Name: 신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 신경 밀도 코어 소체의 PALM 초해상도 이미징 방법을 통해 소포 조직을 정량 분석하는 기술입니다. 히포캠푸스 뉴런에서 소포 클러스터링과 시냅스 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은, (BAS에) 2 R15 GM061539-02을 부여 (JEL에) 2 R15 NS40425-03, MH 66179 (오레곤 보건 과학 대학 / OHSU 박사 게리 은행에)는 건강의 국립 연구소에 의해 지원하고, P30했다 NS061800 (OHSU의 박사 슈 아이 허에). 우리는 해마 신경 세포의 문화에 광범위한 지원을위한 바바라 Smoody 감사합니다, 박사 부부. 이 원고의 중요한 읽기 브라이언 긴 제임스 아브 네이.

1. 샘플 준비 <ol><li> 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, DCVs을 대상으로 photoconvertible 또는 광활성 키메라를 코딩하는 DNA를 준비합니다. 참고 : 하나의 가능성은 DNA의 인코딩 조직 플라스 미노 겐 활성제-Dendra2 키메라 (TPA-Dendra2). Dendra2은 녹색에서 자외선 (12)에 노출시 적색 발광으로 전환 photoconvertible 단백질이다. </li><li> 고성능 # 1.5 커버의 문화 해마의 신경 세포는 표준 프로토콜 13 다음 ~ 5-10 일 동안 미끄러. </li><li> 양이온 성 지질 시약을 사용하여 해마의 신경 세포를 개발하는 형질. 참고 : 바이러스 성 매개 감염이 성숙한 신경 세포에 대한 더 효과적입니다. 이러한 대안은 다른 곳에서 14 상세히 설명되었다. <ol><li> ~ DNA 1 μg 최소 필수 배지 (MEM)와 양이온 성 지질 시약 4 μL, 250 μl를 함유하는 제 1.5 ㎖의 튜브 250 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브를 준비MEM의. </li><li> 5 분 솔루션을 품어. </li><li> 두 용액을 결합하고 추가로 30 분 동안 생성 된 혼합물을 배양한다. </li><li> 배양시 배양 배지의 여러 ML을 포함하는 요리는 37 ℃로 가온 준비 </li><li> 부드럽게 따뜻한 매체를 포함하는 요리에 신경을 포함하는 커버 전표를 전송하고 형질 전환 혼합물을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 요리를 기울 후 90 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 그들의 &quot;가정 요리&quot;에 신경을 반환하고 ~ ~ 18 시간을 기다립니다. </li></ol></li><li> 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 45 분 동안 세포를 수정 (PBS, pH를 7.4) 37 ℃로 가온 참고 : PALM 실험에서, 미세 구조의 양호한 보존을 달성하기 위해 중요하고, 면역 형광 염색법에 사용되는 표준 포름 알데히드 고정 프로토콜은 일반적으로 15 충분하지 않다. 가난한 구조 보존을위한 하나의 중요한 이유는 충분 F입니다포름 알데히드는 고정 부가 형성 및 단백질 가교 결합을 포함하고, 후자의 공정은 16 꽤 느리다 ixation 시간 때문이다. 45 분 고정 형광 감지 할 수없는 overfixation에 의한 손실이 문제를 완화하는 데 도움이됩니다. </li><li> 워시 커버 필터링 PBS와 함께 ~ 10 배를 미끄러 져. 참고 :이 형광 오염 물질을 줄일 수 있습니다. 이미지 샘플 상대적으로 신속하게 고정 후. 빛 단단한 용기에 여과 PBS에서 4 ° C에서 임시 저장 세포. </li><li> 필터링 PBS에서 챔버의 뉴런을 포함하는 마운트 커버 전표. 