레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산
2014년 1월 13일
고품질 총 RNA는 70% 에탄올에 Azure B로 척수 섹션을 염색한 후 레이저 포획 마이크로디스트섹션에 의해 마우스 척수 모터 뉴런의 세포체로부터 제조되었다. 충분한 RNA(~40-60 ng)는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 하류 RNA 분석을 허용하기 위해 3,000-4,000개의 모터 뉴런으로부터 회수된다.
이 절차의 전반적인 목표는 주변 세포의 RNA에 의한 오염 없이 척수 운동 뉴런에서 고품질 RNA를 회수하는 것입니다. 이것은 먼저 코드를 회수, 분할 및 극저온 매립 매체에 삽입하고 섭씨 영하 160도에서 동결함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 섭씨 영하 20도에서 펜 멤브레인 슬라이드에 코드를 동결 절단하는 것입니다.
다음으로, 슬라이드를 70% 에탄올로 세척하고 70% 에탄올에서 Azure B로 염색합니다. 마지막 단계는 식별된 운동 뉴런 세포체를 귄 티오시아네이트 용해 완충액으로 레이저 캡처하여 미세 해부하는 것입니다. 궁극적으로, 총 RNA는 결합된 용해물에서 준비되고 돌연변이 동물과 야생형 동물의 뉴런에서 일반적인 또는 특정 RNA 전사의 차이를 밝히기 위해 테스트됩니다.
레이저 캡처 미세해부는 더 많은 수의 Scalia 및 기타 세포 유형에 의한 오염 없이 척수 절편에서 운동 뉴런 세포체를 회복할 수 있습니다. RNA를 준비하고 병에 걸린 동물과 정상 동물의 뉴런 사이의 전사를 비교할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 절차를 개발하는 데 있어 가장 어려웠던 점은 레이저 캡처 전과 캡처 중에 높은 수준의 RNA 무결성과 추출 능력을 유지하면서 척수 절편에서 운동 뉴런을 감지할 수 있는 염색 방법을 찾는 것이었습니다.
우리는 Azure B 및 70% 에탄올의 염색 절편이 절개된 세포체를 Guine Thiocyanate lysis Buffer에 직접 채취하는 것과 결합할 때 이러한 기준을 충족한다는 것을 발견했으며, 이는 절차가 최상의 결과를 위해 우리 실험실의 박사후 연구원인 ine Van Padia에게 입증되었습니다. 모든 장비가 RNA, 오염 제거 용액으로 세척된 후 RNA가 없는 70% 에탄올로 세척되었는지 확인하고 안락사 및 경 심장 관류 후 척수를 조심스럽게 분리합니다. RNA에서 코드를 10초 동안 헹굽니다.
잔여 혈액을 씻어낼 수 있는 무료 물을 RNA가 없는 유리 슬라이드에 매우 부드럽지만 빠르게 놓습니다. 다음으로, 깨끗한 면도날을 사용하여 척수를 가로로 9-10조각으로 나눕니다. OCT로 채워진 크라이오 몰드에 조각을 놓고 깨끗한 바늘을 사용하여 수직으로 정렬합니다.
액체 질소로 사전 냉각된 두 개의 메틸 부탄이 들어 있는 얕은 트레이에 곰팡이를 놓습니다. RNA 분해를 방지하려면 트레이를 액체 질소 수조에 넣으십시오. 척수 조각을 빠르게 동결합니다.
절단하기 전에 OCT 내장 블록을 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 절편 위치를 설정할 준비가 되면 OCT가 냉각된 저온 유지 장치에 블록을 내장합니다. 각각 9-10개의 척수 단면을 포함하는 20미크론 슬라이스를 생성합니다.
RNA가 없는 펜 멤브레인에 절편을 놓습니다. 2개의 미크론 슬라이드는 섹션이 접착되도록 하기 위해 초기에 실온으로 유지되었습니다. 글쎄, 즉시 저온 유지 장치 내부의 섭씨 20도 음의 표면에서 섹션을 다시 동결하십시오.
깨끗한 랙 범위에서 사용할 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 80도로 유지하십시오. RNA가 없는 70%에탄올로 채워진 6개의 50밀리리터 원뿔형 튜브. 깊이는 슬라이드가 잠겼을 때 슬라이드의 모든 섹션을 덮을 수 있을 만큼 충분해야 합니다.
다음으로 1%Azure B 솔루션을 동일한 랙에 배치합니다. 세척 또는 염색 중 용액 교체 사이의 시간을 최소화하려면 랙 앞에 3-4개의 실험실 물티슈를 두어 추가 용액을 빠르게 배출하십시오. 준비가 되면 섭씨 80도의 냉동고에서 슬라이드를 꺼내 드라이아이스에 놓고 장갑을 낀 손바닥에 올려 슬라이드 하나를 해동합니다.
