Name: 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 배우세요 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 H7N9 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소와 뉴라미니다아제 단백질을 곤충 세포에서 발현하고 정제하는 방법을. 이 기술은 면역학 분석 및 백신 개발 연구에 활용됩니다.

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우리는 단일 클론 항체 CR9114 패트릭 C. 윌슨에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원래 A/Anhui/1/13 플라스미드에 제니퍼 Debeauchamp 리처드 웨비 감사합니다. 이 작품에 대한 부분 지원은 알레르기에 대한 국립 연구소에 의해 제공되고 전염성 프로그램 프로젝트 부여 AI097092-01A1와 CEIRS (인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 센터 HHSN26620070010C) 질병 - 투자되었다. FK는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에서 어윈 슈뢰딩거의 교제 (J 3232)에 의해 지원되었다.

1. 재조합 배큘로 바이러스의 생성 <ol><li> 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드에 복제 <ol><li> 복제 H7 HA 및 수정 pFastBac 전송 플라스미드에 N9 NA의 ectodomain (또는 다른 HA 또는 NA 유전자) (소개 참조). HA는 N-말단 헥사 도메인 및 hexahistidine 태그를 포함하는 C-말단 삼량 체화 도메인 및 hexahistidine 태그를 함유뿐만 아니라 NA 용 용 벡터는, (도 1) 1,10,11,22 설명되었으며로부터 요청 될 수있다 저자. 해설 : 삼량 도메인없이 표현 HA의 ectodomains 특히 줄기 도메인에서, 구조적 중화 항원의 손실로 이어지는, 잘못 접힌됩니다. 마찬가지로, NA의 효소 기능은 적절한 테트라에 의존합니다. </li><li> bacmids의 생성 배큘로 바이러스 표현식을 사용하여 따라 DH10Bac 박테리아에 HA 및 NA 유전자를 포함하는 배큘로 바이러스 전송 - 플라스미드를 변환제조업체의 지침에 따라 시스템. 분리 및 제조 업체의 지침 (그림 2)에 따라 Midiprep 키트를 사용하여 bacmids를 정화. </li></ol></li><li> 단백질의 발현 재조합 배큘로 바이러스 및 검증의 구조 해설 : 다음 단계는 층류 후드에서 무균 적으로 수행해야합니다. HA 및 NA (또는 그 어떤 다른 유전자)에 대해 독립적으로이 절차를 수행합니다. 곤충 세포는 일반적으로 CO 2없이 28 ° C에서 재배되고 있습니다. 이 프로토콜 인 Sf9 세포를 지시하지 않을 경우 10 % FBS, 1 % 펜 패 혈성 * 0.1 % 플루로 닉 F68 솔루션, 보충 전체 TNM-FH 곤충 세포 미디어에서 성장하고, 일주일에 두 번 1:4 계대 있습니다. 하이 파이브 세포 SFX 혈청이없는 배지에서 재배하고 일주일에 두 번 1:15 계대 있습니다. * 항생제 첨가 프로토콜을 통하여 선택적으로 간주하고, 각 실험에 사용 된 방법에 따라 조정되어야한다. <ol><li> / cm 2 × 10 5 세포의 밀도로 6 - 웰 플레이트에 인 Sf9 곤충 세포를 플레이트와 (CO 2)없이 28 ° C 배양기에서 20 분 동안 앉아 보자. </li><li> 혼합 2 μg TNM-FH 배지 (혈청, 1 % 펜 연쇄상 구균)의 100 μL와 재조합 백 미드의 (conc. 0.5 ㎍ / UL). TNM-FH 배지 (혈청 무료, 펜 연쇄상 구균)의 100 μL로 형질 전환 제 6 μl를 섞는다. 두 개의 볼륨을 결합 부드럽게 섞어 실온 (형질 전환 혼합물)에서 20 분 동안 앉아 보자. 컨트롤로 한 모의 형질 (그림 3)를 포함합니다. </li><li> (세포가 이제 플레이트에 붙어 것) 및 펜 연쇄상 구균 (1 %)를 포함하는 혈청 TNM-FH 배지 2 ㎖로 대체 도금 인 Sf9 세포에서 뜨는을 제거합니다. (단계 1.2.2에서) 형질 전환 혼합물의 전체 볼륨을 추가하고 5 초 동안주의 깊게 6 잘 플레이트 바위. 6 시간 (그림 3)에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다. </li><li> 미디어 위스콘신 교체th 신선한 전체 TNM-FH 미디어 (10 % FBS, 1 % 펜 - Strep의 0.1 % 플루로 닉 F68를 포함). 