주의 : 샘플이 유리보다 낮은 굴절률을 가진 PBS와 같은 수성 매질, 장착되어야 전반사 형광 (TIRF) 기반의 조명을 구현할. 전용 커버 슬립 - 근위 형광 흥분 때문에 TIRF 기반의 조명은 매우 유용하고, 배경 형광 17에 큰 관련 드롭이있다. </li></ol> 2. 이미지 수집 &lt;/ P&gt; <ol><li> 슈퍼 해상도 이미징 시스템을 켭니다. <ol><li> 아크 램프를 켭니다. </li><li> 에 (전원 원격 스위치) &quot;시스템 / PC&quot;와 &quot;구성 요소&quot;스위치 뒤집기 &quot;에 있습니다.&quot; </li><li> 컴퓨터 (현미경 제어 태블릿 / 도킹 스테이션 이후에 제공)을 켭니다. 주 : 도킹 스테이션은 광학 및 광로의 많은 특성, 목적 및 포커스의 특히 선택을 제어하고 감시하는데 사용될 수있다. </li><li> 두 소프트웨어 아이콘을 클릭하고 로그인 대화 상자에서 &quot;시작 시스템&quot;옵션을 선택합니다. </li></ol></li><li> 샘플을 검사합니다. <ol><li> 레이저 안전 캐비닛의 전면 및 상단 액세스 패널을 엽니 다. </li><li> 무대와 목표에 액세스 할 수 투과광 팔을 기울이십시오. </li><li> 알파 계획 - 고차 색지움 100X 개구에 기름을 넣어 / NA는 1.46 (TIRF) 목적 =. 참고 : 63X 높은 NA 목적은 100X 대신에 사용될 수있다. </li><li> 무대에 샘플을 장착하고, 일을 높이고샘플을 향해 전자의 목표. </li><li> 도킹 스테이션의 XYZ 함수를 사용하여 렌즈 위치를 모니터한다. 렌즈의 초점이 야구장 (예를 들어, Z ~ 2.50 mm)에있을 때 중지합니다. </li><li> 완전히 액세스 패널을 닫습니다. 참고 : 레이저 안전을 참여. </li><li> 미세 조정 위치 탭의 접안 및 버튼을 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 참고 : 위치 탭 아크 램프 기반의 조명을 생산하고 접안하여 샘플의 직접 관찰을 용이하게 버튼에 대한 액세스를 제공합니다. 마찬가지로, 인수 탭 레이저 기반의 조명을 생산하고 카메라가 이미지 캡처를 용이하게 도구에 대한 액세스를 제공합니다. <ol><li> 선택 위치 탭으로 이동하여 &quot;트랜스에 있습니다.&quot; </li><li> 안구 확장 기호를 클릭합니다. 참고 :이 빛의 경로를 개략적으로 나타납니다. 빛의 경로 속성은 왼쪽 회로도에 해당 아이콘을 클릭하거나 도킹 스테이션에 터치 스크린을 사용하여 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 필터Dendra2에서 방출을보기위한 적절한 반사기 리볼버 아이콘을 사용하여 선택할 수 있습니다. </li><li> 접안 렌즈로보고, 가이드로 도킹 스테이션을 사용하여 초점으로 세포를 가져옵니다. 참고 : 해마 신경 세포가 형질하기 어려운, 그리고 따라서 반사 조명을 사용하여 초점을 좀 까다로운 일이 될 수 있기 때문에 샘플이 매우 띄엄 띄엄 형광 세포로 채워집니다. 이 경우, 가이드로서 송신 조명 및 도킹 스테이션의 Z 판독을 사용한다. </li><li> 집중 후 &quot;Off&quot;로 빛을 전환합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상당히 밝은 반점이 형광을 전시하고, 건강을 나타내는 고전적인 형태를 가지고있는 세포를 식별합니다. <ol><li> 반사 된 빛과 Dendra2에서 녹색 방출을보기위한 필터의 적절한 선택. </li><li> 낮은 강도의 여기 광을 사용하여 Dendra2의 키메라를 발현하는 세포의 커버 슬립을 검색합니다. </li></ol></li><li> ACQ로 전환uisition 탭을 클릭합니다. <ol><li> 적절하게 설계되거나 쉽게 수정 PALM 수집 구성을로드하기 위해 &quot;실험 관리자&quot;를 사용합니다. 