Name: 성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 성인 zebrafish 망막 재생 연구를 위한 비침습적 광손상 유도 방법입니다. UV 광선과 할로겐 램프를 연속 조사하여 막대세포와 원추세포를 동시에 손상시키고 면역형광 현미경으로 광수용체 손실을 분석합니다.

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저자는 훌륭한 물고기 사육 및 기술 지원 시샤 루오에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 건강 보조금 R21EY019401 (RT)와 P30EY04068 (RT)의 국립 연구소에 의해 자금 지원, 그리고 웨인 주립 대학 안과학 교실에 실명을 방지하는 연구에서 제한 교부금 등, RT에 기금을 시작했습니다. JT는 웨인 주립 대학 대학원에서 제공하는 토마스 C. 럼블 원정대에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 의학의 웨인 주립 대학 대학원에서 동물 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 어두운 적응 <ol><li> 전송 어두운 인클로저에 일반 주택 시스템에서 10 성인 흰둥이 나 색소 물고기를 ~. 가능한 경우, 탱크를 통해 정상적인 물 흐름을 허용 zebrafish의 주택 모듈에 내장되어 어두운 인클로저를 사용합니다. (이러한 시스템을 사용할 수없는 경우, 산소와 생선을 공기에 쐬다을 확인하고, 완전히 어두운 인클로저에 물고기 탱크를 배치). </li><li> 10 일 동안 어둠 속에서 물고기를 유지합니다. 동물을 먹이거나 어두운 상자에 새로운 물고기를 추가 할 때, 빛의 긴 기간에 물고기를 노출 피하기 위해 가능한 한 빨리 이동해야합니다. </li></ol> 2. 자외선 노출 <ol><li> UV 소스의 전원이 꺼져 있는지 확인합니다. 형광 입체 현미경에서 UV 빛의 필라멘트를 제거합니다. <ol><li> 반전을 사용UV 필라멘트를위한 대와 같은 15cm 직경의 유리 페트리 접시 (또는 유사한 2cm 높이의 것). 실험실 벤치 페트리 접시 테이프. </li><li> 테이프 UV 라이트 필라멘트 반전 페트리 접시의 상단입니다. 정렬되도록 페트리 접시 필라멘트 돌출​​의 끝 ~ 2mm. </li></ol></li><li> 250 ML 유리 비커를 구합니다. 바닥의​​ ½, 측면, 다시 알루미늄 호일로 비커, 호일의 &quot;반짝&quot;면이 비커의 내부를 직면해야하는 커버. 비커를 졸업 한 경우, 노출 된 비커의 명확한 절반을 남겨 호일로 비이커의 말로 절반을 커버. </li><li> 물고기 설비 시스템 물 100 ㎖와 250 비이커를 입력합니다. </li><li> 4 L 비이커에 250 ML의 비커를 놓습니다. 수위도 250 ML의 비커 100 ML 물 줄 때까지 물 4 L 비이커를 입력합니다. </li><li> 250 비이커에 10 어두운 치료 동물의 최대를 추가합니다. 알루미늄 작은 조각에 250 ML의 비커 커버호일. </li><li> UV 필라멘트 바로 옆에 전체 비커 장치를 놓습니다. 필라멘트 4 L 비커의 외부를 만지고 250 비이커의 노출 부분을 직면해야한다. 250 비이커는 4 L 비커의 바닥 중앙에 있는지 확인합니다. </li><li> 노출되는 동물을 허용하지만, UV 필라멘트의 끝을 보는 모든 실험실 인력을 방지 4L 비커 뒤에 큰, 불투명 한 화면에 배치합니다. 경고 :이 장벽 UV 소스에 전원을 켜기 전에 위치에 있는지 확인하십시오. </li><li> UV 전원을 켭니다. 30 분 타이머를 설정합니다. 어떤 필요에 경고 라벨이 의심 실험실 직원이 실수로 UV 방사선에 자신을 노출하지 않도록 배치합니다. </li><li> 30 분 후, UV 전원을 차단합니다. 물고기와 250 비이커를 제거합니다. 참고 : UV 노출의 여러 라운드가 필요한 경우, 노출 프로토콜을 반복하기 전에 (~ 20 분) 아래로 전원을 식히십시오. t를 교체해야합니다그는 각각의 노출 신선한 시스템 물 물 100ml. 4 L 비이커에 물을 교체 할 필요가 없습니다. </li></ol> 3. 할로겐 램프 빛 노출 <ol><li> 1.8 L 명확한 아크릴 수조로 250 비이커에서 물고기를 전송합니다. 오버 플로우 표시로 탱크를 채우십시오. </li><li> 할로겐 램프 빛 치료 영역을 설정합니다. 철물점에서 네 개의 250 W의 할로겐 유틸리티 램프를 얻습니다. 같은 방향에있는 두 개의 램프를 직면하고, 중앙에 떨어져 29cm를 정렬합니다. 