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 배양한다. 현미경으로 때때로 세포를 확인합니다. 감염된 세포는 일반적으로, 라운드, 더 큰 나타 핵을 확대하였으며, (그림 4)를 분리하기 시작합니다. </li><li> 세포와 단백질 발현의 확인 수확 <ol><li> 상온에서 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포 육일 포스트 형질. 상층 액을 재조합 배큘로 바이러스를 포함 -이 바로 작동 주식을 생성하는 데 사용됩니다, 또는 몇 년 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 단백질 발현을 확인하기 위해 PBS 500 μL에 펠릿에 resuspend를 수집합니다. (환원제를 포함) SDS-PAGE 로딩 버퍼 50 μL와 현탁액의 50 μl를 섞는다. SDS-PAGE를 실행하고 유전자 발현을 확인하기 위해 안티 hexahistidine 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 모의에서 세포를 포함음성 대조군으로 형질 전환 (그림 3). </li></ol></li><li> 작업 주식의 준비 <ol><li> 판 5 × 5 인 Sf9 세포 / T175의 cm 2 플라스크 cm 2, 20 분 그들을 요리에 부착 할 수 있도록 방치. TNM-FH 미디어는 3 % FBS (1 % 펜 연쇄상 구균, 0.1 % 플루로 닉 F68)를 포함하는 완전한 TNM-FH 미디어를 교체합니다. </li><li> 구조의 상층 액 100 μL와 세포를 감염. 육일에 대한 CO 2없이 28 ° C 배양기에서 품어 세포가 감염 얻을 경우 가끔 확인한다 (단계 1.2.5에 설명 된대로.). </li><li> 5 분 상온에서 2,000 XG에 스핀과 상층 액을 수집합니다. 이 이제 P2의 재고입니다. 이 주식은 4 ℃에서 무한정 저장할 수 있습니다 세포를 감염 P2 주식 100 μl를 사용하여 감염의 절차를 반복합니다. 그 결과 주식은 P3 또는 4 ° C에 저장되거나 단백질 발현에 직접 사용할 수있는 작업 주식,라고합니다. P3의 주식은 보통 10를 포함 &lt;SUP&gt; 7 -10 9 패 단위 / ㎖을 형성한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 및 정제 해설 : 인 Sf9 세포는 잘 바쿨로 바이러스의 성장을 지원한다. 그러나, 재조합 단백질의 다량 분비하는 그들의 능력은 제한된다. 그러므로 우리는 분비 된 재조합 단백질의 발현에 대한 또 다른 곤충 세포주, 하이 파이브 세포를 사용합니다. 이 세포는 매우 높은 역가 13 배큘로 바이러스 복제를 지원하지만, 높은 분비 능력이 없습니다. <ol><li> 하이 파이브 세포를 성장 T175의 cm 2 플라스크에 SFX 곤충 세포 배양 배지에서 하이 파이브 세포를 성장. 항로 매일 1시 3분. 200 ㎖의 식 문화의 경우 5 합류 플라스크 성장을해야합니다. </li><li> 하이 파이브 세포를 수확하고 감염 <ol><li> 손으로 플라스크를 눌러 5 T175의 cm 2 플라스크에서 하이 파이브 세포를 분리합니다. 셀 suspe 수집nsion 및 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 12 분 동안 1,200 XG에 스핀. 경사 분리하여 상층 액을 제거하고 P3 주식의 15 ㎖에 그들을 재현 탁하여 알약을 결합한다. </li><li> (그림 5) 흐름 후드에서 15 분 동안 앉아 보자. </li><li> 깨끗하고 무균 1,000 ml로 흔드는 플라스크에 HyClone 사 SFX의 배지 200 ㎖로 이동 (고압 증기 멸균 전에 알루미늄 호일로 밀봉 buffles하지 않고, 이전에 세균 배양에 사용되지 않은해야합니다.) </li><li> 진탕 플라스크에 P3/cell 현탁액을 전송합니다. 쉐이커에 무균 알루미늄 호일 및 전송 플라스크 인감. 72-96 시간 동안 28 ° C에서 70 rpm으로 흔들어. </li></ol></li><li> 하이 파이브 세포 발현 상층 액에서 재조합 단백질을 수확 <ol><li> 500 ㎖의 원심 분리 버킷에 72-96 시간 후 감염 전송 배양 상층 액. 4 ℃에서 20 분 동안 5,500 XG에 스핀 그 동안 진탕 플라스크 두 번 증류수로 3 배 씻어(DDH 2 O). </li><li> PBS (한 200 ㎖의 배양에 필요한이) 45 mL를 50 ㎖ 튜브에 전송 3 ㎖ 니켈 수지 슬러리. 