참고 : 레이저 파워 슬라이더 : 그런 실험이 존재하지 않는 경우, 지침으로 다음 설정을 사용하여 시작하는 실험 설계 구성 (405) 뉴 멕시코 (~ 50 mW의 레이저 0.01 %); 488 nm의 (~ 100 mW의 레이저 3 %); 561 nm의 (~ 100 mW의 레이저 40 %) 노출 시간 : ~ 50 밀리 초; 카메라 게인 ~ 200; 다차원 취득 : 시계열 (사이클 = 30,000, 구간 = 0); 트랙 : 에피 조명 488 nm의 및 TIRF 기반 조명 (단계 2.5.1 참조) 561 nm의; 목적 : 100X (NA가 1.46 =); TIRF 각도 슬라이더 : 입사각 ~ 67-72 °; 픽셀의 크기 : 100 nm의; 시야 : TIRF (대안 선택이 더 높은 레이저 강도를 산출하고 표백하기가 더 어렵습니다 형광체에 사용됩니다). </li><li> 팝업 메뉴가 레이저에 전환에 대한 쿼리와 함께 표시 할 때 &quot;예&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 가져와카메라 평면에 초점 세포의. <ol><li> 488 nm의 에피 조명 레이저 트랙을 선택합니다. 참고 : 트랙 이미징 동안 사용되는 빔 구성되어 있습니다. 여기서, 트랙 이름은 카메라로 전달되는 발광을 생성 여기 파장에 의해 결정된다. 예를 들어, 561 nm의 트랙은 405과 561 나노 레이저 라인을 모두 사용하지만 필터 큐브는 카메라 (561) nm의 광에 의해 여기 photoconverted Dendra2으로부터 만 발광을 통과한다. </li><li> &quot;연속적인&quot;수집 버튼을 사용하여 카메라에 셀의 초점을 맞춘다. </li></ol></li><li> 기존 위드 이미지를 수집합니다. <ol><li> &quot;스냅&quot;버튼을 사용합니다. </li><li> &#39;파일&#39;메뉴로 이동을 선택하여 이미지를 저장합니다 &quot;다른 이름으로 저장 / 저장합니다.&quot; </li></ol></li><li> TIRF 기반의 조명을 설정합니다. <ol><li> 488 트랙을 선택하고 EPI / TIRF 버튼을 사용하여 &quot;TIRF&quot;로 전환합니다. </li><li> &quot;연속&quot;인수를 선택합니다. </li><li> T를 조정그는 TIRF 기반 조명 슬라이더. 참고 :이 배경 갑자기 어두워이며 표본은 한 평면 (18)에 집중 될 때 TIRF는 달성된다. 새로운 기능이 샘플들로 포커싱을 통해 명백해질 경우 TIRF에서 초점이 하나의 평면이 있기 때문에, 입사 각도가 너무 낮다. </li><li> 이중 405 nm의 레이저로 561 트랙을 사용하여 TIRF 각도를 체크 &quot;해제.&quot; </li><li> PALM 실험을 시작하기 전에 &quot;의&quot;다시 405 nm의 레이저를 켭니다. </li></ol></li><li> PALM 데이터를 수집합니다. <ol><li> &quot;실험을 시작합니다.&quot;HIT 참고 : 원하는 경우, &quot;온라인 처리 옵션&quot;탭을 열고 원시 데이터를 수집하는 동안 복원 PALM 이미지를 모니터링하는 (실험을 시작하기 전에) &quot;온라인 처리 PALM&quot;과 &quot;적당한 Gauss2D&quot;를 확인합니다. 이것은 데이터의 품질과 상대적으로 시간 소모적 인 데이터 수집 프로세스를 계속하는 따라서 값의 평가를 용이하게 할 것이다. </li><li> 시각광 변환을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 405 nm의 (photoconverting) 레이저의 강도를 증가하면 Dendra2의 광 변환이 줄어든다 (일반적으로 ~ 10,000 RAW 이미지의 취득 후). </li><li> 광 변환이 증가하면 실험을 계속합니다. 