Name: 인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 인간 골격 근육에서 혈관 유래 다능성 전구체 세포를 분리하고 정제하는 방법을. 교원소 분해와 FACS를 통해 근육성 내피세포, 주변세포, 외막세포를 동시에 분리하여 재생의학 연구에 활용합니다.

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저자는 유동 세포 계측법을 가진 그녀의 뛰어난 기술 지원을 앨리슨 마을 영웅을 감사드립니다. 이 작품은 국방부 (JH), 헨리 J. 맨킨 기부 의자 (JH), 교육 및 카자흐스탄 공화국의 과학 교육부 (AS)에서 보조금에 의해 지원되었다. CWC는 미국 심장 협회 (American Heart Association) predoctoral 교제 (11PRE7490001)에 의해 부분적으로 지원되었다. M.Corselli는 재생 의학 교육 교부금의 캘리포니아 공과 대학 (TG2-01169)에 의해 지원되었다.

1 근육 생검 처리 <ol><li> 둘 베코 변형 이글 중 5 % 소 태아 혈청 (FBS)과 보충 된 (DMEM)에서 얼음에 인간 골격근 생검 보존 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 운송시 (P / S). </li><li> 근육 조직 검사를받은 후, 운송 컨테이너에서 시편을 제거하고 멸균 조건에서 2 %의 항생제 항진균제 용액 (A / A)로 보충 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 두 번 씻는다. </li><li> 2 % A / 보충 DMEM에서 멸균 가위와 집게로 첨부 된 지방과 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 해부 현미경으로 큰 혈관을 제거하고 이후 작은 ​​조각 (크기 &lt;1cm 2)로 근육 표본을 잘라. </li><li> 20 ml의 보존액으로 잘라 근육 편 (&lt;5g) 유지 (PM을, DMEM은 10 % FBS 및 1 % P / S가 보충)까지 5 일 동안 4 ℃에서. </li></ol> 2 근육 Dissociat이온 전지 분리 <ol><li> 세포 격리 당일 PM에서 근육 편을 제거하고 PBS로 두 번 씻어 2 % P / S가 보충. 소화 솔루션을 만들려면, 유형 I, 유형 II 및 유형-IV의 콜라게나 갓 오후에 (100 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 잘게 썰어 용액 더 응고와 10 ㎖ 피펫을 통과 혈청까지 기계적 PM 소량의 페트리 접시에 멸균 가위 집게 근육 편 말하다. 이 과정에서 잔류 지방과 결합 조직을 제거합니다. 성인 근육의 이상 8-10그램 각 세포 분리를위한 태아 근육의 2g을 사용합니다. </li><li> 20 ㎖ (또는 10 ㎖의에 다진 태아 근육의 2g) 10 ㎖의 혈청 학적 피펫 소화 솔루션 적힌에 다진 성인 근육의 4~5그램을 전송합니다. 80 RPM - 70 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 - 50 다이제스트. 따라서 양에 따라 소화 시간 및 / 또는 교반 속도를 조정함으로써 세포 수율 및 표면 항원 보존 최적화조직. 탁도가 거의 빠져 나올 때까지 소화 상태마다 15 ~ 20 분을 준수하십시오. </li><li> 적극적으로 소화 조직에게 10 ㎖의 혈청 학적 피펫 3-5 시간을 피펫. 반응을 정지 한 후 4 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 PM의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거; 워시 10 ㎖의 PM으로 펠렛을 재현 탁하고 100 μm의 세포 여과기를 통해 여과 하였다. </li><li> 4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 제거합니다. 적혈구 용해 완충액 (155 mM의 NH 4 염소, 10mM을 KHCO 3 0,1mM EDTA)는, 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 한 후 RT에서 10 분 동안 배양에서 재현 탁 펠렛. 