잘 흔들어서 10 분 동안 실온에서 3000 XG에 스핀. PBS를 가만히 따르다 펠릿을 유지합니다. 니켈 수지 펠렛과 곤충 세포의 상층 액을 혼합하고 이미 세척 통 플라스크에 옮긴다. (그림 6)을 흔들면서 2-4 시간 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 지원 스탠드에 클램프 산 10 ㎖ 폴리 프로필렌 열. 두 캡을 제거하고 (폐기물)를 통해 흐름을 수집하기 위해 열 아래 비커를 놓습니다. 통 밖으로 흔드는 플라스크를 타고 칼럼에 뜨는 / 슬러리 혼합물을 전송하기 시작, 그것은 니켈 수지를 유지하고 만 상등액을 통해 흐를 것이다. 열을 통해 전체 볼륨 (그림 7)를 전달합니다. </li><li> 세척 완충액 15 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 20 mM의 이미 다졸, 산도 8)과 수지의 4 배를 씻으십시오. 모든 세척 버퍼 드레인에게하자열에서 캡 (아래쪽)를 닫습니다. </li><li> 용출 버퍼의 2 ㎖ (50 mM의 나 2 HCO 3, 300 밀리미터의 NaCl, 300 mM의 이미 다졸, 산도 8)을 추가하고 5 분 동안 앉아 보자. 열을 열고 용출액을 수집합니다. (용출 버퍼 8 ㎖의 총)이 3 번 이상 반복합니다. (그림 7) 흔들릴 때 단백질의 높은 농도를 포함 용출액은 일반적으로 폼을 보여줍니다. 가능하면 젖은 얼음에 용출액을 유지합니다. </li></ol></li><li> 버퍼 교환 및 농도 <ol><li> Prespin 15 ㎖의 한외 여과 원심 분리 장치 20 분 동안 4 ° C에서 3,000 XG에서 PBS (pH가 7.4-7.6)과 (HA / NA 30 kDa의 차단하지만 정제 된 단백질의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.) 스핀 컬럼으로 통해로드 용출액 흘러 버린다. 4 ℃에서 5 살균, 얼음 차가운 PBS의 ML 3,000 XG에 60 분 동안 스핀으로 채워 </li><li> 다시 통해 배출 흐름은 15 얼음 차가운 PBS의 ML, 4 ° C에서 3,000 XG에 60 분 동안 스핀 리필 이 proce를 반복한 번 더 두레. </li><li> 원심 분리기 밖으로 스핀 열을 가지고 버퍼 교환 농축 (일반적으로 200 μL)를 수집합니다. 이것은 매우 재조합 단백질을 농축한다. 살균 얼음 차가운 PBS 400 μL와 스핀 열을 씻어 농축이를 추가합니다. 항상 얼음에 집중하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 특성 및 품질 관리 <ol><li> 단백질 농도를 측정 농축 나누어지는을 가지고 선택의 단백질 정량 방법을 사용하여 측정합니다. PBS를 추가하여 1 ㎎ / ㎖의 단백질 농도를 설정하고 -80 ° C.에 작은 분량 씩 동결 동결 해동 사이클은 단백질 구조를 손상과 통합으로 이어질 수 있습니다. </li><li> SDS-PAGE와 쿠마시 염색 SDS-PAGE에 단백질의 500 NG를 실행하고 쿠마시 염색을 수행합니다. 빠르고 편리하게 염색을 위해 전자 프로토콜과 함께 쿠마 시약을 사용합니다. HA 단백질은 일반적으로 64에서 나타나는kDa의 NA 단백질은 약 56 kDa의 (그림 8A와 B)의 크기로 실행해야합니다 반면. 설명 된 프로토콜을 사용하면 모든 해산물을 볼 수 없습니다. 저하가 발생하면 일반적으로 표현하는 동안 효모 / 곰팡이 오염의 표시이다. 이 경우 절차를 반복하고 멸균 모든 것을 유지해야합니다. </li><li> 웨스턴 블롯 / ELISA 단백질의 신원을 확인하기 위해 우리는 특정 항체로 웨스턴 블롯 또는 ELISA 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이상적으로, ELISA 분석 실험은 형태 적 항원 (예 : 항-HA 줄기 항체 1)에 결합하는 항체로 수행됩니다. 이러한 항체를 이용한 단백질의 정확한 폴딩 (도 8C)를 확인할 수있다. </li><li> 활동 NA 측정 바이러스 NA의 정확한 폴​​딩 또한 NA 활성을 측정함으로써 결정될 수있다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 NA * STAR의 분석을 (단지 사용자의 지침을 따르십시오)를 사용하여이 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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<li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
