레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

본 절차의 전반적인 목표는 주변 세포의 RNA 오염 없이 척수 운동 신경세포로부터 고품질의 RNA를 회수하는 것입니다. 이를 위해 먼저 척수를 회수하여 분할한 뒤, 동결 매립 매질에 넣어 매립하고 -160 °C에서 동결시킵니다. 두 번째 단계는 -20 °C에서 척수를 펜 막 슬라이드 위에 동결 절편으로 제작하는 것입니다.

다음으로, 슬라이드를 70% ethanol로 세척하고 70% ethanol에 희석된 Azure B로 염색합니다. 마지막 단계는 확인된 운동 뉴런 세포체를 guine thiocyanate 용해 버퍼로 레이저 캡처 미세 절단(laser capture micro dissection)하는 것입니다. 최종적으로, 결합된 용해물로부터 총 RNA를 추출하여 돌연변이 동물과 야생형 동물의 뉴런에서 일반적 또는 특이적 RNA 전사 차이를 분석합니다.

레이저 캡처 미세절제술(Laser capture microdissection)을 이용하면 수적으로 더 많은 교세포 및 기타 세포 유형의 오염 없이 척수 절편에서 운동 뉴런 세포체를 회수할 수 있습니다. 이를 통해 RNA를 준비하고 질환 동물과 정상 동물의 뉴런 간 전사 상태를 비교할 수 있는 기회가 제공됩니다. 이 절차를 개발하는 데 있어 가장 어려웠던 점은 레이저 캡처 전과 과정 중에 RNA 무결성과 추출 능력을 높은 수준으로 유지하면서, 척수 절편 내의 운동 뉴런을 검출할 수 있는 염색 방법을 찾는 것이었습니다.

우리는 Azure B와 70% ethanol로 절편을 염색하고, 분리한 세포체를 Guanidine Thiocyanate 용해 버퍼에 직접 수집하는 방법을 결합했을 때 이러한 기준을 충족한다는 것을 발견했으며, 이는 우리 실험실의 박사후 연구원인 Van Padia가 최상의 결과를 위해 절차를 입증한 것입니다. 안락사와 경심장 관류 후 모든 장비를 RNA 제거 용액으로 세척하고 이어서 RNA-free 70% ethanol로 세척하십시오. 척수를 조심스럽게 분리합니다. 척수를 RNA-free 용액으로 10초 동안 헹굽니다.

잔류 혈액을 씻어내기 위해 증류수로 세척한 후, RNA 분해효소가 없는 유리 슬라이드 위에 매우 조심스럽고 빠르게 놓습니다. 다음으로, 깨끗한 면도날을 사용하여 척수를 횡단 방향으로 9~10조각으로 나눕니다. OCT가 채워진 크라이오 몰드(cryo mold)에 조각들을 배치하고, 깨끗한 바늘을 사용하여 수직으로 정렬합니다.

액체 질소로 사전 냉각한 2-메틸부탄이 담긴 얕은 트레이에 몰드를 넣습니다. RNA 분해를 방지하기 위해 트레이를 액체 질소 배스(bath)에 넣습니다. 이는 척수 조각들을 급속 냉동하기 위함입니다.

절편 제작 전까지 OCT 임베딩 블록을 -80 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 절편 제작 준비가 되면, OCT 임베딩 블록을 냉각된 크라이오스탯(cryostat) 내에 배치하십시오. 각각 9~10개의 척수 횡단면을 포함하는 20 µm 두께의 절편을 제작하십시오.

RNA-free 펜 막(pen membrane) 위에 절편을 놓습니다. 절편이 잘 부착되도록 2µm 슬라이드를 처음에 상온으로 유지합니다. 그 후 크라이오스탯(cryostat) 내부의 -20°C 표면에서 절편을 즉시 다시 급속 냉동시킵니다.

슬라이드는 깨끗한 랙에 보관하며 사용 전까지 -80 °C에서 유지하십시오. RNA-free 70% ethanol을 채운 50 mL 원추형 튜브 6개를 준비합니다. 슬라이드를 담갔을 때 슬라이드 위의 모든 절편이 잠길 수 있도록 충분한 깊이여야 합니다.

다음으로 동일한 랙에 1% Azure B 용액을 배치합니다. 세척 또는 염색 중 용액을 교체하는 시간을 최소화하려면, 랙 앞에 실험실용 와이프 3~4개를 두어 여분의 용액을 빠르게 제거하십시오. 준비가 되면, -80 °C 냉동고에서 슬라이드를 꺼내 드라이아이스 위에 놓으십시오. 장갑을 낀 손바닥 위에 슬라이드를 올려 하나씩 해동합니다.

섹션을 건드리지 않도록 주의하며 랩 와이프로 닦아 슬라이드 위의 수분과 응축물을 대부분 제거합니다. 슬라이드를 페트리 접시에 담긴 새 실리카겔 건조제 위에 30~40초 동안 올려두어 완전히 건조시킵니다. 건조되면 슬라이드를 첫 번째 RNase-free 70% ethanol 튜브에 담급니다.

슬라이드를 30초 동안 담근 후, 45초에서 1분 동안 위아래로 흔들어 OCT를 씻어냅니다. 다음으로 슬라이드를 용액에서 꺼내 실험용 와이프로 여분의 액체를 닦아냅니다. 이 과정을 70% ethanol이 들어 있는 두 번째 튜브에 슬라이드를 담가 반복합니다.