비슷한 방식으로 다른 두 개의 램프를 정렬합니다. <ol><li> 그들은 램프의 두 세트 사이에 ~ 73cm를 떠나, 램프의 첫 번째 집합을 직면되도록 램프의 두 번째 세트를 놓습니다. 이 29 X 73cm의 직사각형 모양의 조명 치료 영역을 만듭니다. </li></ol></li><li> 철물점에서 작은 팬을 구하십시오. 그냥 가벼운 치료 영역의 외부 램프의 두 집합 사이의 등거리 팬을 놓습니다. </li><li> 의 중앙에 물이 가득 두 개의 1.8 L 탱크를 배치램프의 두 집합 사이의 등거리 빛 치료 영역. 램프와 탱크의 외부 벽 사이의 거리 ~ 29cm이어야한다. 참고 : 하나의 1.8 L의 탱크에 10 물고기를 치료하는 경우에도이 배열을 사용합니다. 두 탱크는 적절한 범위 내에서 각 탱크의 물 온도를 유지하기 위해 필요합니다. </li><li> 각 탱크에 산소 통풍 장치를 놓습니다. </li><li> 팬에 가장 가까운 끝 부분에 1 ~ 2 센티미터 간격을두고 명확한 아크릴 뚜껑 각 탱크를 포함한다. 는이 틈새에 공기를 불어되도록 팬을 정렬합니다. 탱크 중 하나 또는 둘 모두에 온도계를 놓습니다. </li><li> 빛, 팬 및 에어 레이터의 전원을 켭니다. 최대 4 일을위한 가벼운 치료를 유지합니다. 이 동물에 더 많은 스트레스 수질과 결과에 영향을 미치기 때문에 물고기, 빛 치료 기간 동안 공급 할 수 없습니다. </li><li> 매일 온도와 수위를 모니터링합니다. 30-33의 온도를 유지 ° C. 필요한 경우, 팬 속도 및 / 또는 탱크와 리 사이의 거리를 조정ghts. <ol><li> 필요에 따라, 일반적으로 일상적인 시스템 물 각 탱크 떨어져 꼭대기. </li><li> 항상 거의 100 %의 생존율을 유지하기 위해 건강한 성인 zebrafish의를 (연령 일반적으로 6-9개월)를 사용합니다. 물고기 탱크에서 시체로 발견되는 경우, 즉시 제거하고 전체 탱크에 물을 교체합니다. </li></ol></li></ol> 4. 조직 컬렉션 <ol><li> 할로겐 빛 치료의 발병 후 48 시간이 치료 영역에서 물고기를 제거합니다. <ol><li> 신선한 에탄올 포름 알데히드 정착액 (1 일부로 37 % 포름 알데히드, 9 부품 100 % 에탄올)을 준비합니다. </li><li> 2 페녹시 에탄올 (0.4 ㎎ / L)의 마취제 과다 복용으로 제브라 피쉬를 안락사. </li><li> 종이 타월로 안락사 제브라 피쉬를 전송합니다. 곡선 집게를 사용하여 눈을 명백히. </li><li> 4 ° C.에 정착하고 저장 O / N에 탈핵의 눈을 배치 </li></ol></li><li> 눈을 Cryoprotect. <ol><li> 실온에서 30 분 동안 5 % 자당 1X PBS에 눈을 씻고, 다음으로 대체2 시간 동안 신선한 5 % 자당 1X PBS. 다음, 4 ℃에서 30 % 자당 1X PBS O / N에 눈을 씻어 4 ° C.에서 조직의 냉동 중간 30 % 자당 1X PBS O / N의 1:1 (등분)로 눈을 씻어 </li></ol></li><li> -80에서 100 % 조직 동결 중간 저장소에 눈을 포함 ° C. 동양의 눈 있도록 조직의 cryosectioning 것은 지느러미 / 복부 축에서 수행됩니다. </li><li> 유리 슬라이드에 동결 절단 (Cryosections) 조직과 장소. 55 ℃에서 2 시간 동안 따뜻한 슬라이드 -80 매장 슬라이드 ° C 또는 즉시 표준 면역을 수행합니다. </li><li> 형광 현미경 40,51와 단면 조직 및 이미지의 표준 면역을 수행합니다. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 우리는 광범위한 광수 손실과 강력한 재생 반응의 지속적인 밝은 빛에 노출 결과로 짧은 UV 노출을 결합하는 것을 보여줍니다. 개인 LIRD 방법에 비해이 결합 된 방법은 또한 망막의 두 반쪽 막대와 원뿔 모두에 손상을 입힐 수있는 가장 효과적인 프로토콜입니다. 중요한 것은,이 치료는 색소 동물뿐만 아니라 흰둥이 동물 효과적입니다. 우리는 더 광범위하고 일관된 손상 결합 된 프로토콜 결과는 개별 LIRD 방법에 비해 증거를 제공하지만, 과학적 고려 LIRD 패러다임을 선택하기 전에 논의해야합니다. 우리의 데이터는 전체 망막 조직이 (즉, 단백질 체학, 실시간 PCR) 분석을 위해 수집 될 때 결합 방법을 이용해야하는 것이 좋습니다. 우리는 결합 방법은 할로겐 노출 뒤에 큰 병변의 크기, 그리고 마지막으로 UV 노출이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리는 제안차동 막대와 원뿔 재생에 영향을 미칠 수있는 유전자 또는 경로를 조사 할 때...

