DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

이 절차의 전반적인 목표는 DY 니트로 벤젠 존산 또는 DNBS를 사용하여 염증성 장 질환 또는 IBD를 연구할 수 있는 저렴한 대안 방법을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 항문에 부드럽게 삽입하여 DNBS를 직장 내 투여함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 조직학적 스크리닝을 위해 대장의 조직 절편을 획득하고 DNBS 챌린지 조직의 골수과산화효소 활성을 평가하기 위해 궁극적으로 체중 감량 및 대장염에 대한 식이유의 효과를 거시적 및 미시적 방법으로 평가할 수 있습니다.

기존 dextron sodium sulfate 방법에 비해 이 문제의 주요 장점은 DNBS 방법이 수행하기 쉽고 저렴하며 재현성이 높다는 것입니다. 이 방법은 IBD 재발에서 스트레스와 우울증의 역할은 무엇인지, 장 손상 및 복구의 기본 메커니즘은 무엇인지와 같은 IBD 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생쥐에서 DNBS를 직장에 설치하려면 19게이지 바늘에 1ml 주사기를 부착하는 것으로 시작합니다. 폴리에틸렌 50 카테터가 장착된 다음 새로 준비된 DNBS를 카테터로 흡인합니다.

다음으로, 마취된 쥐에게 눈물 젤을 바르고 손가락 끝으로 동물의 뒤쪽 끝에 부드러운 압력을 가하여 원위 결장에 존재하는 대변을 제거합니다. 이제 소량의 DNBS 용액을 주입하여 결장을 윤활하여 쉽게 삽입할 수 있도록 하는 동시에 카테터를 직장 내부에 약 3-4cm 정도 부드럽게 삽입합니다. 카테터가 제자리에 놓이면 대조 동물에 대해 100마이크로리터의 DNBS 또는 동일한 양의 50% 에탄올을 주입합니다.

그런 다음 시약이 손실되지 않도록 동물의 머리를 90초 동안 아래로 눕힙니다. DNBS 투여 후 첫 주 동안 탈수를 방지하기 위해 동물에게 0.2%식염수에 8%자당수를 먹이십시오. 실험 기간 동안 체중 감소, 탈수 또는 고통에 대해 동물의 매일을주의 깊게 모니터링하는 것은 원하는 시점을 의미했습니다.

DNBS 챌린지 후 안락사된 동물의 복강을 열고 대장 전체를 제거합니다. 그런 다음 장을 세로로 엽니다. 거시적 점막 궤양은 결장의 원위 끝에서 약 2-3cm 근위부에서 관찰해야 합니다.

대조 동물의 해당 해부학적 위치에서 실험 동물 및 결장 분절의 최대 거시적 손상 부위에 근접한 0.5cm 단면을 수집합니다. 그런 다음 골수과산화효소 활성을 평가하기 위해 액체 질소에서 한 대조군 및 1D NBS 처리 섹션에서 0.5cm를 스냅 동결하고 다른 섹션을 하룻밤 동안 또는 조직학적 분석에서 10% 중성 완충 포르민으로 고정합니다. 다음날 아침, 포르말린 고정 조직을 70% 에탄올로 세척하고 카세트에 넣어 조직학 시설로 보내 파라핀에 묻히고 헤마틴과 어인으로 염색하여 조직학적 채점을 합니다.

그런 다음 광학 현미경으로 각 동물의 조직 절편을 최소 3개 이상 채점하여 각 그룹의 조직학적 손상 점수를 결정합니다. DNBS가 도전하는 조직의 골수과산화효소 활성을 분석합니다. 먼저 골수과산화효소 균질화 완충액에서 스냅 동결 대조군 및 실험 조직을 균질화하여 균질화 완충액 현탁액 1밀리리터당 50밀리그램의 결장 분절을 제공합니다. 다음 균질화된 해결책을 1 밀리리터 부분으로 분취하고 10의, 000배 g 및 4 섭씨 온도에 2 분 동안 그(것)들을 원심분리하십시오.

다음으로, 각 부분 표본 100마이크로리터를 개별 큐벳에 옮기고 IDE, 이염산수소 및 과산화수소가 보충된 PBS 2.9ml를 격렬하게 혼합합니다. 마지막으로 460나노미터에서 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 방금 시연된 바와 같이 DNBS를 사용한 직장 내 챌린지 후.

생선 또는 카놀라유를 보충한 쥐에서는 48시간, 홍화유를 보충한 쥐에서는 72시간까지 상당한 체중 감소가 관찰됩니다. 관찰된 최대 체중 감소는 피시 오일, 보충제를 섭취한 쥐에서 48시간, 쥐에서 72시간에 발생합니다. 카놀라유 또는 잇꽃유가 보충되었습니다.

체중 증가는 72시간 후 재개되었으며 DNBS 투여 후 5일이 지났을 때 어유 및 홍화유 투여군은 기준선 값과 유사한 체중을 나타냈습니다. 식이 오일을 보충하고 직장 내 에탄올을 투여한 대조군 쥐는 5일간의 연구 기간 동안 꾸준히 체중이 증가했습니다. DNBS로 인한 장 손상은 널리 퍼져 있을 수 있습니다.

그러나 최대 손상 영역은 일반적으로 쥐의 경우 결장의 원위 6cm, 마우스의 경우 원위 3cm에 국한됩니다. 조직학적 평가를 면밀히 검토한 결과, 궤양 형성, 호중구 및 림프구 침윤, 점액 고갈 및 부종을 포함한 광범위한 상피 손상이 관찰되었습니다. DNBS에 도전한 3가지 식이유 보충제 그룹 모두에서 염증 및 조직 손상의 이러한 조직학적 징후가 분명하지만, 가장 심각한 손상은 홍화유 그룹에서 나타나고 그 다음은 카놀라유 그룹입니다.

반면 피시 오일 그룹의 쥐는 상피 손상이 최소화되고 염증 세포가 점막 cosa로 제한적으로 침투하는 것을 보여줍니다. 샘플 간의 조직학적 손상의 차이를 정량화하여 그룹 간의 더 나은 비교를 가능하게 할 수 있습니다. 이 그래프는 DNBS 대장염 동안 세 가지 식이 오일 그룹에 대한 조직학적 손상 점수를 보여줍니다.

h 및 e 염색 섹션에서 관찰된 바와 같이, 홍화유 보충 그룹이 가장 큰 손상 정도를 나타내고 카놀라유 그룹이 그 뒤를 잇습니다. 피쉬 오일군이 가장 적은 피해를 보이지만, 특히 호중구의 염증성 세포 침투 정도는 골수과산화효소 활성 분석을 수행하여 추가로 검사할 수 있습니다. 조직학적 손상 점수에서 예상한 대로.

DNBS 노출 후 5일째에 쥐 결장에서 골수성 과산화효소 활성을 평가한 결과, 홍화유 그룹에서 관찰된 골수과옥시다제 활성이 가장 높았고, 카놀라유 그룹과 어유 그룹이 그 뒤를 이었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 마우스를 가볍게 마취하고 개발 후 DNBS 용량을 최적화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 염증성 장 질환 분야의 연구자들이 IBD의 동물 모델에서 장 염증을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

DNBS로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 솔루션을 준비하는 동안 보호복, 장갑, 고글 및 얼굴과 같은 예방 조치를 항상 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.