침전이 관찰되는 경우 다시 70 m 셀 스트레이너를 통해 필터. </li><li> 4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 및 0.5 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포의 수를 계산. 셀 정렬에 대해 최소한 5,000,000 세포의 총을 얻습니다. 자장을 희석염색 용 PBS​​와 ML 미만 5,000,000 세포 전자 세포 현탁액. 제어의 염색에 대한 11 튜브 (흠 제어, 음성 제어, 단일 색상 양성 대조군)에 세포 현탁액 및 분할의 50 ~ 100 μl를 꺼냅니다. </li></ol> 3 셀 라벨 및 정렬 <ol><li> 필요한 경우 목적을 블로킹 (PBS에서 1:10 희석) 마우스 혈청에서 4 ℃에서 10 분 동안 단일 세포 현탁액을 배양한다. </li><li> 단일 세포 현탁액에 (100 모두 1) 및 4 ℃에서 20 분 동안 품어 CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE 및 CD146-FITC를 추가합니다. 음성 대조군의 경우, APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE- 및 FITC - 복합 이소 타입의 IgG 항체의 등가 농도를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다. 단일 색상 양성 대조군의 경우, 개별적으로 각각의 튜브에 CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE 및 CD146-FITC의 등가 농도를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 배양 후4 분 동안 400 XG에 원심 분리기 세척한다. 5 % FBS 및 1 % P / S가 보충 된 DMEM ml의 2 - (1)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액의 최종 농도는 ml의 미만 5,000,000 셀이어야한다. 7-AAD (1 : 100)을 추가하고 죽은 세포 제외 실온에서 15 분 동안 배양한다. 음성 대조군 및 단일 컬러 양성 대조군, 5 % FBS 및 1 % P / S가 보충 0.5 ml의 DMEM에 재현 탁 된 세포 펠릿. </li><li> 튜브 세포 계측법 둥근 바닥 폴리스티렌 흐름에 모든 세포 현탁액을 전송합니다. (각 튜브 프리 필드입니다 적절한 배지 500 μL로 : MEC를 위해 MPM, EGM-2를 PC 용, AC를위한 AC 매체) 세포 수집 튜브를 준비합니다. 셀 소터에 얼음에 전송 세포 현탁액. </li><li> 흠 제어, 음성 대조군, 단일 컬러 양성 대조군, 및 주요 세포 현탁액의 순서로 셀 소터에 실행 세포 현탁액 셀 (P)을 최대화하기 위해 엄격 게이팅 레이저 강도, 채널 보상 및 세포 집단을 조정하면서urity는 (조브 및 흐름의 자세한 내용은 다른 저널 세포 계측법에 의해 발표 된 논문을 참조하시기 바랍니다). </li><li> 적절한 수집 튜브에서 원하는 세포 인구를 수집합니다. 4 ℃에서 보관 수집 된 세포는 즉시 파종하지 않을 경우. </li></ol> (4) 세포 배양을 후 정렬 <ol><li> 사전 코팅 된 플레이트에 MPM의 &lt;10,000 세포 / cm 2에서 갓 분류 MEC를 (P0)을 시드 타입 I 콜라겐. MEC를 이후의 계대를 들어, 3500 씨앗 - 사전 코팅 플레이트 / 플라스크에 MPM에 4,000 세포 / cm 2 타입 I 콜라겐. </li><li> 갓 0.2 % 젤라틴으로 코팅 된 플레이트 상 EGM-2 &lt;20,000 세포 / cm 2에서 갓 정렬 개 세트 (P0)를 시드. PC 배지에서 3까지 일정한 비율 P2 폴리스티렌 배양 플레이트 상에 (20 % FBS 및 1 % P / S가 보충 DMEM) : PC 중 후속 계대를 들어, 1에서 셀을 분할. P3에서 이후, 씨앗 세포 6500에서 - 일반 폴리스티렌 배양 플레이트 / 플라스크 상에 PC 매체에서 7,000 세포 / cm 2. </li><li> 일반적인 폴리스티렌 배양 접시 상에 (20 % FBS, 1 % P / S가 보충 DMEM) 배지에서 AC &lt;20,000 세포 / cm 2로 갓 정렬 AC들 (P0)을 시드. 일반 폴리스티렌 배양 플레이트 / 플라스크 상 AC 매체에서 7,000 세포 / cm 2 - 6500에서 이후의 ACS 계대, 씨앗 세포하십시오. </li></ol>