빛에 의한 망막 변성 (LIRD)는 일반적으로 설치류 피해로드와 콘 광수에 제브라 피쉬 모두에 사용됩니다. 성인 제브라 피쉬에서 시세포 변성 뮐러 아교 세포를 다시 입력 세포주기에 트리거 및 과도 증폭 조상을 생산하고 있습니다. 이 조상은 그들이 궁극적으로 새로운 광 수용체를 야기 손상된 영역에 마이그레이션으로 증식을 계속합니다. 현재, 두 널리 사용되는 LIRD 패러다임, 각각의 재생 반응 광수 손실 및 해당 차이의 정도를 변화 결과.가있다 더 많은 유전자와 약물 도구를 재생하는 동안 관심의 개별 유전자의 역할을 테스트 할 수있는만큼, 강력한 LIRD 패러다임을 개발할 필요가있다. 여기에서 우리는 LIRD 프로토콜을 설명하는 우리는 두 가지 이전에 설립 LIRD 기술의 사용을 결합했다하는로드와 콘 광수 모두의 광범위하고 일관된 손실됩니다. 게다가이 프로토콜은 LIRD 연구에 대한 흰둥이 배경에 관심 유전자 변형 라인을 유지하기 위해 필요가 없습니다 색소 동물에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>UV 광원</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시 (150 x 20mm)</td> <td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250ml 유리 비커</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4L 유리 비커</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250W 할로겐 램프</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 투명 아크릴 탱크</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 L 투명 아크릴 탱크 뚜껑</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>팬</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>통풍기</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>구부러짐 겸자(5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

빛에 의한 망막 변성 (LIRD)는 일반적으로 설치류 피해로드와 콘 광수에 제브라 피쉬 모두에 사용됩니다. 성인 제브라 피쉬에서 시세포 변성 뮐러 아교 세포를 다시 입력 세포주기에 트리거 및 과도 증폭 조상을 생산하고 있습니다. 이 조상은 그들이 궁극적으로 새로운 광 수용체를 야기 손상된 영역에 마이그레이션으로 증식을 계속합니다. 현재, 두 널리 사용되는 LIRD 패러다임, 각각의 재생 반응 광수 손실 및 해당 차이의 정도를 변화 결과.가있다 더 많은 유전자와 약물 도구를 재생하는 동안 관심의 개별 유전자의 역할을 테스트 할 수있는만큼, 강력한 LIRD 패러다임을 개발할 필요가있다. 여기에서 우리는 LIRD 프로토콜을 설명하는 우리는 두 가지 이전에 설립 LIRD 기술의 사용을 결합했다하는로드와 콘 광수 모두의 광범위하고 일관된 손실됩니다. 게다가이 프로토콜은 LIRD 연구에 대한 흰둥이 배경에 관심 유전자 변형 라인을 유지하기 위해 필요가 없습니다 색소 동물에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다.

지금까지 설명한 가벼운 치료 프로토콜은 LIRD의 각 방법을 비교 하​​였다. 어두운 처리 성인 흰둥이 동물 (그림 3-5)에서 개별 가벼운 치료는 크게로드의 손실 (그림 3)와 콘 (그림 4) 광수습니다. 그러나 두 개별 치료는 주로 비교적 가벼운 치료 (그림 3과 4)에서 보호 복부 망막을 떠나, 망막 등의 반 광수 손상. 또한, 할로겐 라이트 치료에 비해 자외선 치료는 망막의 지느러미 절반 (각각 C와 4B 그림을 비교) 더 콘 광수를 손상. 주로 N을 제거, 망막에 걸쳐로드와 콘 광수 모두에게 상당히 큰 손실을 초래 UV 할로겐 빛 치료를 결합망막의 복부 반 (그림 3과 4)의 europrotection. 결합 된 가벼운 치료 프로토콜을 사용했을 때 각각의 LIRD 방법과 비교하여, 확산에 상응하는 증가는 복부 망막에서 관찰...

