비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원
February 3rd, 2014
현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.
이 절차의 전반적인 목표는 유전적으로 암호화된 단백질 기반 바이오센서를 사용하여 세포 내 포도당 또는 글루타민의 수준을 비침습적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 플라스미드를 함유한 바이오센서 유전자로 관심 세포를 transection하고 바이오센서를 발현하는 세포를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 배치 또는 공급된 배치 배양에서 세포 배양 샘플을 채취하고 프렛 비율을 측정합니다.
그런 다음 샘플의 세포 내 포도당 또는 글루타민 농도를 독립적인 분석으로 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 샘플의 프렛 비율은 포도당 또는 글루타민의 세포 내 농도를 비침습적으로 실시간으로 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 온라인 최적화 및 제어에 사용할 수 있는 실시간 대사 정보를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법이기 때문에 바이오프로세스 개선으로 확장됩니다.
이 방법은 바이오프로세싱에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 질병 마커 감지를 포함한 다른 시스템에서도 사용할 수 있습니다. 9ml의 완전한 성장 배지에서 CHO 세포를 되살리는 것으로 시작합니다. 그런 다음 세포를 스핀 다운하고 펠릿을 10 밀리리터의 신선한 성장, 배지에 재현탁 한 다음 파란색 다이 배제에서 트리프로 세포를 계수합니다.
다음으로, 125 밀리리터의 밀리리터당 5번째 세포에 대해 10의 3배의 파종 밀도에서 배양을 시작합니다. 궤도 진탕 플랫폼에서 섭씨 37도 및 5%CO2의 셰이커 플라스크. 125 RPM 회전을 통해 3-4일마다 완전한 성장 배지에서 세포 형질 주입을 위해 10의 2배에서 밀리리터당 5번째 세포의 좌석 밀도로 세포를 계대배양합니다.
형질주입 전 12-24시간 동안 세포를 섭씨 37도, CO2 5%로 유지하여 세포가 활발하게 분열하도록 합니다. 그런 다음 플라스미드 DNA를 준비한 후 tripe 및 blue die exclusion으로 세포를 계수하고 세포를 20ml의 세포 배양 배지의 작업 부피로 희석합니다. 125 밀리리터에서 1 곱하기 10의 농도로 플라스크를 흔들어 밀리리터당 6 번째 세포를 흔듭니다.
세포를 함유하는 하나 이상의 negative control well을 포함하지만 DNA는 포함하지 않는 사용 중인 세포주에 적합한 transfection kit를 사용합니다. 형질주입된 세포를 정적 모드에서 4일 동안 배양합니다. 이제 plasmid selection에 적합한 항생제를 kill curve에 의해 결정된 적절한 농도로 첨가합니다.
예를 들어, 이 연구에서는 형질주입된 세포를 선택하기 위해 밀리리터당 400g의 최종 농도에 진을 첨가한 다음 배양물을 125RPM으로 회전하는 진탕 플랫폼으로 옮겼습니다. 세포주에 대해 적절한 시간 간격으로 배지를 변경하고, 대조군 웰의 세포가 죽을 때까지 매번 항생제를 첨가합니다. 가장 합류하는 우물을 사용하여 흔들리는 문화로 진행하십시오.
그런 다음 10 배에서 7번째 생존 가능한 세포를 1 밀리리터의 동결 혼합물에 1배로 함유한 극저온 바이알에서 세포를 동결하여 배치 및 공급된 배치 성장 곡선을 생성합니다. 먼저, 50ml의 작업 부피를 가진 250ml Shake 플라스크에서 형질주입된 CHO 세포의 3중 세포 배양을 확립합니다. 그런 다음 진탕하여 가습된 세포 배양기에 배양액을 넣고 24시간 간격으로 각 성장 배양액에서 4.1mL 샘플을 제거합니다.Fed 배치 배양의 경우 6일째에 세포에 적절한 양의 포도당 또는 글루타민을 보충하여 농도를 초기 값으로 복원합니다.