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hBVSC의 소집단의 식별 및 정제는 MSC의 개체 발생의 이해에 큰 사전을 나타냅니다. 중간 엽 줄기 세포의 혈관 주위 기원 조직 특이 전구 세포 및 혈관 22-25 사이의 연관을 나타내는 증거가 증가하고있다. 또한, 용량은 상기 MSC 얼룩이 및 혈관 세포 생물학 (26)의 이해를 돕는다 hBVSCs 균질 부분 집단을 분리한다. 지난 몇 년 동안, MEC를, PC 및 AC를 개별적으로 확인 된 별도의 연구에서 서로 다른 프로토콜을 통해입니다. 그러나 시도는 조직 해리 절차와 완전히 MEC를, PC 및 AC를 식별 선택적 세포 계통 마커의 조합을 최적화하기 때문에 어려움 인간 골격근 동시에 세 hBVSC 서브 세트를 정화 이루어지지 않았다. 여기에서 우리는 동시 purif을 할 수있는 새로운 세포 격리 프로토콜을 설명(도 1) 티슈 해리 과정을 수정하고 선택적 세포 표면 마커의 새로운 조합을인가함으로써 하...

인간의 골격 근육 줄기 / 전구 세포의 임상 매력적인 소스로 간주되고있다. 골격근은 위성 세포 및 근육 유래 줄기 세포 (MDSCs) 한 전구 세포를 포함한 근육 조직, 골격 근육 모세포뿐만 아니라 원시 근원 성 줄기 세포를 포함 커밋되지. 재생 의료에 인간 근육 유래 줄기 / 전구 세포,자가 또는 동종의 사용은 광범위 전임상 동물 실험 및 임상 시험에서 연구되어왔다. 근육 줄기 / 전구 세포의 재생 응용 프로그램은 심장 마비 환자의 손상된 심장을 수리에 뒤 시엔 느 근이영양증 (DMD) 환자에서 이영 근육을 재생 이르기까지 다양합니다. 골수 유래 다 능성 성인 전구 세포 (MAPCs) 및 지방 유래 줄기 세포 (ADSCs), 성체 줄기 /를 포함한 중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포) 및 기타 능성 전구 세포 인구의 발견 이후전구 세포는 1-9 일에 광범위하게 연구되었다. 그럼에도 불구하고, 현장에서 그 나라의 정체성과 현지화는 회고 분리 방법에 의해 가려하고있다. 최근 정렬 형광 활성화 세포 (FACS)를 사용하여, 다른 그룹이 전향 식별 한 혈액 인간 골격근 내의 혈관 및 기타 여러 기관에서 정제 된 세 능성 전구 세포 집단 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈관 주위 세포 (PCS), 그리고 외막 세포 ACS () 10. 내막, 중막 및 외막 외막 : 인간 혈관 유래 줄기 세포 (hBVSCs)이 세 부분 집단은 각각 혈관의 세 층의 구조에서 찾아 볼 수있다. ACS에 큰 동맥과 정맥의 외막 층 지역화하는 동안보다 구체적으로는, MEC를하고 PC는 미세 혈관과 모세 혈관에 감지됩니다. (C를 MEC를 각 전구 세포의 서브 세트는 세포 표면 항원의 고유 한 조합을 나타내고D34 + / 56 + / 144 + / 45 -)의 PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) 및 AC를 (CD34 + / - 31 / 45 - / 56 - / 146 -). 이 hBVSC 부분 집합의 또 다른 특성은 세 개의 전구 세포의 인구가 골격 근육 생성, 골 형성, 연골 및 지방 생성을 포함하여 일반적인 중간 엽 줄기 세포와 유사한 중배엽 발달 잠재력을 가지고 것으로 나타났습니다. 모든 hBVSC 서브 세트는 CD44, CD73, CD90 및 CD105, 갓와 문화를 포함하여 고전 MSC 마커를 나타낸다. 집합 적 증거의이 조각은 중간 엽 줄기 세포의 혈관 기원을 지원했다. 또한, MEC를, PC 및 ACS에의 치료 용량은 최근 별도의 연구에서 입증되었다. 성인의 근육 조직 검사에서 분류 MEC를가 부상과 이영 골격근 및 수리 부상 심근보다 효율적으로보다 골격 근육 아세포 및 혈관의 엔도를 다시 생성 나타났다상피 세포 (내피). 다른 사람의 장기에서 정제 PC는 또한 / 수리 부상과 이영 골격 근육을 재생하고 위성 세포 풀 13-16에 기여하는 것으로 나타났다. 아주 최근에, 우리는 인간의 골격 근육에서 파생 된 PC를 효율적으로 간접 주변 분비 효과와 직접적인 세포 상호 작용 (17)를 통해 경색 심근를 복구하는 것을 증명하고있다. ACS에, 다른 한편으로는, 하나왔다 직접 외식 혈관으로부터 분리 또는 인간 지방 조직 및 골격근 FACS에 의해 정제 하였다. ACS에의 주목할만한 프로 혈관 신생 효과는 마우스 뒷다리 - 사지 허혈 모델 19에서 입증되었다. 또한, AC를 또한 허혈성 조직 복구 (20)의 ACS 강력한 치료 가능성을 나타내는, 종래보다 효율적으로 중간 엽 줄기 세포보다 심근 경색을 복구하는 것으로 나타났다. 동시에 현재의 정화 프로토콜 보조금, MEC를, PC에 미래의 정화 및하나의 인간의 골격 근육 조직 검사의 혈관에서 AC들. 이것은 우리가 연구 및 / 또는 별개의 치료 목적을위한 최적의 hBVSC의 하위 집단을 선택할 수 있습니다. 또한,이 새로운 기술은 더 나아가 재생 의료를위한 다 능성 전구 세포의 이상적인 소스 만드는 인간 골격근으로부터 유도 될 수 줄기 / 선조 세포의 레퍼토리를 확장한다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 1</td><td>Sigma</td><td>C5894</td><td>멸균 바이알</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 2</td><td>Sigma</td><td>C1764</td><td>멸균 바이알</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 4</td><td>Sigma</td><td>C1889</td><td>멸균 바이알</td></tr><tr><td>Anti-human CD34 APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>Anti-human CD45 APC-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557833</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>반인간 CD56 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>557747</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>Anti-human CD144 PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07481</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>Anti-human CD146 FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141F</td><td>멸균 유지</td></tr><tr><td>FACS Aria II 유세포 분석기</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 complete medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>PC 배양용(P0만 해당)</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민 함유, 피루브산 나트륨 없음</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>PC 배양용</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당(1X), 액체, L-글루타민, 피루브산 나트륨</td><td>포함 Invitrogen</td><td>11995</td><td>MEC 및 AC 배양용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 말 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로젠</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 (100X)</td><td>인비트로젠</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.5% (10X)</td><td>인비트로겐</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>병아리 배아 추출물</td><td>정확한 화학</td><td>CE650T-10</td><td>사용 전 필터</td></tr></tbody></table>

