되었습니다.

48 HPUV 시점에, 등쪽 망막에는 전구세포 기둥이 관찰된 반면, 배쪽 망막의 일부 영역에서는 단일 전구세포만 관찰되었습니다. UV plus 48 시점에는 등쪽 및 배쪽 망막 전반에 걸쳐 거대한 전구세포 기둥이 관찰되었습니다.

이 그림은 다양한 빛 손상 패러다임에 따른 색소 제브라피쉬의 간상 및 원추 광수용체 손실을 보여줍니다. 여기에는 각 빛 손상 패러다임 이후 핵을 파란색으로 나타내기 위해 Pro three로 염색하고, 간상 세포 외절을 마젠타색으로 나타내기 위해 zpr R three로, 또는 이중 원추 세포를 금색으로 나타내기 위해 zpr R one으로 면역 표지한 망막 절편들이 제시되어 있습니다. 48 HLT의 배측 망막과 UV plus 48 HLT의 배측 및 복측 망막에서 간상 광수용체 핵의 유의미한 감소가 관찰되었습니다.

48 HPUV에 배측 망막의 핵들이 비대해졌음에도 불구하고, 48 HLT 또는 48 HPUV에서 이중 원추세포 핵의 유의미한 감소는 나타나지 않았습니다. UB 이후 8 H lt에는 배측 및 복측 망막에서 핵의 유의미한 감소가 관찰되었습니다. 이 절차를 유전자 특이적 약리적 억제제 또는 in vivo 단백질 넉다운과 같은 다른 방법들과 결합하면 개별 유전자의 역할과 광수용체 퇴화 및 그에 따른 재생 반응을 밝힐 수 있습니다.