</ol>

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배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 발현이 곧장 앞으로 일반적이지만, 고려해야 할 여러 가지 중요한 점이있다. 서론에서 지적한 것처럼 그것은 HA와 NA의 ectodomains이 각각 삼량 또는 테트라 도메인과의 융합으로 표현되는, 중요합니다. 이 도메인은 일반적 ectodomain 표현하면 존재하지 않는 횡단 도메인의 도움으로 분자의 정확한 폴​​딩을 보장합니다. 예를 들어, 삼량 도메인없이 HA의 ectodomain의 표현은 올리고머와 줄기 도메인에 중요한 중화 에피토프의 불안정으로 이어집니다. 또한, 단백질의 안정성이 감소하고 곤충 세포 및 바큘로 바이러스 프로테아제에 의한 열화가 발생된다. 삼량 또는 테트라 도메인의 선택은 덜 중요하다 이르기까지 그들 중 다수 류신 지퍼 도메인 22T4 파지 foldons에 (11)는 지금까지 테스트 한 모두가 만족스러운 결과를 보여 주었다. 그것은 multibasic...

중국에서 새로운 H7N9 인플루엔자 바이러스 균주의 최근 출현에 첫 번째 응답으로, 우리는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)의 처음 두 균주의 유전자에 대한 게놈 서열을 운반하는 플라스미드를 취득했다. 우리는 신속하게 곤충 세포에서 재조합 HA와 NA의 생산 배큘로 바이러스 발현 벡터를 구축 할 수 있었다 이러한 플라스미드를 사용하여. 이 발현 시스템은 잘 실험실에 설립되어 지속적인 연구 프로젝트 1-8의 많은 중요한 입증되었습니다. 곤충 세포는 올바르게 접혀 사후 병진 복합 단백질을 수정할 수있다. 이러한 수정은 많은 바이러스 당 단백질에 중요한 N-결합 글리코 실화를 포함한다. 따라서, 그것은 배큘로 바이러스 시스템이 꽤 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현하는 확립되는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, HA 및 NA 결정 구조의 많은 곤충 세포 발현 된 단백질을 사용하여 9-11 해결되었다. 또 다른 장점강한 폴리 헤드린 프로모터로부터 바이러스 감염 구동 식의 결과 - 시스템 (50 개 이상의 서로 다른 HA 단백질과 우리의 경험을 바탕으로) HA / L 세포 배양의 최대 30 밀리그램의 신뢰성 높은 단백질 수율에 자리 잡고 있습니다. HA 및 NA 단백질의 막 횡단 및 endodomain 제거하여 단백질 secretable, 수용성 버전의 발현을 허용하고 따라서 크게 정제 공정을 용이하게한다. 또, 이러한 ectodomains는 hexahistidine 태그 된 따라서 니켈 2 +-수지를 사용하여 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다. HA 및 NA 단백질의 막 관통 도메인은 각각 homotrimer 및 homotetramer 형성에 기여한다. 이러한 oligomerizations을 유지하기 위해, 우리는 HA-, 및 NA에 N-말단 테트라 도메인 (그림 1) 생성에 C-말단 삼량 도메인을 추가합니다. 우리는 삼량 도메인 기능,하고 당연한를 안정 결론적으로 보여 주었다HA 1의 줄기 영역에 구조적 에피토프를 rved. NA의 올바른 테트라는 접는 및 NA 기능 10를 해결하는 데 기여할 수 있습니다. 삼량 또는 테트라 도메인을 품고 시퀀스와 baculo 전송 벡터는 저자 또는 필드, 9,10,12의 다른 실험실에서 요청하실 수 있습니다. 곤충 세포에서 분비되는 단백질의 발현을위한 또 다른 중요한 문제는 바로 세포주의 선택입니다. 스포 도프 테라 프 루기 페르가 인 Sf9 세포가 잘 배큘로 바이러스 복제를 지원하고 일반적으로 바이러스 구조 및 증식을 위해 사용되는 파생 동안, 단백질의 다량 분비하는 능력을 제한 하였다. Trichoplusia NI는 (일반적으로 하이 파이브로 알려진) BTI-TN-5B1-4 세포 유래 높은 분비 능력을 가지고 있고이 프로토콜 13, 14의 발현에 대한 선택의 세포주이다. 