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 발견 이후, 고유의 정체성과 중간 엽 줄기 세포의 현지화는 문화에서의 회고전 분리에 의해 가려하고있다. 최근, 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여, 다른 연구자들은 전향 인간 골격근의 혈관과 연관된 다 능성 전구 세포의 세 부분 집단을 식별 및 정제. 이러한 세 가지 세포 집단 : 내막, 미디어 및 외막 : 근원 성 내피 세포 (MEC를), 혈관 주위 세포 (PCS), 및 외막 세포 ACS (은), 혈관의 세 층의 구조로 각각 지역화. 이러한 인간의 혈관 유래 줄기 세포 (hBVSC)의 모든 고전 MSC 마커를 표현뿐만 아니라 일반적인 중간 엽 줄기 세포와 유사한 중배엽 발달 잠재력을 가지고 인구뿐만 아닙니다. 이전 MEC를, PC 및 AC를 별개의 프로토콜을 통해 고립되었고, 이후 별도의 연구를 특징으로한다. 현재 격리 제자ocol, 선택적 세포 표면 마커의 분리 과정에 대한 수정 및 조정을 통해, 우리가 동시에 하나의 인간의 근육 조직 검사에서 FACS 모든 세 hBVSC의 소집단을 정화 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 여러 BVSC의 부분 집단의 분리를 간소화뿐만 아니라 별개의 치료 목적을위한 hBVSCs 미래의 임상 적용을 촉진하지 않습니다.

