DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

본 절차의 전반적인 목적은 DNBS(dinitro benzene sulfonic acid)를 사용하여 염증성 장질환(IBD)을 연구할 수 있는 대안적이고 저렴한 방법을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 항문에 부드럽게 삽입하여 DNBS를 직장 내로 투여함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 조직학적 스크리닝과 DNBS로 자극된 조직의 myeloperoxidase 활성을 평가하기 위해 대장의 조직 절편을 채취하며, 최종적으로 거시적 및 미시적 방법을 통해 체중 감소 및 결장염에 미치는 식이 오일의 효과를 평가할 수 있습니다.

기존의 dextran sodium sulfate 방법과 비교하여 이 방법의 주요 장점은 DNBS 방법이 수행하기 쉽고 비용이 저렴하며 재현성이 높다는 점입니다. 이 방법은 IBD 재발에서 스트레스와 우울증의 역할은 무엇인지, 또는 장 손상 및 회복의 기저 기전은 무엇인지와 같이 IBD 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 마우스에 DNBS를 직장 투여하려면 먼저 1 mL 주사기를 19 gauge 바늘에 연결하십시오. 폴리에틸렌 50 카테터를 장착한 후, 새로 조제한 DNBS를 카테터로 흡입하십시오.

다음으로, 마취된 마우스에 티어 겔(tear gel)을 도포하고 손가락 끝으로 동물의 후단부를 가볍게 눌러 원위 결장에 남아 있는 분변을 제거합니다. 이제 카테터를 직장 내로 약 3~4cm 정도 천천히 삽입하면서, 삽입을 용이하게 하기 위해 소량의 DNBS 용액을 주입하여 결장을 윤활합니다. 카테터가 제자리에 위치하면, DNBS 100 µL 또는 대조군 동물의 경우 동일한 부피의 50% ethanol을 주입합니다.

그 다음, 시약의 손실을 방지하기 위해 동물의 머리를 아래 방향으로 90초 동안 유지합니다. DNBS 투여 후, 첫 일주일 동안 탈수를 예방하기 위해 0.2% saline에 8%sucrose를 섞은 물을 동물에게 급여합니다. 실험 기간 동안 정해진 시점까지 동물의 체중 감소, 탈수 또는 고통 상태를 매일 주의 깊게 모니터링합니다.

DNBS 유도 후, 안락사시킨 동물의 복강을 절개하고 대장 전체를 적출합니다. 그런 다음 장을 세로 방향으로 절개합니다. 결장의 원위단에서 근위쪽으로 약 2~3 cm 지점에서 육안으로 확인 가능한 점막 궤양이 관찰되어야 합니다.

실험 동물의 거시적 손상이 가장 심한 부위의 근위부에서 0.5 centimeter 섹션을 채취하고, 대조군 동물의 해당 해부학적 위치에서 결장 분절을 채취합니다. 그 다음, 마이엘로퍼옥시다제(myelo peroxidase) 활성 평가를 위해 대조군 1개와 1D NBS 처리군 1개의 0.5 centimeters 섹션을 액체 질소로 급속 냉동시키고, 나머지 섹션들은 조직학적 분석을 위해 10% 중성 완충 포르말린에 넣어 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날 아침, 포르말린 고정된 조직을 70% 에탄올로 세척한 후 카세트에 넣어 조직학 전문 시설로 보내 파라핀 매립 및 hematoxylin and eosin 염색을 통해 조직학적 점수를 산출합니다.

그 다음, 각 동물로부터 얻은 최소 3개의 조직 절편을 광학 현미경으로 관찰하여 각 그룹의 조직학적 손상 점수를 결정합니다. DNBS로 자극된 조직의 myeloperoxidase 활성을 분석하기 위해, 먼저 급속 냉동된 대조군 및 실험군 조직을 myeloperoxidase 균질화 완충액으로 균질화하여 완충액 1 mL당 대장 절편 50 mg이 포함된 현탁액을 만듭니다. 그런 후, 균질화된 용액을 1 mL씩 분주하고 4°C에서 10,000 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 각 분취액 100 µL를 개별 큐벳에 옮기고 IDE, dihydrochloride 및 과산화수소가 첨가된 PBS 2.9 mL를 넣은 후 격렬하게 혼합합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 460 nm에서 흡광도 속도를 측정합니다. 방금 시연한 것과 같이 DNBS를 이용한 직장 내 투여를 수행한 후 진행합니다.

어유 또는 카놀라유를 보충한 쥐에서는 48시간 이내에, 홍화씨유를 보충한 쥐에서는 72시간 이내에 유의미한 체중 감소가 관찰되었습니다. 최대 체중 감소는 어유를 보충한 쥐에서는 48시간에, 카놀라유 또는 홍화씨유를 보충한 쥐에서는 72시간에 나타났습니다.

체중 증가는 72시간 후에 재개되었으며, DNBS 투여 5일 후 어유 및 홍화유 처리군의 체중은 기저치와 유사한 수준을 보였습니다. 식이 오일을 보충하고 직장 내 에탄올을 투여한 대조군 쥐들은 5일의 전체 연구 기간 동안 꾸준히 체중이 증가했습니다. DNBS에 의해 유발된 장 손상은 광범위하게 나타날 수 있습니다.

그러나 최대 손상 부위는 일반적으로 쥐(rats)의 경우 결장 원위부 6cm, 생쥐(mice)의 경우 원위부 3cm에 국한되어 나타납니다. 세밀한 조직학적 평가 결과, 궤양 형성, 호중구 및 림프구 침윤, 점액 고갈 및 부종을 포함한 광범위한 상피 손상이 관찰됩니다. DNBS 자극 시 이러한 염증 및 조직 손상의 조직학적 징후가 세 가지 식용유 보충군 모두에서 뚜렷하게 나타나지만, 가장 심각한 손상은 홍화씨유군에서 관찰되었으며 카놀라유군이 그 뒤를 이었습니다.

반면, 생선유 투여군 쥐는 상피 손상이 최소화되었으며 점막하층으로의 염증 세포 침윤이 제한적으로 나타났습니다. 시료 간의 조직학적 손상 차이를 정량화하여 그룹 간의 더 정확한 비교가 가능합니다. 그래프는 DNBS 결장염 유발 시 세 가지 식이유 그룹의 조직학적 손상 점수를 보여줍니다.

H&E 염색 절편에서 관찰된 바와 같이, 홍화씨유 보충군에서 손상 정도가 가장 심하게 나타났으며, 카놀라유 군이 그 뒤를 이었습니다. 어유 군은 손상 정도가 가장 낮게 나타났으나, 특히 중성구의 염증 세포 침윤 정도는 myeloperoxidase 활성 분석을 통해 추가로 확인할 수 있습니다. 이는 조직학적 손상 점수에서 예상된 결과와 일치합니다.

DNBS 노출 5일 후 쥐 대장의 마이엘로퍼옥시다제(myelo peroxidase) 활성을 평가한 결과, 세 그룹 모두에서 활성이 증가했으며, 홍화씨유 그룹에서 가장 높은 마이엘로퍼옥시다제 활성이 관찰되었고, 카놀라유 그룹과 어유 그룹이 그 뒤를 이었습니다. 이 절차를 수행할 때는 마우스를 가볍게 마취하고 DNBS 투여량을 최적화하는 것이 중요합니다. 이 기술은 염증성 장질환(IBD) 분야의 연구자들이 IBD 동물 모델에서 장 염증을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

DNBS를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 용액을 조제하는 동안에는 항상 보호복, 장갑, 고글 및 안면 보호구와 같은 보호 장구를 착용해야 함을 잊지 마십시오.