복수의 가벼운 손상 프로토콜은 손상 광수를 설명하고 결과적으로 성인 zebrafish에있는 망막 재생 반응을 유도하고 있습니다. 이 프로토콜은 안료 동물에서 사용할 수있는 개선 된 방법을 설명하고 그로드하고 전체 망막에 걸쳐 콘 광수의 대부분을 손상.

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

본 절차의 전반적인 목표는 이전에 기술된 두 가지 광유도 망막 변성 프로토콜을 결합하여 망막 전체의 간상 및 원추 광수용체 모두에 손상을 입히는 것입니다. 이는 먼저 암적응된 성체 제브라피쉬를 30분 동안 UV 광선에 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 UV 처리를 마친 물고기를 250W 할로겐 램프 4개로 둘러싸인 수조로 즉시 옮겨 최대 4일 동안 연속 광선에 노출시키는 것입니다.마지막 단계는 물고기를 안락사시키고 추가 분석을 위해 안구를 적출하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 망막 전반에 걸쳐 간상 및 원추 광수용체가 일관되게 소실되었음을 보여줍니다. UV 광선 처리나 할로겐 램프 처리와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 이 두 가지 방법을 결합함으로써 망막 전체의 간상 및 원추 광수용체를 모두 절제할 수 있다는 점입니다.광수용체 손상은 광범위한 증식 반응을 유도하며, 이는 궁극적으로 소실된 광수용체의 재생으로 이어집니다. 본 기술의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Jennifer Thomas가 진행하겠습니다. 우선, 거치대로 사용할 지름 15 centimeter 유리 페트리 접시를 뒤집어 실험대 위에 테이프로 고정하여 UV 광조사 준비를 합니다.형광 실체 현미경에서 UV 광원 필라멘트를 제거합니다. 그다음, 뒤집어 놓은 페트리 접시 위에 UV 광원 필라멘트를 테이프로 고정하고, 필라멘트 끝부분이 페트리 접시 밖으로 약 2 mm 정도 나오게 합니다. 이후 250 mL 유리 비커의 바닥면 측면과 뒷면의 절반을 알루미늄 호일로 감싸되, 호일의 빛나는 면이 비커 내부를 향하도록 합니다.다음으로, 비커에 어류 시설 시스템의 물 100 milliliters를 채웁니다. 이 비커를 4 liter 비커 안에 넣습니다. 그런 다음 4 liter 비커에 물을 채워 수위가 250 milliliter 비커의 100 milliliter 표시선과 일치하도록 합니다.최대 10마리의 암처리된 물고기를 250 milliliter 비커에 넣고, 250 milliliter 비커를 작은 알루미늄 호일 조각으로 덮습니다. 그다음 비커 장치 전체를 UV 필라멘트 바로 옆에 배치합니다. 필라멘트는 4 liter 비커의 외벽에 닿아 있어야 하며, 250 milliliter 비커의 노출된 부분을 향해야 합니다.250 milliliter 비커가 4리터 비커 바닥의 중앙에 위치했는지 확인하십시오. 그 다음, 4

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

이 비디오는 레이저 손상을 사용하여 성인 제브라피시의 망막 변성을 유도하는 절차를 보여줍니다. 레이저는 망막의 광수용체 세포를 표적으로 삼아 세포 사멸과 퇴행성 과정을 유발합니다. 이 손상은 뮐러 신경교세포(MG) 세포를 활성화하여 망막 재생을 돕는 줄기세포 전구세포로 역분화시킵니다.

Targeting Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury(초점 레이저 손상을 사용한 제브라피시의 망막 퇴행 및 재생 모델링)

우리는 성체 제브라피쉬에서 망막 신경절 세포(RGC)를 역행하는 효율적인 방법을 소개합니다.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

신경 및 비 신경 질환의 많은 지브라 피쉬의 모델 성어보다는 배아 / 유생으로 연구되어 있기 때문에, 우리는 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수있는 양적 측면 라인 회생 분석법을 개발 하였다. 분석은 1) neuromast 2) 개별 머리 세포 수준의 해상도를하고있었습니다.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

여기에서 우리는 망막 있도록 지연 및 재생과 성인 제브라 피쉬에서 N 메틸 N의 -nitrosourea을 사용하여 시각 기능에 미치는 영향의 정량화를 보여줍니다. 시력의 손실 및 감소 감광체 번호는 내부 핵 층에 확산하여 관찰 하였다. 완전한 형태 학적 및 기능적 재생은 30 일 초기 치료 후 발생했습니다.

조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

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