그렇지 않으면, &quot;중지&quot;현재 단계 버튼을 눌렀을 때 (데이터의 손실없이) 실험을 중지합니다. </li><li> 데이터 수집 (~ 15 분 후) 완료되면 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 프로세싱, 디스플레이 및 분석 <ol><li> 디스크에 저장된 온라인 처리, 처리로 이미지의 부재. <ol><li> , 처리 탭을 클릭하는 방법 탭을 열고 선택 &quot;PALM을.&quot; </li><li> 네 개의 하위 옵션에서 다시 &quot;PALM&quot;를 선택합니다. </li><li> 열려있는 파일 메뉴로 이동하여 그 파일을보고, 히트 &quot;를 선택합니다.&quot; </li><li> 히트 &quot;에 적용됩니다.&quot; 참고 :이 기본 OPTI와 피크 / 형광 찾는 피크 지역화를 시작합니다기능. 필요한 경우, 피크는 &quot;PAL-그룹&quot;탭을 사용하여 그룹화 할 수 있습니다. 그룹화는 최대 좌표가 충분히 유사한 경​​우 하나의 분자에 여러 개의 연속 프레임에 나타나는 피크를 할당합니다. 또, 데이터는 소프트웨어의 모델 - 기반 드리프트 정렬 옵션을 사용하여 샘​​플 드리프트 보정 될 수있다. </li></ol></li><li> 피크 지역화 된 데이터에 제대로 지역화 저조한 샘플 구성 요소를 필터링합니다. <ol><li> 현지화 정밀도와 형광 물질을 폐기, σ&gt; &quot;PAL-필터&quot;도구를 사용하여 35 nm의. </li><li> 봉우리, D 사이의 평균 거리, 직경, D.의 소포를 해결하기에 너무 큰 영역에서 형광을 폐기 <ol><li> 현지화 정밀 히스토그램에서, σ, 평균 현지화 정도의 ​​압축을 풉니 다. </li><li> σ에 기초하여 D를위한 최대 허용 값 및 섀넌 - 나이 퀴 스트 criteron 19을 계산 해상도 근사값 20 R에서 구체화 = D =[(2.35σ) 2 + (2D) 2] 1 / 2. </li><li> 반경 D / 2의 원 안에 / (4D 2) πD 2 미만으로 둘러싸인 봉우리를 삭제하려면 &quot;PALM의 이상 값을 제거&quot;도구 이웃 임계 값을 설정합니다. </li></ol></li><li> &quot;PAL-렌더링&quot;도구를 사용하여 PALM 이미지로 처리 PALM 데이터를 변환; 그림 1을 참조하십시오. </li><li> &quot;프로필&quot;기능을 선택하여 크기와 간격을 정량화. <ol><li> 관련 라인과 테이블 옵션을 확인하고 이미지에서 원하는 방향을 따라 선을 그립니다. </li><li> 반 최대 강도로 전체 폭을 결정하여 직경을 정량화. </li><li> 강도 프로파일의 피크 - 투 - 피크 간격을 측정하여 간격을 정량화. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

PALM 및 관련 최고 해상도의 형광 현미경 기술은 최근 광학 현미경과 전자 현미경 (EM) 22 ~ 24의 잘 확립 된 형태의 귀중한 보완 등장했습니다. PALM의 긍정적 인 특성은 비교적 간단한 샘플 준비 최소한의 샘플 섭동 (perturbation)이 (가) 있습니다. 원칙적으로, PALM는 살아있는 세포를 연구 할 수있다. 아마 PALM의 주요 음의 속성은 크게 살아있는 세포에 빠르게 동적 프로세스의 연구를 방해 시간이 소요되는 데이터 수집이다. 또한, PALM은 비교적 새로운, 따라서 적절한 강력한 형광 및 샘플 준비를위한 데이터 수집 및 분석을위한 프로토콜은 완전히 개발 및 / 또는 3 문서화되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 고정, 배양 된 세포에있는 소포의 단일 색상, PALM 기반 연구에 적합 프로토콜을 설명했다. 프로토콜은 또한 유사의 개발을위한 좋은 출발점감독, 듀얼 컬러 PALM 연구. 우리의 프로토콜의 효능은 우...