또한,이 소 태아 혈청을 감소 또는 제거하는 것이 도움이된다 (FB표현 문화의 S). 따라서 우리는 바이러스 일 주식을 성장에 대한 감소 (3 %) FBS 콘텐츠와 미디어를 사용하여, 우리는 혈청이없는 배지에서 단백질 발현을 수행합니다. 재조합 HA 및 NA 단백질은 많은 면역 학적 기술에 사용된다. 아마도 가장 일반적인 것은 사람이나 동물에 접종 4,6,7,15에 혈청 전환을 측정하기위한 ELISA 분석법이다. 가 및 NAS는 항체를 분비하는 세포 (16)에 대한 자극 분자 검출 시약 모두로 ELISPOT 분석 실험에 사용됩니다. 분자 미끼로서의 용도는 특별히 plasmablasts 또는 후 (치료) 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)를 분리하기 위해 사용될 수 B-세포의 다른 유형에 대해 정렬 할 수있다. 재조합 HA 및 NA 분자는 더 이상 이러한 단클론 항체 (8)의 특성 분석에 사용됩니다. 다른 예로는 pH가 안정 또는 수용체 특이성 다른 바이러스 균주에 의해 표명의, 또는 정량적으로 평가하는 특정 NA의 효소를 연구 포함억제제 활동이나 저항. 또한, 재조합, 정제 된 HA는 불 활성화 인플루엔자 바이러스 백신의 HA 함량을 표준화하기 위해 사용될 수있다. 중요한 것은, RHA (그리고 어느 정도 NA) 백신 후보는 현재 하나의 백신 후보 2013 2,17-19에 FDA에 의해 허가 된 상태 동물 모델과 인간의 임상 실험으로 테스트되고있다. 이러한 신규 한 백신의 장점으로 인해 이들 단백질의 재조합 특성으로 높은 성장 재조합 바이러스의 생성의 노동 집약적 공정이 회피 될 수 있다는 것이다. 아마도 더욱 중요한 자신의 HA의 수율이 높고 변형의 변형을 재현 할 수 있다는 사실입니다. 이 백신은 계란이없는 시스템에서 생산되기 때문에 또한, 그들은 계란 알레르기가있는 개인에 대한 문제가있다 단백질 오염 물질을 포함하지 않습니다. 여기서 우리는 새로운 중국어 H7N9 인플루엔자 바이러스, A / ANH의 두 균주에서 HA와 NA 단백질을 표현하기 위해 선택ui/1/13 및 A/Shanghai/1/13 (20, 21). 이들은 적시 예이지만 설명한 프로토콜은 임의의 인플루엔자 A와 B HA 또는 NA 단백질의 발현을 위해 사용할 수있는 다른 어떤 분비 된 바이러스 또는 세포 단백질을 표현하도록 할 수있다. 삼량 체 또는 사량 막 횡단 단백질은 각각, HA 및 NA에 사용되는 발현 카세트로 클로닝 될 수있다. 그러나, 대부분의 수용성 분비 세포 단백질은, 예를 들어 인터페론 같은 안정화를위한 추가 도메인을 필요로하지 않고, C-말단 hexahistidine 태그 전적으로 표현 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>재료명/장비</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>설명/설명</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus 발현 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>제조사 지침을 따르십시오</td></tr><tr><td>TNM-FH 곤충 매체</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Agarose Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 컬럼 (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>최대 효율 DH10Bac 박테리아</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 플라스미드 필터 Midiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>용출 및 세척 완충액</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cells</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 h7n9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을위한 강력한 도구이다. 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) - 여기서 우리는 독감의 제대로 접어 당화 버전의 바이러스 표면 당 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 예를 들어, 우리는 최근 중국에서 출현 한 새로운 H7N9 바이러스에 의해 표현 된 HA 및 NA 단백질을 선택했다. 