FACS 파라미터는 제 흠 제어, 음성 대조군 및 단일 컬러 양성 대조군으로부터 얻은 데이터에 기초하여 보정된다. 사균의 배제 후, 형광 표지 된 세포 현탁액은 음성 및 양성 세포 표면 마커의 시리즈 선택 받는다. 첫째, CD45 + 세포는 CD56 + 및 CD56 전에 게이트 아르 - 세포는 CD45에서 분리 - 분수. CD56 + 분획 더 CD34-CD144 선택으로 실시되는 경우에만 CD34 + / CD144 + (이중 양성) 세포 MEC를로 표시됩니다 (CD34 + / 56 + / 144 + / - 45) 그 후 수집 (그림 1). 마찬가지로, CD56 - 분수가 더 CD34-CD146 선택을받는 곳에서만 CD34 - / CD146 <su...

재생 애플리케이션에 이상적이다 인간의 골격 근육 항구 여러 멀티 혈통 전구체 집단 내에서 혈관. 내막 근육 조직에서 혈관 내피 세포, 혈관 주위 세포 매체 및 외막 세포 외막에서이 분리 방법은 혈관의 세 층 구조에서 각각 세 능성 전구 세포 집단의 동시 정제를 허용한다.

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

본 절차의 전반적인 목표는 단일 골격근 생검 조직에서 인간 혈관 유래 다능성 전구세포의 하위 집단을 분리 및 정제하는 것입니다. 먼저, 근육 생검 조직을 해리시키고 collagenase type one, two 및 four의 조합으로 소화합니다. 그다음, 선택된 세포 표면 마커의 조합을 인식하는 형광 결합 항체로 단일 세포 현탁액을 표지합니다. 마지막으로, 유세포 분석기를 이용한 형광 활성 세포 분류(FACS)를 수행합니다.최적의 밀도에서 특정 배양 조건에 따른 분리된 세포 하위 유형을 관찰하고 확장하십시오. 궁극적으로, 정제된 세포의 분리 후 분석과 배양된 세포 하위 집합의 후속 유세포 분석 및 R-T-P-C-R 분석을 통해 이러한 균질한 BVSE 하위 집합의 순도를 확인합니다. 이 방법은 중배엽성 낙타 줄기세포의 기원이 무엇인지에 대한 답을 제시할 수 있습니다.많은 연구자가 다양한 조직에서 서로 다른 유형의 줄기세포를 발견해 왔습니다. 따라서 저는 이 방법이 이러한 줄기세포의 기원뿐만 아니라, 혈관 주변 세포 및 기타 혈관 유래 세포가 조직 재생 및 복구에서 수행하는 역할에 대한 답을 제시할 수 있을 것이라고 생각합니다. 근육 생검과 같이 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.해리 단계는 습득하기 어려울 수 있습니다. 콜라게나제(collagenase) 소화의 기술적 세부 사항과 최적화는 표적 세포의 수율과 정제에 매우 결정적입니다. 인간 골격근 생검 조직을 얼음 위에 실어 운반하십시오.멸균 조건 하에 5% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DM M에서 수행합니다. 2% 항생제 항진균제가 포함된 PBS로 시료를 2회 세척한 후, 2% aa가 첨가된 dms로 세척합니다. 부착된 지방 및 결합 조직을 제거합니다.또한 해부 현미경 아래에서 굵은 혈관을 제거합니다. 이제 근육 표본을 작은 조각으로 절단합니다. 시료를 20 milliliters의 보존액으로 옮겨 4 °C에서 최대 5일 동안 보관합니다.세포 분리 당일, 근육 조각을 꺼내 2% pen strip이 포함된 PBS로 두 번 세척합니다. 이제 소화액을 만들기 위해 type one, type two, type four collagenase를 각각 100 mg/mL씩 pm에 첨가합니다.마지막으로, 소량의 pm을 사용하여 근육 조각들을 잘게 썰고 기계적으로 다집니다. 용액을 10 milliliter 세롤로지컬 피펫에 통과시키며 응고 여부를 확인합니다. 이 과정에서 잔여 지방 및 결합 조직을 제거합니다.그다음 성체 샘플의 절반은 20 milliliters의 소화액에, 태아 샘플 전체는 10 milliliters의 소화액에 옮깁니다. 37 °C의 온도에서 70 to 80 RPM으로 설정한 오비탈 셰이커를 이용하여 50 to 60분 동안 샘플을 소화시킵니다. 15 to 20분마다 소화 상태를 관찰하십시오.조직의 양에 따라 소화 시간 및 교반 속도를 적절히 조정하여 세포 수율과 표면 항원 보존을 최적화하십시오. 탁도가 거의 사라지면 소화 중인 조직을 3~5회 강하게 피펫팅합니다. 반응을 중단시키기 위해 동일한 양의 PM을 추가한 다음 400 Gs에서 원심분리합니다. 4분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거하여 펠릿을 세척하고 10 mL의 PM에 다시 현탁합니다. 100 µm 세포 스트레이너로 여과하고 400 Gs에서 4분 동안 원심분리한 후, 상층액을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 펠렛을 적혈구 용해 버퍼(erythrocyte lysis buffer)에 현탁하고 70 micron 세포 스트레이너로 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 현탁액을 70 micrometer 세포 스트레이너로 여과합니다. 