세포 프로세스의 숫자는 특정 세포 내 목적지로 생체 분자의 정확하고 효율적인 소포 - 중재 인신 매매에 따라 달라집니다. 한 가지 눈에 띄는 예는 잠재적으로 말초 사전 및 시냅스 사이트 1에 신경 소마의 생합성의 사이트에서 시냅스 성분의 긴 원거리, 소포 - 중재 배달로 시작되는 시냅스 어셈블리입니다. 형광 현미경 소포 인신 매매를 공부 강력하고 인기있는 방법입니다. 기술의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상 2와 호환이 (가) 있습니다. 불행하게도, 비교적 최근까지,이 기술은 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 한 가지 큰 약점, 회절 제한 해결 방법 2, 고통했다. 최근, 형광 현미경의 측 방향 해상도 초해 형광 미시간의 도입으로 회절 장벽을 능가같은 PALM 3과 croscopy 기술. PALM의 측면 해상도는, 수십 나노 미터는 적으로 일반적으로 50 ~ 250 nm의 4 ~ 범위 치수가 소포의 연구에 적합합니다. 그것은 특정 세포 내 사이트에 자신의 인신 매매의 몇 가지 측면을 포함하여 소포의 이전에 액세스 할 수없는 특성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다. PALM 구현하기가 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다. 여기에서 우리는 기공을 갖는 구조의 PALM 연구를 구현하는 방법을 설명하고, 우리는 해마 신경 세포에있는 DCVs의 경우에 대한 우리의 접근 방식의 효과를 보여줍니다. 특히, 우리는 해마 신경 세포의 시냅스에 가설에게 DCVs의 인신 매매를 해결하기 위해 PALM를 사용은 DCV 클러스터 5-8에 의해 매개된다. N 개발에 시냅스 소포의 클러스터 매개 매매그것은 빠른 시냅스 안정화 및 조립 9,10을 용이하게 할 수 있기 때문에 eurons는 흥미로운 가능성이다. DCVs의 클러스터 인신 매매의 지지자들은 클러스터링 6을 지원하는 증거로 외인 DCV화물을 품고 extrasynaptic 형광 puncta에의 큰 외관상의 크기를 인용. 그러나 이러한 puncta에 클러스터링에서 발생하는 것과 회절에서 발생하는 구별 크기 효과에 적합하지 않습니다 회절 제한 형광 현미경 기술을 사용하여 생성 된 이미지에 나타납니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 기존의 위드 형광 및 DCVs을 대상으로 키메라를 표현하는 해마 신경 세포의 PALM 이미지를 수집. 이러한 이미지의 분석은 기존의 이미지에서 추정 extrasynaptic DCV 클러스터의&gt; 92 %, 80 nm의 PALM 이미지에서 (개인 DCV 크기) 11 puncta에로 해결되는 것으로 나타났다. hippoca 개발 DCVs에 적용 따라서, 이들 데이터는 큰폭 클러스터링 가설 무효화mpal 신경.

<table><tbody><tr><td>자이스 팜</td><td>칼 자이스, Inc.</td><td>Zeiss 효율적인 내비게이션 (ZEN) 소프트웨어와 형광 필터 세트 77 HE GFP/mRFP/Alexa633이 포함된</td> <td>Elyra PS.1</td>&nbsp;</tr><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체</td><td>생명 기술</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>생명 기술</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-8501</td><td></td></tr><tr><td>성장 유리 커버 슬립 18mm 1.5D</td><td>피셔 과학</td><td>NC0059095</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

<html> 형광 검출 현대 생물학 및 의료 애플리케이션에서 사용 많은 널리 활용하고 신속하게 진행 현미경 기술에 대한 기반을 제공합니다. 형광의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상과의 호환성이 (가) 있습니다. 불행하게도, 형광 현미경의 전통적인 형태 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 영상 평면에서 하나의 주요 약점, 회절 제한 해상도에서 고통. 최근, 이러한 제한은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM)와 같은 초 고해상도 형광 현미경 기술의 도입으로 극복하고있다. 는 기존의 대응과는 달리, PALM은 수십 나노 미터의 측면 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다. 그것은 세포의 구조 및 조직의 이전에 액세스 할 수없는 속성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다. _content &quot;&gt; 불행히도, PALM 구현하기 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다.이 문서에서는, 우리는 고정 된 배양 된 신경 세포의 기공을 갖는 구조의 단일 색상 PALM 연구를 구현하는 방법을 보여줍니다. PALM은 이상적으로 50 ~ 250 nm의 ~에서. 우리의 접근의 주요 단계를 포함 일반적으로 범위 치수가 소포의 연구에 적합와 간헐적 샘플링 RAW 이미지를 수집, photoconvertible (빨강 녹색) 소포화물의 키메라와 신경 세포를 라벨 수퍼 - 해상도 현미경 시스템, 고해상도 PALM 화상을 생성하는 것의 이미지를 처리​​. 또한 반박되는 배양 된 해마 뉴런 고밀도 코어 소포 매우 잘 해결 이미지 (DCVs)을 제시하여 우리의 접근 방법의 효능을 입증 DCVs의 extrasynaptic 매매는 DCV 클러스터에 의해 주로 매개되는 가설.

