인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

본 절차의 전반적인 목표는 단일 골격근 생검 조직에서 인간 혈관 유래 다능성 전구세포의 하위 집단을 분리 및 정제하는 것입니다. 먼저, 근육 생검 조직을 해리시키고 collagenase type one, two 및 four의 조합으로 소화합니다. 그다음, 선택된 세포 표면 마커의 조합을 인식하는 형광 결합 항체로 단일 세포 현탁액을 표지합니다. 마지막으로, 유세포 분석기를 이용한 형광 활성 세포 분류(FACS)를 수행합니다.

최적의 밀도에서 특정 배양 조건에 따른 분리된 세포 하위 유형을 관찰하고 확장하십시오. 궁극적으로, 정제된 세포의 분리 후 분석과 배양된 세포 하위 집합의 후속 유세포 분석 및 R-T-P-C-R 분석을 통해 이러한 균질한 BVSE 하위 집합의 순도를 확인합니다. 이 방법은 중배엽성 낙타 줄기세포의 기원이 무엇인지에 대한 답을 제시할 수 있습니다.

많은 연구자가 다양한 조직에서 서로 다른 유형의 줄기세포를 발견해 왔습니다. 따라서 저는 이 방법이 이러한 줄기세포의 기원뿐만 아니라, 혈관 주변 세포 및 기타 혈관 유래 세포가 조직 재생 및 복구에서 수행하는 역할에 대한 답을 제시할 수 있을 것이라고 생각합니다. 근육 생검과 같이 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.

해리 단계는 습득하기 어려울 수 있습니다. 콜라게나제(collagenase) 소화의 기술적 세부 사항과 최적화는 표적 세포의 수율과 정제에 매우 결정적입니다. 인간 골격근 생검 조직을 얼음 위에 실어 운반하십시오.

멸균 조건 하에 5% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DM M에서 수행합니다. 2% 항생제 항진균제가 포함된 PBS로 시료를 2회 세척한 후, 2% aa가 첨가된 dms로 세척합니다. 부착된 지방 및 결합 조직을 제거합니다.

또한 해부 현미경 아래에서 굵은 혈관을 제거합니다. 이제 근육 표본을 작은 조각으로 절단합니다. 시료를 20 milliliters의 보존액으로 옮겨 4 °C에서 최대 5일 동안 보관합니다.

세포 분리 당일, 근육 조각을 꺼내 2% pen strip이 포함된 PBS로 두 번 세척합니다. 이제 소화액을 만들기 위해 type one, type two, type four collagenase를 각각 100 mg/mL씩 pm에 첨가합니다.

마지막으로, 소량의 pm을 사용하여 근육 조각들을 잘게 썰고 기계적으로 다집니다. 용액을 10 milliliter 세롤로지컬 피펫에 통과시키며 응고 여부를 확인합니다. 이 과정에서 잔여 지방 및 결합 조직을 제거합니다.

그다음 성체 샘플의 절반은 20 milliliters의 소화액에, 태아 샘플 전체는 10 milliliters의 소화액에 옮깁니다. 37 °C의 온도에서 70 to 80 RPM으로 설정한 오비탈 셰이커를 이용하여 50 to 60분 동안 샘플을 소화시킵니다. 15 to 20분마다 소화 상태를 관찰하십시오.

조직의 양에 따라 소화 시간 및 교반 속도를 적절히 조정하여 세포 수율과 표면 항원 보존을 최적화하십시오. 탁도가 거의 사라지면 소화 중인 조직을 3~5회 강하게 피펫팅합니다. 반응을 중단시키기 위해 동일한 양의 PM을 추가한 다음 400 Gs에서 원심분리합니다. 4분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하여 펠릿을 세척하고 10 mL의 PM에 다시 현탁합니다. 100 µm 세포 스트레이너로 여과하고 400 Gs에서 4분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 펠렛을 적혈구 용해 버퍼(erythrocyte lysis buffer)에 현탁하고 70 micron 세포 스트레이너로 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 현탁액을 70 micrometer 세포 스트레이너로 여과합니다. 침전물이 관찰될 경우, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하여 재현탁합니다.

0.5 mL의 PBS에 현탁하고 염색을 위해 세포 수를 측정합니다. 단일 세포 현탁액을 PBS를 사용하여 mL당 5백만 개 미만의 세포 농도로 희석합니다. 세포 현탁액 50~100 µL를 취해 미염색 대조군, 음성 대조군 및 단색 양성 대조군을 위한 11개의 튜브에 나누어 담습니다. 필요한 경우, 마우스 혈청을 사용하여 4 °C에서 10분 동안 단일 세포 현탁액을 블로킹합니다.