침전물이 관찰될 경우, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하여 재현탁합니다.0.5 mL의 PBS에 현탁하고 염색을 위해 세포 수를 측정합니다. 단일 세포 현탁액을 PBS를 사용하여 mL당 5백만 개 미만의 세포 농도로 희석합니다. 세포 현탁액 50~100 µL를 취해 미염색 대조군, 음성 대조군 및 단색 양성 대조군을 위한 11개의 튜브에 나누어 담습니다. 필요한 경우, 마우스 혈청을 사용하여 4 °C에서 10분 동안 단일 세포 현탁액을 블로킹합니다.실험 설계에 따라 항체 용액을 첨가하고 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 각 샘플 펠렛을 희석된 PM으로 한 번 세척합니다. 사멸 세포 제거를 위해 7-AAD를 1:100로 희석하여 최종 농도가 5 million cells/mL가 되도록 조절한 후, 음성 대조군 및 단일 색상 양성 대조군은 상온에서 15분 동안 배양합니다. 세포 펠렛을 0.5 mL의 희석된 PM에 재현탁합니다.모든 세포 현탁액을 라운드 바텀 폴리스티렌 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 이제 적절한 coer 배지 500 µL가 들어 있는 세포 수집 튜브를 준비합니다. 세포 현탁액을 얼음에 박아 세포가 있는 곳으로 운반합니다.무염색 대조군, 음성 대조군, 단일 색상 양성 대조군, 그리고 주요 세포 현탁액 순으로 세포 분류기에서 세포 현탁액을 분류하며, 세포 순도를 극대화하기 위해 레이저 강도, 채널 보정 및 세포 군집 게이팅을 엄격하게 조정하십시오. 원하는 세포 군집을 적절한 수집 튜브에 수집하십시오. 수집된 세포는 4 °C에서 보관하십시오.즉시 파종하지 않을 경우, 갓 분리한 근원성 내피세포를 Type one collagen으로 사전 코팅된 플레이트의 MPM 배지에 파종하여 이후 ECS seed 패키징을 준비하십시오.Type I 콜라겐이 사전 코팅된 플레이트 또는 플라스크의 MPM에 제곱센티미터당 3,500 ~ 4,000개의 세포를 분주하여 배양합니다. 1차 및 2차 계대 배양을 위해 0.2% 젤라틴을 갓 코팅한 플레이트에 갓 분리한 기생충을 egm two에 넣어 분주합니다. PC 배지를 사용하여 일반 폴리스티렌 배양 용기에 세포를 1:3 비율로 분할 배양합니다.P3 이후의 플레이트입니다. 일반 폴리스티렌 배양 플레이트의 PC 배지에서 cm²당 6,500 ~ 7,000개의 세포 밀도로 세포를 배양하십시오. 플라스크의 경우, 일반 폴리스티렌 배양 플레이트의 AC 배지에서 갓 분리된 외배엽 조직 세포를 배양한 후, AC 배지가 담긴 일반 폴리스티렌 배양 플레이트에서 cm²당 6,000 ~ 7,000개의 밀도로 ACS 시드 세포를 후속 패키징하십시오.죽은 세포를 제외한 후, 무염색 대조군, 음성 대조군 및 단일 색상 양성 대조군에서 얻은 데이터를 기반으로 플라스크 팩트 파라미터를 먼저 보정합니다. 이후 형광 표지된 세포 현탁액을 대상으로 일련의 음성 및 양성 세포 표면 마커 선택 과정을 거칩니다. 먼저 CD 45 양성 세포를 게이팅하여 제외합니다. 그다음 CD 45 음성 분획에서 CD 56 양성 세포와 CD 56 음성 세포를 분리합니다.CD 56 양성 분획은 CD 34, CD 1 44 선택 과정을 추가로 거치며, 여기서 이중 양성 세포만이 근원성 내피세포로 표시되어 수집됩니다. 마찬가지로, CD 56 음성 분획은 CD 34, CD 1 46 선택 과정을 추가로 거치며, 여기서 CD 34 음성 CD 1 46 양성 세포만이 기생 세포로 표시되어 수집됩니다. CD 34 양성 CD 1 46 음성 분획은 내피세포를 배제하기 위해 추가적인 CD 31 음성 선택 과정을 거치며, CD 34 양성 CD 31 음성 서브셋만이 수집을 위한 adv 세포로 표시됩니다. 여기서 내피세포(EC) 배제를 위해 CD 31 대신 CD 1 44를 사용할 수 있습니다.이 H-P-V-S-C 하위 집단들은 단일 기증자의 근육 생검 조직에서 정제되었습니다. 일반적인 불균질한 근육 줄기세포와 달리, 인간 혈관 유래 줄기세포 하위 집단의 배양물은 장기간 확장 후에도 균질성을 유지합니다. 아시다시피, 자가 연구자가 저희 실험실에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 이러한 혈관 유래 줄기세포를 분리하는 것이 매우 중요하다고 생각합니다.따라서 저희는 이 기술을 병렬적으로 제시함으로써 연구자들이 저희의 결과를 재현하고, 각 팀의 결과를 실질적으로 비교할 수 있을 것이라고 믿습니다. 신선한 인체 조직을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 니트릴 장갑과 보안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