슬라이드의 수분과 응결을 대부분 실험실 물티슈로 닦아내고 부분을 만지지 않도록 주의하여 제거합니다. 페트리 접시에 신선한 실리카겔 건조제에 슬라이드를 30-40초 동안 올려 완전히 건조시킵니다. 건조되면 슬라이드를 RNA의 첫 번째 튜브에 담그고 70% 에탄올을 제거합니다.
슬라이드를 30초 동안 담근 다음 45초에서 1분 동안 위아래로 담그어 OCT를 씻어냅니다. 그런 다음 용액에서 슬라이드를 꺼내고 실험실 물티슈에 여분의 액체를 배출합니다. 70% 에탄올의 두 번째 튜브에 슬라이드를 담그하여 이 과정을 반복합니다.
척수 부위 주변에 OCT가 남아 있으면 세 번째 튜브에서 세척을 반복합니다. 과잉 액체를 배수한 후에, 70%RNAs에 있는 1%Azure B 해결책에 있는 슬라이드를 담그고, 30에서 45 초 동안 에탄올을 해방하십시오. 랩 와이프에서 여분의 Azure B를 배출합니다.
이 시점에서 전체 슬라이드가 파란색이 됩니다. 슬라이드를 70 % 에탄올의 다음 튜브에 담그고 3-4 회 빠르게 위아래로 담그어 과도한 염료를 제거하고 특정 운동 뉴런 염색을 볼 수 있도록합니다. 섹션이 매우 어둡게 염색된 것처럼 보이면 70% 에탄올이 함유된 새 튜브에서 염색 단계를 반복합니다.
염색이 너무 옅은 것 같으면 슬라이드를 Azure B 용액으로 32번째 더 되돌리고 염색을 반복합니다. 염색이 만족스러우면 슬라이드를 잠시 자연 건조시키고 다음 단계로 진행합니다. DES 염색 및 건조 후 회백질은 연한 파란색이 되고 짙은 파란색으로 염색된 운동 뉴런을 쉽게 볼 수 있습니다.
현미경을 켠 직후 해부를 시작하십시오. 튜브 홀더를 내려 0.6mm 마이크로 퍼지 튜브의 캡을 부착합니다. 샘플 수집을 위해 30마이크로리터의 기인과 티오시아네이트 용해 완충액을 캡에 넣고 용액을 펴서 표면을 덮습니다.
피펫 팁을 사용하여 캡을 구멍과 대물렌즈에 맞춥니다. 현미경 소프트웨어가 마모되면 레이저 캡처를 시작할 때까지 캡을 덮인 위치에 유지하십시오. 공기 건조된 슬라이드를 s에 거꾸로 놓습니다.tage 멤브레인 면이 아래를 향하고 섹션이 구멍과 정렬되도록 현미경의 e.
슬라이드를 제자리에 놓고 5x 대물렌즈가 있는 척수 절편에 초점을 맞춘 다음 절제를 위해 20 x 대물렌즈로 이동합니다. 먼저 라이트 펜으로 더미 영역을 표시하고 레이저가 수집하지 않고 잘라낼 수 있도록 합니다. 이것은 멤브레인을 이완시키고 여러 영역을 연속적으로 표시하고 절단할 수 있도록 합니다.
다음으로, 복부 뿔 영역의 운동 뉴런에 다시 초점을 맞추고 식별합니다. 이 뉴런은 위치 parmal 형태, 큰 크기 및 Azure B.로 짙은 파란색 염색으로 인식 할 수 있습니다.가벼운 펜을 사용하여 그리기 도구를 선택하고 운동 뉴런의 가장자리를 따라 표시하여 완전한 윤곽을 만듭니다. 다른 세포로부터 오염되지 않도록 윤곽을 운동 뉴런에 최대한 가깝게 만드십시오.
절단 준비가 되면 소프트웨어가 위치를 기억하고 캡을 절단 위치 아래로 가져오고 시작 버튼을 클릭하여 레이저로 운동 뉴런 박리를 시작하기 때문에 절단 전에 여러 셀을 표시할 수 있습니다. 하나의 슬라이드에 있는 모든 섹션의 모든 운동 뉴런을 하나의 마이크로 fuge 튜브의 캡에 수집합니다. 수집이 완료되면 트레이를 내리고 튜브를 부드럽게 제거하여 용액을 위아래로 피펫팅하여 모터 뉴런과 버퍼를 완전히 용해하여 홀더에서 마이크로 fuge 튜브를 꺼냅니다.
원심분리를 통해 용액을 튜브 본체로 옮기고 샘플을 드라이아이스에서 즉시 동결하고 Azure B.The 모터 뉴런으로 염색한 후 섭씨 80도의 음반에 보관하십시오. 이들은 항 CHATT 항체, 염색에 의해 확인되며 더 작은 이웃 세포와 쉽게 구별됩니다. 이 예에서는 운동 뉴런 세포체가 라이트 펜으로 윤곽을 그리고 소프트웨어에 의해 번호가 매겨졌습니다.