실험 설계에 따라 항체 용액을 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 각 샘플 펠렛을 희석된 PM으로 한 번 세척합니다. 사멸 세포 제거를 위해 7-AAD를 1:100로 희석하여 최종 농도가 5 million cells/mL가 되도록 조절한 후, 음성 대조군 및 단일 색상 양성 대조군은 상온에서 15분 동안 배양합니다. 세포 펠렛을 0.5 mL의 희석된 PM에 재현탁합니다.

모든 세포 현탁액을 라운드 바텀 폴리스티렌 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 이제 적절한 coer 배지 500 µL가 들어 있는 세포 수집 튜브를 준비합니다. 세포 현탁액을 얼음에 박아 세포가 있는 곳으로 운반합니다.

무염색 대조군, 음성 대조군, 단일 색상 양성 대조군, 그리고 주요 세포 현탁액 순으로 세포 분류기에서 세포 현탁액을 분류하며, 세포 순도를 극대화하기 위해 레이저 강도, 채널 보정 및 세포 군집 게이팅을 엄격하게 조정하십시오. 원하는 세포 군집을 적절한 수집 튜브에 수집하십시오. 수집된 세포는 4 °C에서 보관하십시오.

즉시 파종하지 않을 경우, 갓 분리한 근원성 내피세포를 Type one collagen으로 사전 코팅된 플레이트의 MPM 배지에 파종하여 이후 ECS seed 패키징을 준비하십시오.

Type I 콜라겐이 사전 코팅된 플레이트 또는 플라스크의 MPM에 제곱센티미터당 3,500 ~ 4,000개의 세포를 분주하여 배양합니다. 1차 및 2차 계대 배양을 위해 0.2% 젤라틴을 갓 코팅한 플레이트에 갓 분리한 기생충을 egm two에 넣어 분주합니다. PC 배지를 사용하여 일반 폴리스티렌 배양 용기에 세포를 1:3 비율로 분할 배양합니다.

P3 이후의 플레이트입니다. 일반 폴리스티렌 배양 플레이트의 PC 배지에서 cm²당 6,500 ~ 7,000개의 세포 밀도로 세포를 배양하십시오. 플라스크의 경우, 일반 폴리스티렌 배양 플레이트의 AC 배지에서 갓 분리된 외배엽 조직 세포를 배양한 후, AC 배지가 담긴 일반 폴리스티렌 배양 플레이트에서 cm²당 6,000 ~ 7,000개의 밀도로 ACS 시드 세포를 후속 패키징하십시오.

죽은 세포를 제외한 후, 무염색 대조군, 음성 대조군 및 단일 색상 양성 대조군에서 얻은 데이터를 기반으로 플라스크 팩트 파라미터를 먼저 보정합니다. 이후 형광 표지된 세포 현탁액을 대상으로 일련의 음성 및 양성 세포 표면 마커 선택 과정을 거칩니다. 먼저 CD 45 양성 세포를 게이팅하여 제외합니다. 그다음 CD 45 음성 분획에서 CD 56 양성 세포와 CD 56 음성 세포를 분리합니다.

CD 56 양성 분획은 CD 34, CD 1 44 선택 과정을 추가로 거치며, 여기서 이중 양성 세포만이 근원성 내피세포로 표시되어 수집됩니다. 마찬가지로, CD 56 음성 분획은 CD 34, CD 1 46 선택 과정을 추가로 거치며, 여기서 CD 34 음성 CD 1 46 양성 세포만이 기생 세포로 표시되어 수집됩니다. CD 34 양성 CD 1 46 음성 분획은 내피세포를 배제하기 위해 추가적인 CD 31 음성 선택 과정을 거치며, CD 34 양성 CD 31 음성 서브셋만이 수집을 위한 adv 세포로 표시됩니다. 여기서 내피세포(EC) 배제를 위해 CD 31 대신 CD 1 44를 사용할 수 있습니다.

이 H-P-V-S-C 하위 집단들은 단일 기증자의 근육 생검 조직에서 정제되었습니다. 일반적인 불균질한 근육 줄기세포와 달리, 인간 혈관 유래 줄기세포 하위 집단의 배양물은 장기간 확장 후에도 균질성을 유지합니다. 아시다시피, 자가 연구자가 저희 실험실에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 이러한 혈관 유래 줄기세포를 분리하는 것이 매우 중요하다고 생각합니다.

따라서 저희는 이 기술을 병렬적으로 제시함으로써 연구자들이 저희의 결과를 재현하고, 각 팀의 결과를 실질적으로 비교할 수 있을 것이라고 믿습니다. 신선한 인체 조직을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 니트릴 장갑과 보안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.