도 1은 이미징 처리 한 최종 제품을 나타낸다. 본 PALM 콘텐츠에서 지역화 형광체의 가로 좌표를 중심 디스플레이 모드를 사용하여 도시하고, 연관된 DCV의 수퍼 - 해상도 화상을 가우시안 디스플레이 모드를 사용하여 도시된다. 그림 2A는 유사한 위드와 TPA-Dendra2을 표현 체외 해마 신경 세포에있는 여덟 일 소마와 인접 프로세스의 PALM의 이미지를 보여줍니다. 이미지의 중요한 기능은 종래와 PALM 이미지에서 puncta에 사이 (1) 유용한, 일대일 대응하고, 오버랩을 포함, PALM의 puncta에 (2) 상당히 작은 크기, 및 (3) 임시 해상도 여러 PALM의 puncta에에 단일 위드의 눈물 점. 그림 2B는 TPA-Dendra2을 표...

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

다음 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경으로는 도달할 수 없는 해상도로 소낭 조직의 중요한 측면을 규명하는 초고해상도 형광 이미지를 얻는 것입니다. 이는 먼저 소낭 화물의 광전환 키메라를 인코딩하는 DNA로 해마 뉴런을 형질전환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 초고해상도 현미경 시스템을 사용하여 희소하게 샘플링된 원본 이미지를 수집합니다.다음으로, 초해상도 이미지를 생성하기 위해 원본 이미지를 처리합니다. 마지막 단계에서는 소포의 조직 구조를 규명하기 위해 데이터를 정량화합니다. 최종적으로, 펀크타(puncta) 강도의 라인 프로파일을 사용하여 소포 간 거리와 소포 너비를 비교함으로써, 이 절차를 통해 소포들이 클러스터를 생성할 만큼 충분히 가까이 있는지 판단할 수 있습니다.단색 광활성화 국소화 현미경(photo activated localization microscopy) 또는 PALM은 대부분의 배양 세포 유형에서 세포 소기관의 조직을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이미지 획득을 위해 초고해상도 이미징 시스템을 가동하려면 먼저 아크 램프의 전원을 켭니다. 다음으로, 전원 리모컨에 있는 시스템 PC 및 구성 요소 스위치를 켭니다.현미경 제어 태블릿의 전원이 켜지면 스위치를 on으로 전환하고, 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 실행하십시오. 부팅 상태 창을 확장하여 시스템이 정상적으로 로딩되고 있는지 확인한 후, 로그인 대화 상자에서 시스템 시작 옵션을 선택하십시오. 시각화를 위해 샘플의 위치를 잡으려면, 레이저 안전 캐비닛의 전면 및 상단 패널을 열고 투과광 암(arm)을 기울여 스테이지와 대물렌즈에 접근하십시오.다음으로, alpha plan APO Chromat 100 x 전반사 형광 또는 turf 대물렌즈에 오일을 도포합니다. 그런 다음 초기 초점 조절 단계에서는 저배율 대물렌즈를 선택하십시오. 이제 샘플을 스테이지 위에 장착하고 대물렌즈를 샘플 쪽으로 올립니다.제어 태블릿의 X, Y, Z 기능을 사용하여 렌즈 위치를 모니터링합니다. 렌즈가 초점 범위 내에 들어오면 정지합니다. 샘플을 시각화하고 초점을 미세 조정합니다.조명 암을 내리고 액세스 패널을 완전히 닫으십시오. 그런 다음 locate 탭에서 ocular expansion 기호를 클릭하여 광 경로의 도식도를 띄우고, trans on을 선택하여 전구에서 나온 투과광이 시료에 닿는 것을 도식도에서 확인하십시오. 