척수 절편 주변에 OCT가 남아 있는 경우, 세 번째 튜브에서 세척 과정을 반복하십시오. 과잉 액체를 제거한 후, 슬라이드를 70% RNA-free 에탄올에 희석된 1% Azure B 용액에 30~45초 동안 담그십시오. 실험용 와이프로 과잉 Azure B 용액을 닦아내십시오.

이 단계에서는 슬라이드 전체가 파란색으로 변합니다. 슬라이드를 70% ethanol이 담긴 다음 튜브에 담그고 빠르게 3~4회 위아래로 흔들어 과잉 염색약을 제거함으로써 특정 운동 뉴런 염색이 보이게 합니다. 섹션이 너무 어둡게 염색된 경우, 새로운 70% ethanol 튜브에서 탈염색 단계를 반복하십시오.

염색이 너무 옅게 보인다면, 슬라이드를 Azure B 용액에 다시 32초 동안 담근 후 탈염색 과정을 반복하십시오. 염색 상태가 만족스럽다면, 슬라이드를 잠시 공기 중에서 건조시킨 후 다음 단계로 진행하십시오. DES 염색과 건조를 마치면 회백질은 연한 파란색으로 나타나며, 진한 파란색으로 염색된 운동 뉴런을 쉽게 확인할 수 있습니다.

현미경을 켠 직후 즉시 해부를 시작하십시오. 튜브 홀더를 비우고 0.6 millimeter 마이크로 원심분리 튜브의 캡을 부착하십시오. 시료 수집을 위해, guine 및 thiocyanate 용해 버퍼 30 µL를 캡에 넣고 용액을 펴 발라 표면을 덮어주십시오.

피펫 팁을 사용하여 캡을 구멍 및 대물렌즈와 일직선이 되도록 맞춥니다. 현미경 소프트웨어 상에서 레이저 캡처를 시작하기 전까지 캡을 덮인 상태로 유지하십시오. 공기 건조된 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 뒤집어 놓아, 멤브레인 면이 아래를 향하고 절편이 구멍과 일치하도록 배치합니다.

슬라이드를 고정한 후, 5x 대물렌즈로 척수 절편에 초점을 맞춘 다음 20x 대물렌즈로 변경하여 박리를 진행합니다. 먼저, 라이트 펜(light pen)을 사용하여 더미 영역을 표시하고, 이를 수집하지 않은 상태에서 레이저로 절단합니다. 이렇게 하면 막의 긴장이 완화되어 여러 영역을 연속적으로 표시하고 절단할 수 있습니다.

다음으로, 초점을 다시 맞추어 복측각(ventral horn) 부위의 운동 뉴런을 식별합니다. 이 뉴런들은 위치와 형태, 큰 크기, 그리고 Azure B에 의한 짙은 청색 염색으로 구분할 수 있습니다. 라이트 펜의 그리기 도구를 선택하여 운동 뉴런의 가장자리를 따라 전체 외곽선을 표시합니다. 다른 세포가 섞이는 것을 방지하기 위해 외곽선을 운동 뉴런에 최대한 밀착시켜 그려내십시오.

소프트웨어가 절단 준비가 되었을 때 위치를 기억하므로 절단 전에 여러 세포를 표시할 수 있습니다. 캡을 절단 위치 아래로 가져온 다음 시작 버튼을 클릭하여 레이저를 이용한 운동 신경 세포 절단을 시작하십시오. 모든 섹션의 모든 운동 신경 세포를 하나의 슬라이드에서 하나의 마이크로 퓨지 튜브 캡으로 수집하십시오. 수집이 완료되면 트레이를 내려 튜브를 조심스럽게 분리하여 홀더에서 마이크로 퓨지 튜브를 꺼낸 다음, 용액을 파이펫팅하여 운동 신경 세포와 완충액을 완전히 용해하십시오.

원심분리를 통해 용액을 튜브 바닥으로 모은 후, Azure B로 염색하고 즉시 드라이아이스에 급속 냉동하여 -80°C에서 보관합니다. 운동 신경세포는 크고 어둡게 염색된 세포체로 나타납니다. 이는 anti- ChAT 항체 염색으로 확인되며, 주변의 더 작은 세포들과 쉽게 구별됩니다. 본 예시에서는 라이트 펜으로 운동 신경세포체를 외곽선으로 표시하고 소프트웨어를 통해 번호를 부여했습니다.

여기서는 레이저로 세포체를 절단하여 외곽선 표시를 끈 상태로 수집 튜브에 떨어뜨린 모습입니다. 주변 영역에 가해진 레이저 손상 정도가 뚜렷하게 나타납니다. LMD로 수집한 약 4,000개의 마우스 운동 신경세포체 샘플에 대한 RNA 무결성 전기영동 분석의 전형적인 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

두드러진 리보솜 RNA 피크를 확인하십시오. RNA 분해를 최소화하기 위해 슬라이드 염색부터 운동 신경원 박리까지의 전 과정은 한 슬라이드에 있는 모든 절편에 대해 30분 이내에 완료되어야 합니다. 이 절차를 수행할 때, 초기 척수 박리 및 포매 단계뿐만 아니라 최종 염색 및 운동 신경원의 레이저 캡처 미세 박리 단계에서도 가능한 한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.