그러나 프로토콜은 쉽게 다른 인플루엔자 및 B 바이러스 균주에 의해 발현 HA 및 NA 단백질을 위해 적응 될 수있다. 재조합 HA (RHA)와 NA (RNA) 단백질은 ELISPOT 및 ELISA와 같은 면역 학적 분석을위한 중요한 시약, 그리고 백신 표준화, 항체 발견, 분리 및 특성 분석을위한 다양한 프로그램도 사용합니다. 또한, 재조합 NA 분자는 작은 분자 억제제에 대한 화면으로 사용하고 NA의 효소 기능의 특성뿐만 아니라, 항 바이러스제에 대한 민감도에 유용하다 할 수있다. 재조합 HA 단백질은 또한 바이 아르NG는 동물 모델에서 실험적인 백신으로, 테스트 및 재조합 HA 기반의 백신은 최근에 인간에 사용하기 위해 FDA에 의해 허가했다. 그것은 빠르고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 우리는이 분자를 생산하기 위해 여기에 설명하는 방법은, 곧장 앞으로 인플루엔자 실험실에서 연구를 촉진 할 수 있습니다. 우리는 인플루엔자 바이러스의 표면 당 단백질에 초점 여기 있지만,이 방법은 또한 다른 바이러스 및 세포 표면 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다.

A/Shanghai/1/13 및 A/Anhui/1/13에서 HA 분자는 약 20 ㎎ / L 문화의 수율을 잘 표현했다. 두 균주의 NA 분자는 A/Shanghai/1/13 0.2 ㎎ / L의 문화에서 A/Anhui/1/13 0.7 ㎎ / L에 이르기까지 적당한 표현 수준을 보여 주었다. 네 개의 단백질 제제는 발현 수준에 의해 설명 될 수의 NA보다 높은 순도의 복지가와 (그림 8a 및 B) 불순물이없는 매우 작은이 있었다. A/Shanghai/1/13 HA 더욱 광범위 중화 스토킹 반응성 인간 단클론 CR9114 23 ELISA를 사용하여 분석 하였다. 이 단클론 항체는 줄기 도메인에 민감한 구조적 에피토프에 결합하고이 도메인의 정확한 접는 프로브로 여기에 사용됩니다. 항체는 HA가 참 (그림 8C) 제대로 접혀 있다는 확신을주는 바인딩을 잘 보여줍니다. 반대로 H7 마우스 폴리 클로 날 혈청은 ELISA 제 (H7...

여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

이 절차의 전반적인 목표는 면역학 분석 및 백신 접종 실험을 위해 올바르게 접힌 정제된 인플루엔자, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 표면 당단백질을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 인플루엔자 유전자를 운반하는 재조합 BMid를 클로닝한 다음 재조합 baula 바이러스를 생성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이러한 재조합 바울라 바이러스를 사용하여 곤충 세포에서 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 것입니다.다음으로, 재조합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 세포 배양 상등액에서 정제합니다. 마지막 단계는 우수한 품질과 생물학적 기능을 보장하기 위해 이러한 단백질을 특성화하는 것입니다. 궁극적으로 재조합 단백질은 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질에 대한 면역 반응을 조사하는 데 사용됩니다.예를 들어, HA one의 박테리아 발현과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 면역학적 분석을 위해 전체 바이러스 제제를 사용하는 것과 달리 정제된 항원이 교정 접히고 생물학적 활성을 유지한다는 것입니다. 이 시약을 사용하면 헤마글루티닌 단백질과 비뉴라미니다제 단백질에 대한 면역 반응을 측정할 수 있습니다. 단지 층류 후드 플레이트에서 무균으로 작동하는 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 재조합 바울라 바이러스의 생성으로 이 프로토콜을 시작하고, 200, 평방 센티미터당 000 세포의 밀도로 6개의 웰 플레이트에 있는 9개의 곤충 세포를 SF로 시작합니다.그리고 CO2가 없는 섭씨 28도의 인큐베이터에서 20분 동안 앉아 봅시다. 