플라스크에 세포의 준수 속도에 따라 musculoskeletal 부드러운 조직에서 분리 성인 줄기 세포.

소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

체외 배양 시스템은 척추 근육 생성에 대한 우리의 이해에 필수적인 입증했다. 그러나, 많은, 특히 기초 분류군, nonmammalian 골격 근육 발달과 성장에 대해 배웠 겠죠. 이 조직, 근육 조직 전구 세포 (MPC를)의 성체 줄기 세포를 분리하고, 차 문화 속에서 자신의 자기 갱신, 증식 및 분화를 유지하기위한 효율적이고 강력한 프로토콜에 걸쳐 보존 및 분기 규제 메커니즘의 식별 가능 척추 동물의 계통.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

여기에서는 인간 골수(hBM)에서 중배엽 전구 세포(MPC)를 분리하기 위한 최적화되고 재현성이 높은 프로토콜에 대해 설명합니다. MPC는 유세포 분석과 nestin 발현을 특징으로 했습니다. 그들은 혈관 형성 잠재력을 유지하면서 기하급수적으로 증가하는 MSC와 같은 세포 배양을 일으킬 수 있는 능력을 보여주었습니다.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

우리는 골격 근 생검 조직에서 얻은 인간 1 차적인 근육 전구 세포 (hMPCs)를 분리, 배양, 특성화 및 분화하는 기술을 제시합니다.  이러한 방법을 통해 획득되고 특징지어지는 hMPC는 인간 근생 및 골격 근 재생과 관련된 연구 질문을 이후에 해결하는 데 사용될 수 있다.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

우리는 인간 탯줄 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 골격근 혈통으로의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다.

인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.

개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 인간 골격 근육에서 혈관 유래 다능성 전구체 세포를 분리하고 정제하는 방법을. 교원소 분해와 FACS를 통해 근육성 내피세포, 주변세포, 외막세포를 동시에 분리하여 재생의학 연구에 활용합니다.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

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