접안렌즈를 통해 관찰하며 컨트롤 태블릿을 가이드로 삼아 세포의 초점을 맞추십시오.그 다음 DRA 2를 발현하는 세포를 식별하기 위해, 반사광과 den 2의 녹색 형광 방출을 관찰하는 데 적합한 필터를 선택합니다. 건강하고 밝은 세포가 발견될 때까지 저강도 반사광을 사용하여 커버슬립을 스캔한 후, PALM 데이터를 획득할 수 있도록 소프트웨어를 설정합니다. 획득(acquisition) 탭으로 전환하고, 실험 관리자(experiment manager)를 사용하여 적절한 실험적 PALM 획득 구성을 로드합니다.레이저 켜기 여부를 묻는 팝업 메뉴가 나타나면 '예(yes)'를 클릭한 다음, 카메라 평면에 세포 이미지가 초점이 맞도록 조정하십시오. 488 트랙만 선택합니다. E-M-C-C-D 게인과 같은 획득 파라미터를 조정한 후, 연속 획득을 선택하십시오.다음으로, 디스플레이를 원하는 밝기로 조절하고 화면의 이미지가 초점에 맞을 때까지 대물렌즈를 이동합니다. 그런 다음 일반적인 광시야 이미지를 수집하려면 스냅 버튼을 클릭하고 이미지를 저장하십시오. 488 트랙에서 터프 기반 조명을 설정하려면 epi turf 버튼에서 turf를 선택하십시오.터프 기반 조명을 최적화하려면, 연속 획득(continuous acquisition)을 선택하고 배경이 갑자기 어두워지며 시편을 단일 평면에서 포커싱할 수 있을 때까지 터프 각도 조명을 조정하십시오. 405 nanometer 레이저를 끈 상태에서 561 트랙으로 전환하십시오. E-M-C-C-D 게인을 약 200으로, 노출 시간을 약 50 milliseconds로 설정하십시오.적색광을 투과시키는 방출 필터를 선택하고 레이저 강도를 약 40%로 설정하십시오. 561 트랙의 turf 각도를 다시 한번 확인하십시오. 배경 신호를 줄이기 위해 배경이 사라질 때까지 시료에 빛을 조사하십시오. 561 레이저만 활성화한 상태로 561 트랙을 사용하십시오.손바닥 데이터를 수집하려면 561 트랙에 대해 405 nanometer 레이저를 켜고 405 레이저의 강도를 약 0.01%로 조정하십시오. 획득 과정 중 계산된 손바닥 이미지를 모니터링하려면 온라인 처리 옵션 메뉴를 확장하고 온라인 처리 손바닥을 체크하여 기본 매개변수로 처리하십시오. 실험 시작을 클릭하여 획득을 시작하고, 데이터 수집 중에 405 nanometer 광전환 레이저의 강도를 높이면서 광전환 상태를 시각적으로 모니터링하십시오. 두 번째 광전환이 감소하기 시작할 때까지 수행합니다.레이저 강도를 높여도 광전환이 더 이상 증가하지 않으면, '현재 단계 완료(finish current step)'를 클릭하십시오. 실험을 종료하려면 파일을 저장하십시오. 저장된 이미지를 처리하려면 '처리(processing)' 탭을 클릭하고, '방법(method)' 메뉴를 확장한 다음 'palm' 하위 메뉴를 확장하십시오.네 가지 하위 옵션 중에서 다시 palm을 선택하십시오. 뷰어 창에 표시될 적절한 이미지를 선택하십시오. 방법 매개변수(method parameters)를 확장하고 select를 클릭하여 이미지를 입력한 다음, 설정(settings) 필드를 확장하고 default를 선택하여 기본 옵션으로 피크 탐색 및 위치 확인을 실행하십시오.프로세싱 탭에서 apply를 눌러 팜 이미지를 계산하십시오. 데이터에서 샘플링이 제대로 되지 않은 구성 요소를 필터링하기 위해 팜 이미지가 뷰잉 창의 별도 탭에 나타납니다. 나이퀴스트 샘플링 정리와 remove palm outliers 도구를 사용하여, 피크 간의 평균 간격인 소문자 D가 너무 커서 직경 대문자 D의 소낭을 분해할 수 없는 영역의 피크를 삭제하십시오. 