대조군 배양액에 동일한 양의 순수를 공급하면 매일 4.2회에서 100마이크로리터의 4.1ml 샘플을 사용하여 생존 세포 농도가 0으로 감소할 때까지 트립 및 블루 다이 배제로 세포를 계수합니다. 프렛 비율을 결정하기 위해, 측정, 일일 샘플 2ml를 원심분리하고 펠릿을 2ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시키고, 세포 현탁액의 절반을 6웰 플레이트로 옮기고, 세포가 없는 빈 샘플을 1에 추가합니다. 그런 다음 즉시 35나노미터의 대역폭으로 430의 여기 파장과 35나노미터의 대역폭으로 465의 임무 파장과 10나노미터의 대역폭으로 520의 청색 및 황색 형광 수준을 측정합니다.
검출된 노란색 형광과 청색 형광의 비율을 결정하여 프렛 비율을 계산합니다. 이제 일일 샘플의 마지막 2 밀리리터를 스핀 다운시킨 다음 두 번째 세척 후 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척하십시오. 샘플을 3분 동안 5회 초음파 처리하며, 매번 15초 동안 켜고 15초 동안 끕니다.
마지막으로, 제조업체의 지침에 따라 대사 산물 분석을 수행하고 결과 표준 곡선을 사용하여 세포 내 포도당 또는 글루타민 수치를 적절하게 계산합니다. 이 대표적인 실험에서, 두 세포주의 배치 과성장 배양은 각 세포주의 생체 내 보정에 사용된 일일 샘플로 방금 설명한 바와 같이 유지되었습니다. 세포 내 포도당 또는 글루타민 수준과 관련된 두 세포주의 대표적인 생존 가능한 세포 성장 프로파일이 이 그래프에 나와 있으며, 효소 분석에 의해 결정된 해당 프렛 측정 및 세포 내 대사 산물 농도가 이 표에 나와 있습니다.
배양 첫 4일 동안 존재하는 낮은 세포 수가 신뢰할 수 없는 프렛 신호로 이어지는 것으로 확인되었습니다. 마찬가지로, 배양 8일차 이후에 존재하는 높은 수준의 세포 용해물은 많은 양의 광 산란을 생성했습니다. 따라서 4일에서 8일까지의 데이터만 포도당 및 글루타민 섬유에 대한 검량선을 구성하는 데 사용됩니다.
결과는 FIB 신호가 포도당의 경우 1-5밀리몰, 글루타민의 경우 0.3-2밀리몰 사이의 세포 내 농도와 신뢰할 수 있는 상관관계를 생성한다는 것을 나타냅니다. fibs 결과를 검증하기 위해 두 세포주의 공급된 bash 과성장 배양액을 수행했습니다. 세포 배양 6일째에 높은 기질 농도를 함유한 사료를 보충하여 기질의 세포외 농도를 높였습니다.
이식편이 묘사하듯이, 매일 프렛 비율은 먹이에 대한 명확한 반응을 보입니다. 추세를 역전시킴으로써 그들은 6일째까지 그 뒤를 따랐다. 예를 들어, 포도당 공급 배양물에서 세포 외 포도당 농도는 최대 36밀리몰까지 다시 증가했습니다.
글루타민 공급 배양물에서 글루타민 농도는 4 밀리몰로 증가했습니다. 포도당 실험에서, 포도당 fibs에 대한 프렛 비율은 포도당의 첨가에 대한 반응으로 7일째에 감소된 세포주를 선택했습니다. 포도당 fibs는 구성에서 APO를 따르기 때문입니다.
유사하게, 글루타민 실험에서, 글루타민 fibs에 대한 프렛 비율은 APO 오프 센서의 원리에 따라 글루타민 첨가에 반응하여 증가된 세포주를 선택했습니다. 이러한 프렛 측정은 최종적으로 앞서 언급한 보정 곡선을 기반으로 해당 세포 내 포도당 및 글루타민 농도를 계산하는 데 사용되었습니다. 그들은 포도당과 글루타민 효소 분석실험으로 결정되는 것과 같이 이 기질의 실제적인 세포내 농도와 비교되고, 그것의 발달 후에 충분한 일치를 보여줍니다.
이 기술은 해당 분야의 연구자들이 단백질 생산성에 대한 다양한 배지 제형의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 사용하여 세포 내 대사 산물 농도를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 비침습적 대사 프로파일링을 위한 Förster 공명 에너지 전이 통합 생물학 센서(FIBS)의 보정 방법을 제시합니다. FIBS를 통해 세포 내 대사 산물 수준을 측정할 수 있어 대사 모델의 개발과 생물 공정 조건의 고속 스크리닝이 용이해집니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생명공학
- 대사 프로파일링
배경
- 유전자 부호화 단백질 기반 생물 센서는 대사 산물 모니터링에 사용됩니다.