그런 다음 2마이크로그램의 재조합 백 미드를 100마이크로리터의 Trico Leia 무릎 중간 제형 HINK 또는 TNM fh와 혼합합니다. 그런 다음 6마이크로리터의 형질주입제와 100마이크로리터의 TNM FH 곤충 배지를 혼합합니다.두 부피의 혼합물을 부드럽게 결합하고 트랜스펙션 혼합물을 20분 동안 그대로 둡니다. 실온에서 하나의 모의 transfection을 대조군으로 포함하며, 여기에는 transfection 시약이 포함되지만 DNA는 포함되지 않습니다. 도금된 SF 9개 세포에서 SNAT를 제거하고 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액을 함유한 2ml의 무혈청 TNM FH 배지로 교체합니다.transfection 혼합물의 전체 부피를 세포에 추가하고 6웰 플레이트를 5초 동안 조심스럽게 흔듭니다. CO2가 없는 섭씨 28도의 인큐베이터에서 6시간 동안 배양합니다. 6일 동안 동일한 조건에서 플레이트를 배양하기 전에 배지를 새로운 전체 TNM FH 배지로 교체하십시오.때때로 현미경으로 세포를 확인하십시오. 감염된 세포는 일반적으로 더 크게 나타납니다. 더 둥글게 핵이 커지고 분리되기 시작합니다.형질주입 6일 후 2000G에서 실온에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액에는 재조합 baula 바이러스가 포함되어 있으며 즉시 작업 재고를 생성하는 데 사용되거나 수년 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. SDS 페이지 및 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 작업 원료를 준비합니다.SF 9 세포는 황반 바이러스의 성장을 매우 잘 지원합니다. 그러나 다량의 재조합 단백질을 분비하는 능력은 제한적입니다. 따라서 우리는 다른 곤충 세포주를 사용합니다.분비된 재조합 단백질의 발현을 위한 High five 세포. 이 세포는 balo virus가 높은 역가로 성장하는 것을 지원하지 않지만 매우 높은 분비 능력을 가지고 있습니다. 격일로 T 175제곱센티미터 플라스크 통로의 SFX 곤충 세포 배양 배지에서 하이파이브 세포를 성장시킵니다.1:3 비율로 나눕니다. 200ml 발현 배양을 위해 5개의 융합 플라스크를 성장시켜 상위 5개 세포를 수확하고 감염시킵니다. 먼저 플라스크를 두드려 하이파이브 셀을 분리합니다.세포 현탁액을 수집하여 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 1200G에서 7분 동안 튜브를 돌립니다. 디캔팅으로 상등액을 제거하고 리서스로 펠릿을 결합하여 15 밀리리터의 P 3 스톡에 현탁시킵니다.세포를 플로우 후드에 15분 동안 그대로 두십시오. 200ml의 고클론 SFX 배양 배지를 깨끗하고 멸균된 1000ml 셰이커 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음 P 3 셀 현탁액을 멸균 알루미늄 호일이 있는 셰이커 플라스크 씰로 옮긴 후 70RPM 및 28°C에서 72-96시간 동안 진탕합니다.감염 후 72-96시간에 하이파이브 세포 발현 상등액에서 재조합 단백질을 수확합니다. 배양 상등액을 500ml 원심분리 버킷으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 5, 500G에서 회전합니다.그 동안 셰이커 플라스크를 이중 증류수로 세 번 헹굽니다. 다음 피펫. 3밀리리터의 니켈 수지가 50밀리리터 튜브에 슬러리되어 배양 200밀리리터당 45밀리리터의 PBS가 있습니다.원심분리 후 3000G와 실온에서 10분 동안 회전하기 전에 잘 흔듭니다. PBS를 디캔팅하고 펠릿을 보관하십시오. 곤충 세포 상등액을 니켈 수지 펠릿과 혼합하고 이미 헹궈진 셰이커 플라스크에 옮깁니다.섭씨 4도에서 2-4시간 동안 흔들면서 배양합니다. 다음으로, 10ml 폴리프로필렌 컬럼을 지지 스탠드에 클램프로 장착합니다. 두 캡을 모두 제거하고 컬럼 아래에 비커를 놓아 흐름을 수집합니다.셰이커 플라스크를 배양한 후 상등액 슬러리 혼합물을 컬럼으로 옮기기 시작합니다. 그것은 니켈 수지를 유지하고 상등액만 흐를 것입니다. 전체 볼륨을 컬럼 위로 넘깁니다.15ml의 세척 버퍼로 수지를 네 번 세척합니다. 세척 버퍼가 컬럼에서 배출되도록 하고 캡으로 아래쪽을 닫습니다. 엘루시안 완충액 2ml를 넣고 5분 동안 그대로 둡니다.