뷰잉 창에 팜 이미지가 표시된 상태에서 select를 클릭하여 이미지를 입력하고 apply를 클릭하십시오. 잘못 국소화된 형광체들을 필터링하기 위해 새 이미지가 뷰잉 창의 별도 탭에 나타납니다.PAL 필터 탭으로 이동하여 허용되는 플로라(flora)를 제한하십시오. 네 가지 국소화 정밀도를 35 nm 미만의 시그마(sigma)로 설정합니다. PAL 이미지의 디스플레이 모드를 선택하려면 PAL 렌더링 탭으로 이동하여 픽셀 해상도와 원하는 디스플레이 모드를 선택하십시오.이 이미지에서는 뉴런의 조밀심 소포(dense core vesicle, DCV)의 이미징 및 프로세싱을 통해 얻은 대표적인 PALM 최종 결과물이 빨간색으로 표시되어 있습니다. 국소화된 fluorophore의 가로 좌표는 흰색으로 Centro 디스플레이 모드를 사용하여 표시되었으며, 관련 소포의 초고해상도 이미지는 Gaussian 디스플레이 모드를 사용하여 표시되었습니다. 두 번째 그림에서는 tpa-danger2를 발현하는 배양 8일차(days in vitro) 해마 뉴런의 세포체와 근위 돌기 영역을 촬영한 유사한 광시야(widefield) 이미지(녹색)와 PALM 이미지(빨간색)가 표시되어 있습니다.이미지의 주요 특징으로는 puncta와 일반 이미지 및 palm 이미지 사이의 광범위한 일대일 대응 및 노란색으로 표시된 중첩이 있습니다. 또한 palm puncta의 크기가 현저히 작으며, 가끔 하나의 widefield puncta가 여러 개의 palm puncta로 분해되어 나타납니다. 여기의 이미지는 tpa를 발현하는 두 번째 해마 뉴런의 돌기 일부를 따라 촬영한 D cvs의 palm 이미지입니다.DENDRA two가 제시되어 있습니다. puncta의 직경이 작고 외관이 균질하며, 추정되는 DCV 클러스터를 나타내는 인접한 puncta의 관찰 빈도가 낮다는 점에 유의하십시오. 이 마지막 그림에서는 두 개 이상의 cv가 클러스터를 구성할 만큼 충분히 가까운지 판단하기 위한 간단한 정량적 방법이 설명되어 있습니다.그래프에 표시된 것처럼 펀크타(puncta) 강도의 라인 프로파일을 생성하며, 이를 통해 DCV 간격과 DCV 너비를 정량화할 수 있습니다. 간격이 너비를 크게 초과하는 경우, DCV는 서로 접촉하지 않는 것으로 간주합니다. 반면 간격이 너비와 거의 비슷하다면, 이러한 기준에 따라 DCV가 접촉하고 있을 가능성이 있습니다. 이 절차에 따라, 이 이미지의 DCV는 접촉하지 않은 것으로 분류되었고, 이 이미지의 DCV는 접촉한 것으로 분류되었습니다.서로 다른 구조의 상대적 위치를 연구하기 위해 이색 PALM(two color palm)과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법 (dSTORM)은 빛 현미경 검사법의 전형적인 회절 한계를 우회하고 나노 미터 척도에서 엑소좀을 보는 데 사용됩니다. 엑소좀을 특성화하기 위해 2차원과 3차원에서 모두 사용할 수 있다.

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

배우세요 신경 밀도 코어 소체의 PALM 초해상도 이미징 방법을 통해 소포 조직을 정량 분석하는 기술입니다. 히포캠푸스 뉴런에서 소포 클러스터링과 시냅스 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

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