신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

다음 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경으로는 도달할 수 없는 해상도로 소낭 조직의 중요한 측면을 규명하는 초고해상도 형광 이미지를 얻는 것입니다. 이는 먼저 소낭 화물의 광전환 키메라를 인코딩하는 DNA로 해마 뉴런을 형질전환함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 초고해상도 현미경 시스템을 사용하여 희소하게 샘플링된 원본 이미지를 수집합니다.

다음으로, 초해상도 이미지를 생성하기 위해 원본 이미지를 처리합니다. 마지막 단계에서는 소포의 조직 구조를 규명하기 위해 데이터를 정량화합니다. 최종적으로, 펀크타(puncta) 강도의 라인 프로파일을 사용하여 소포 간 거리와 소포 너비를 비교함으로써, 이 절차를 통해 소포들이 클러스터를 생성할 만큼 충분히 가까이 있는지 판단할 수 있습니다.

단색 광활성화 국소화 현미경(photo activated localization microscopy) 또는 PALM은 대부분의 배양 세포 유형에서 세포 소기관의 조직을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이미지 획득을 위해 초고해상도 이미징 시스템을 가동하려면 먼저 아크 램프의 전원을 켭니다. 다음으로, 전원 리모컨에 있는 시스템 PC 및 구성 요소 스위치를 켭니다.

현미경 제어 태블릿의 전원이 켜지면 스위치를 on으로 전환하고, 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 실행하십시오. 부팅 상태 창을 확장하여 시스템이 정상적으로 로딩되고 있는지 확인한 후, 로그인 대화 상자에서 시스템 시작 옵션을 선택하십시오. 시각화를 위해 샘플의 위치를 잡으려면, 레이저 안전 캐비닛의 전면 및 상단 패널을 열고 투과광 암(arm)을 기울여 스테이지와 대물렌즈에 접근하십시오.

다음으로, alpha plan APO Chromat 100 x 전반사 형광 또는 turf 대물렌즈에 오일을 도포합니다. 그런 다음 초기 초점 조절 단계에서는 저배율 대물렌즈를 선택하십시오. 이제 샘플을 스테이지 위에 장착하고 대물렌즈를 샘플 쪽으로 올립니다.

제어 태블릿의 X, Y, Z 기능을 사용하여 렌즈 위치를 모니터링합니다. 렌즈가 초점 범위 내에 들어오면 정지합니다. 샘플을 시각화하고 초점을 미세 조정합니다.

조명 암을 내리고 액세스 패널을 완전히 닫으십시오. 그런 다음 locate 탭에서 ocular expansion 기호를 클릭하여 광 경로의 도식도를 띄우고, trans on을 선택하여 전구에서 나온 투과광이 시료에 닿는 것을 도식도에서 확인하십시오. 접안렌즈를 통해 관찰하며 컨트롤 태블릿을 가이드로 삼아 세포의 초점을 맞추십시오.

그 다음 DRA 2를 발현하는 세포를 식별하기 위해, 반사광과 den 2의 녹색 형광 방출을 관찰하는 데 적합한 필터를 선택합니다. 건강하고 밝은 세포가 발견될 때까지 저강도 반사광을 사용하여 커버슬립을 스캔한 후, PALM 데이터를 획득할 수 있도록 소프트웨어를 설정합니다. 획득(acquisition) 탭으로 전환하고, 실험 관리자(experiment manager)를 사용하여 적절한 실험적 PALM 획득 구성을 로드합니다.

레이저 켜기 여부를 묻는 팝업 메뉴가 나타나면 '예(yes)'를 클릭한 다음, 카메라 평면에 세포 이미지가 초점이 맞도록 조정하십시오. 488 트랙만 선택합니다. E-M-C-C-D 게인과 같은 획득 파라미터를 조정한 후, 연속 획득을 선택하십시오.

다음으로, 디스플레이를 원하는 밝기로 조절하고 화면의 이미지가 초점에 맞을 때까지 대물렌즈를 이동합니다. 그런 다음 일반적인 광시야 이미지를 수집하려면 스냅 버튼을 클릭하고 이미지를 저장하십시오. 488 트랙에서 터프 기반 조명을 설정하려면 epi turf 버튼에서 turf를 선택하십시오.

터프 기반 조명을 최적화하려면, 연속 획득(continuous acquisition)을 선택하고 배경이 갑자기 어두워지며 시편을 단일 평면에서 포커싱할 수 있을 때까지 터프 각도 조명을 조정하십시오. 405 nanometer 레이저를 끈 상태에서 561 트랙으로 전환하십시오. E-M-C-C-D 게인을 약 200으로, 노출 시간을 약 50 milliseconds로 설정하십시오.

적색광을 투과시키는 방출 필터를 선택하고 레이저 강도를 약 40%로 설정하십시오. 561 트랙의 turf 각도를 다시 한번 확인하십시오. 배경 신호를 줄이기 위해 배경이 사라질 때까지 시료에 빛을 조사하십시오. 561 레이저만 활성화한 상태로 561 트랙을 사용하십시오.