기둥을 열고 eit를 수집하고 가능하면 젖은 얼음 위에 보관하십시오. 이 작업을 세 번 더 반복합니다. 고농도의 단백질을 함유한 EIT는 일반적으로 완충액을 교환하고 단백질을 먼저 농축하기 위해 흔들면 거품이 나타나며, 3000G 및 섭씨 4도의 PBS로 15ml 초여과 원심분리 장치를 20분 동안 자유 스핀합니다.플로우 스루를 버리고 EIT를 스핀 컬럼에 로드합니다. 컬럼을 5ml의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS로 채운 후 동일한 조건에서 60분 동안 회전합니다. 흐름을 다시 배출하고 15ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 다시 채우고 추가로 60분 동안 회전합니다.이 절차를 한 번 더 반복한 다음 고농축 재조합 단백질을 나타내는 완충액 교환 농축액을 수집합니다. 농축액을 항상 얼음에 보관하십시오. 스핀 컬럼을 400마이크로리터의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS로 헹구고 이를 농축액에 첨가합니다.그런 다음 단백질은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 특성화할 수 있습니다. ENUE 및 상하이 균주에 의해 발현된 HA 및 NA 단백질은 상하이에서 수집된 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.2mg에서 인플루엔자의 경우 리터당 0.7mg에 이르는 중간 수준의 발현 수준을 보였습니다. 두 균주의 인플루엔자 A, 뉴라미니다아제 또는 NA 분자에 수집된 A는 상하이에서 수집된 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.2mg에서 인플루엔자 A의 경우 리터당 0.7mg에 이르는 중간 발현 수준을 보였습니다.4가지 단백질 제제 모두 불순물이 거의 또는 전혀 없었으며 ha's는 nas보다 순도가 높았으며, 이는 발현 수준으로 설명할 수 있습니다. 상하이 HA에서 수집된 인플루엔자 A는 광범위 중화 줄기 반응성 인간 단클론 항체 CR 9 1 1 4와 함께 ELI SA를 사용하여 추가로 분석되었습니다. 여기에서 파란색으로 표시된 바와 같이, 이 단클론 항체는 스톡 도메인의 민감한 확인 항원결정기에 결합하며 여기에서 이 도메인의 올바른 접힘을 위한 프로브로 사용됩니다.항체는 490나노미터에서 흡광도가 증가한 것으로 입증된 우수한 결합력을 보여주며, 이는 HA가 실제로 올바르게 접혔다는 확신을 줍니다. 두 번째로, 수득된 단백질이 아형 7 기원의 헤마글루티닌으로서의 동일성을 확인하기 위해 7형 마우스 다클론 혈청의 항헤마글루티닌을 사용한 Eliza를 수행하였다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 재조합 인플루엔자 바이러스, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 단백질을 발현하는 방법을 잘 이해하게 되었습니다.이 과정은 다른 바이러스 또는 세포막 단백질의 발현에도 유용할 수 있습니다. 당신의 실험에 행운을 빕니다.

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 센서 칩을 사용하여 두 분자 간의 상호 작용을 연구하기 위한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 대해 설명합니다. 공명 각도의 변화와 반사광의 강도는 두 분자의 결합 및 해리의 함수로 감지되며, 이는 두 분자 간의 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다.

센서 칩을 사용한 생체 분자 상호 작용을 연구하기 위한 표면 플라즈몬 공명

Kindlins는 인테그린을 ​​통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

배우세요 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 H7N9 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소와 뉴라미니다아제 단백질을 곤충 세포에서 발현하고 정제하는 방법을. 이 기술은 면역학 분석 및 백신 개발 연구에 활용됩니다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

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