여기에서 세포체를 레이저로 잘라내고 윤곽을 끈 채 수집 튜브에 떨어뜨렸습니다. 인접 지역에 대한 레이저 손상의 정도는 명백합니다. LMD에 의해 수집된 약 4,000개의 마우스 모터 뉴런 세포체에서 채취한 샘플의 RNA 무결성에 대한 전기영동 분석의 일반적인 결과가 여기에 나와 있습니다.
두드러진 리보솜 RNA 피크에 주목하십시오. 슬라이드 염색에서 운동 뉴런 해부까지의 이 과정은 RNA 분해를 최소화하기 위해 하나의 슬라이드의 모든 섹션에 대해 30분 이내에 완료되어야 합니다. 이 절차를 시도할 때는 탯줄의 초기 해부 및 매립뿐만 아니라 운동 뉴런의 염색 및 레이저 캡처 현미 해부의 최종 단계에서 가능한 한 빨리 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
개요
본 연구는 레이저 캡처 마이크로디섹션을 사용하여 마우스 척수 운동 뉴런으로부터 고품질 RNA를 회수하는 방법을 설명합니다. 이 과정은 이웃 세포로부터의 오염을 최소화하여 정확한 RNA 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 분자 생물학
- 유전자 발현 분석
배경
- 운동 뉴런은 신경퇴행성 질환을 이해하는 데 중요합니다.
- 정확한 유전자 발현 연구를 위해서는 고품질의 RNA 추출이 필수적입니다.
- 주변 세포로부터의 오염은 결과를 왜곡시킬 수 있습니다.
- 레이저 캡처 마이크로디섹션은 특정 세포 유형을 분리하는 해결책을 제공합니다.
연구 목적
- 운동 뉴런으로부터 RNA를 분리하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 돌연변이체와 야생형 동물 간의 RNA 전사를 비교합니다.
- 추출 및 분석 중 RNA 무결성을 유지합니다.
사용된 방법
- 척수 섹션을 냉동 임베딩 매체에 넣고 동결시켰습니다.
- 섹션을 Azure B로 염색하고 에탄올로 세척했습니다.
- 레이저 캡처 마이크로디섹션을 수행하여 운동 뉴런을 분리했습니다.
- 하위 분석을 위해 용해액으로부터 전체 RNA를 준비했습니다.
주요 결과
- 3,000-4,000개의 운동 뉴런으로부터 고품질 RNA (~40-60 ng)를 성공적으로 추출했습니다.
- 이 방법은 다른 세포 유형으로부터의 오염을 최소화했습니다.
- 절차 전체에서 RNA 무결성이 보존되었습니다.
- RNA-seq 및 qRT-PCR와 같은 하위 분석을 수행할 수 있습니다.
결론
- 개발된 방법은 특정 뉴런 집단으로부터 RNA를 분리하는 데 효과적입니다.
- 이는 질병에 걸린 뉴런과 정상 뉴런 간의 비교 연구를 가능하게 합니다.
- 이 기술은 운동 뉴런 생물학에 대한 이해를 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from rare cell populations like motor neurons enables precise target validation in neurodegenerative disease models. This approach reduces biological noise and improves predictive confidence when comparing mutant versus wild-type transcriptional profiles. It supports early de-risking of therapeutic hypotheses by linking genotype to cell-type-specific gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in disease-relevant motor neurons without confounding signals from glial or neighboring cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate <10% of spinal cord cell population for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cell-type-specific RNA expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates qualified RNA inputs for downstream assays like qRT-PCR and RNA-seq with minimal cross-cell contamination.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through Azure B staining in 70% ethanol and direct lysis in guanidine thiocyanate buffer.
- Assay Readiness: Enables scalable profiling of motor neuron transcriptomes across genetic models or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by allowing direct comparison of RNA profiles between diseased and normal motor neurons.
- Operational Value: Maintains RNA integrity from sectioning through lysis, enabling reliable detection of transcriptional differences.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target validation by isolating the cellular source of signal.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing purified molecular readouts from disease-relevant neurons.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation by isolating motor neuron-specific transcriptional responses.
- Screening: Produces assay-ready RNA with quantified integrity for consistent compound screening in neuronal models.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA yield, RIN values) that enable statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validity through direct comparison of mutant and wild-type neuron transcriptomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for isolating rare neuronal populations across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized staining, laser capture, and lysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner, more interpretable transcriptional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cell-type-specific expression changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, laser capture microdissection, and RNA handling to prevent degradation.
- Dependent on cryostat, UV laser microdissection system, and RNase-free reagents for consistent performance.
- Necessitates cross-team standardization of staining timing and ethanol wash steps to ensure motor neuron visibility.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to other neuronal subtypes or disease models.
- Limited by RNA yield scaling; best suited for pooled samples from multiple sections or animals.