손바닥 데이터를 수집하려면 561 트랙에 대해 405 nanometer 레이저를 켜고 405 레이저의 강도를 약 0.01%로 조정하십시오. 획득 과정 중 계산된 손바닥 이미지를 모니터링하려면 온라인 처리 옵션 메뉴를 확장하고 온라인 처리 손바닥을 체크하여 기본 매개변수로 처리하십시오. 실험 시작을 클릭하여 획득을 시작하고, 데이터 수집 중에 405 nanometer 광전환 레이저의 강도를 높이면서 광전환 상태를 시각적으로 모니터링하십시오. 두 번째 광전환이 감소하기 시작할 때까지 수행합니다.

레이저 강도를 높여도 광전환이 더 이상 증가하지 않으면, '현재 단계 완료(finish current step)'를 클릭하십시오. 실험을 종료하려면 파일을 저장하십시오. 저장된 이미지를 처리하려면 '처리(processing)' 탭을 클릭하고, '방법(method)' 메뉴를 확장한 다음 'palm' 하위 메뉴를 확장하십시오.

네 가지 하위 옵션 중에서 다시 palm을 선택하십시오. 뷰어 창에 표시될 적절한 이미지를 선택하십시오. 방법 매개변수(method parameters)를 확장하고 select를 클릭하여 이미지를 입력한 다음, 설정(settings) 필드를 확장하고 default를 선택하여 기본 옵션으로 피크 탐색 및 위치 확인을 실행하십시오.

프로세싱 탭에서 apply를 눌러 팜 이미지를 계산하십시오. 데이터에서 샘플링이 제대로 되지 않은 구성 요소를 필터링하기 위해 팜 이미지가 뷰잉 창의 별도 탭에 나타납니다. 나이퀴스트 샘플링 정리와 remove palm outliers 도구를 사용하여, 피크 간의 평균 간격인 소문자 D가 너무 커서 직경 대문자 D의 소낭을 분해할 수 없는 영역의 피크를 삭제하십시오. 뷰잉 창에 팜 이미지가 표시된 상태에서 select를 클릭하여 이미지를 입력하고 apply를 클릭하십시오. 잘못 국소화된 형광체들을 필터링하기 위해 새 이미지가 뷰잉 창의 별도 탭에 나타납니다.

PAL 필터 탭으로 이동하여 허용되는 플로라(flora)를 제한하십시오. 네 가지 국소화 정밀도를 35 nm 미만의 시그마(sigma)로 설정합니다. PAL 이미지의 디스플레이 모드를 선택하려면 PAL 렌더링 탭으로 이동하여 픽셀 해상도와 원하는 디스플레이 모드를 선택하십시오.

이 이미지에서는 뉴런의 조밀심 소포(dense core vesicle, DCV)의 이미징 및 프로세싱을 통해 얻은 대표적인 PALM 최종 결과물이 빨간색으로 표시되어 있습니다. 국소화된 fluorophore의 가로 좌표는 흰색으로 Centro 디스플레이 모드를 사용하여 표시되었으며, 관련 소포의 초고해상도 이미지는 Gaussian 디스플레이 모드를 사용하여 표시되었습니다. 두 번째 그림에서는 tpa-danger2를 발현하는 배양 8일차(days in vitro) 해마 뉴런의 세포체와 근위 돌기 영역을 촬영한 유사한 광시야(widefield) 이미지(녹색)와 PALM 이미지(빨간색)가 표시되어 있습니다.

이미지의 주요 특징으로는 puncta와 일반 이미지 및 palm 이미지 사이의 광범위한 일대일 대응 및 노란색으로 표시된 중첩이 있습니다. 또한 palm puncta의 크기가 현저히 작으며, 가끔 하나의 widefield puncta가 여러 개의 palm puncta로 분해되어 나타납니다. 여기의 이미지는 tpa를 발현하는 두 번째 해마 뉴런의 돌기 일부를 따라 촬영한 D cvs의 palm 이미지입니다.

DENDRA two가 제시되어 있습니다. puncta의 직경이 작고 외관이 균질하며, 추정되는 DCV 클러스터를 나타내는 인접한 puncta의 관찰 빈도가 낮다는 점에 유의하십시오. 이 마지막 그림에서는 두 개 이상의 cv가 클러스터를 구성할 만큼 충분히 가까운지 판단하기 위한 간단한 정량적 방법이 설명되어 있습니다.

그래프에 표시된 것처럼 펀크타(puncta) 강도의 라인 프로파일을 생성하며, 이를 통해 DCV 간격과 DCV 너비를 정량화할 수 있습니다. 간격이 너비를 크게 초과하는 경우, DCV는 서로 접촉하지 않는 것으로 간주합니다. 반면 간격이 너비와 거의 비슷하다면, 이러한 기준에 따라 DCV가 접촉하고 있을 가능성이 있습니다. 이 절차에 따라, 이 이미지의 DCV는 접촉하지 않은 것으로 분류되었고, 이 이미지의 DCV는 접촉한 것으로 분류되었습니다.

서로 다른 구조의 상대적 위치를 연구하기 위해 이색 PALM(two color palm)과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.