- 비침습적 기술은 실시간 분석에 중요합니다.
- 대사 과정 이해는 생물 공정 최적화를 향상시킬 수 있습니다.
- 이 방법은 온라인 제어를 위한 신뢰할 수 있는 대사 정보를 제공합니다.
연구 목적
- 세포 내 포도당 또는 글루타민 수준을 비침습적으로 모니터링합니다.
- 실시간 대사 데이터를 통해 생물 공정을 개선합니다.
- 대사 모델 개발을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 생물 센서 유전자 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.
- 생물 센서를 발현하는 세포를 선택합니다.
- 세포 배양 시료로부터 FRET 비율을 측정합니다.
- 독립적인 분석을 통해 대사 산물 농도를 결정합니다.
주요 결과
- FRET 비율은 세포 내 대사 산물 농도와 상관관계가 있습니다.
- 침습적 기술 없이 실시간 모니터링이 가능합니다.
- 이 방법은 생물 공정의 온라인 최적화에 적용 가능합니다.
- 신뢰할 수 있는 대사 정보를 효율적으로 얻을 수 있습니다.
결론
- FIBS 기술은 비침습적 대사 프로파일링에 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 생물 공정 제어를 크게 향상시킬 수 있습니다.
- 미래 응용 분야는 다양한 대사 연구로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Noninvasive, real-time monitoring of intracellular metabolites addresses a critical gap in bioprocess optimization and metabolic modeling. By enabling continuous, label-free tracking of glucose and glutamine dynamics in live CHO cells, this approach supports data-driven decision-making in cell culture processes. The method enhances predictive confidence in metabolic models and reduces reliance on destructive sampling, aligning with industry needs for scalable, reproducible analytical tools in upstream bioprocessing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of metabolic flux and pathway activity in live cells without perturbing the system.
- Operational Value: Provides constitutive, real-time readouts that support longitudinal studies of cellular physiology.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating biosensor signals with independent metabolite quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, ratiometric FRET outputs that are proportional to intracellular metabolite concentrations.
- Operational Value: Enables standardized, high-frequency sampling from batch and fed-batch cultures for calibration and monitoring.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cell lines for downstream metabolite screening and media optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical bioprocess development through consistent, longitudinal data.
- Predictive De-risking: Reduces uncertainty in metabolic modeling by providing empirically grounded, real-time intracellular concentration data.
- Model Refinement: Supports iterative improvement of computational models used in bioprocess design and control.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing real-time metabolic data that informs cell line screening, media optimization, and process control strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of metabolic dependencies and pathway modulation in live cell systems.
- Screening: Enables reproducible, quantitative metabolite measurements across culture conditions for assay standardization.
- Analytics: Delivers ratiometric FRET readouts that serve as quantitative proxies for intracellular glucose and glutamine levels.
- Translational Research: Connects intracellular metabolic states to extracellular feeding strategies in fed-batch processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform for longitudinal metabolic monitoring across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic models through direct, noninvasive intracellular measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of metabolite monitoring in suspension cell cultures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in bioprocess development by reducing metabolic ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of cell lines and media formulations based on validated metabolic performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mammalian cell transfection, and FRET-based fluorescence measurement.
- Dependent on access to fluorescence microscopy or plate reader systems capable of dual-wavelength excitation and emission detection.
- Necessitates standardization of sampling, washing, and lysis protocols to minimize variability in FRET signal.
- Involves adaptation considerations for different metabolite biosensors and host cell lines beyond CHO.
- Limited by the dynamic range of the biosensor and potential interference from cellular autofluorescence or light scattering at high cell density.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Cell Line Revival and Maintenance
2:06
Cell Line Transfection with the Biosensor Gene-containing Plasmid
3:47
Batch and Fed-batch Cell growth Curve
4:44
FRET Ratio Measurements
6:08
Results: Representative Fed-batch Culture and Corresponding FRET Measurements
8:54
Conclusion
5:36
Metabolite Assays
