Name: 임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 학습하세요 임신 중 쥐 간 조직의 지방산 작곡 변화를 가스 크로마토그래피로 분석하는 방법을. 고체상 추출과 메틸 에스터화를 통해 지질 클래스를 분리 정량하고, 영양 개입과 생리적 변화가 지방산 조성에 미치는 영향을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

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저자는 쥐를 대상으로 한 연구에 Meritxell 로미오 - 나달의 기여를 인정하고 싶습니다.

1. 동물 절차 <ol><li> 모든 동물의 작업은 홈 오피스 동물 (과학적인 절차) 법 (1986)에 따라 수행되어야한다. </li><li> 일부일처 번식에 의해 오래 십주 세의 Wistar 쥐 메이트, 및 질 플러그의 모양에 의해 임신을 확인합니다. 임신 중 하루 1로 이것을 기록하고 실험적인 다이어트를 시작. 처녀 여성의 경우, 개별적으로 쥐를 수용하고, 실험적인 다이어트를 시작. </li><li> 20 일을위한 실험 사료를 공급 한 후 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식하여 쥐를 안락사. </li><li> 복강을 노출하고 격막에 간을 연결하는 인대, 복부의 앞쪽 벽, 위, 십이지장을 절단하여 간을 절제하는 해부 집게와 가위를 사용합니다. C. -80 ° 저장하기 전에 PBS의 간을 세척하고 액체 질소에 동결 </li></ol> 2. 총 지질의 제조 추출 9 <ol><li> molecul 추가AR 체는 &#39;건조&#39;용제를 만들기 위해 모든 용제 (솔벤트 용기의 1 / 10을 채우기 위해). 흄 후드 내에서 모든 솔벤트 작업을 수행하십시오. </li><li> 약 100 mg의 냉동 간을 잘라 무게. 얼음 양동이에 튜브에 조직을두고 0.8 ㎖를 얼음 냉각 된 0.9 %의 NaCl을 추가합니다. 조직을 균질화한다. </li><li> 건조 클로로포름 1 ㎖ / MG에 용해 된 내부 기준을 추가 : 메탄올 (2:1 V / V) 부틸 히드 록시 톨루엔 (BHT, 50 ㎎ / ℓ)를 포함하는 산화 방지제로. 쥐의 간 100 밀리그램 CE 표준의 100 μg을 추가를 위해 (콜레 스테 릴은 17:0을 heptadecanoate)주의 :. 클로로포름 및 BHT는 위험하다. </li><li> 5.0 ㎖ 건조 클로로포름을 추가 : 메탄올 (2:1 V / V) BHT (50 ㎎ / L)를 포함. </li><li> 1.0 ㎖의 1 M NaCl을 추가 혼합물 유니폼을 보이는 때까지 소용돌이로 교반하여 잘 혼합. 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 10 분, 실온에서 낮은 브레이크 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 낮은 수집유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 단계는 40 ℃에서 질소하에 새로운 스크류 캡 유리 튜브와 건조로 전송 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 고상 추출에 의한 지질 클래스의 분리 (SPE) 10 <ol><li> 진공 펌프에 SPE 탱크를 연결하고 탱크에 아미노 실리카 SPE 카트리지를 배치합니다. </li><li> 제 1 분획을 수집하기 위해 열에서 탱크 랙에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 태그와 CE를 놓습니다. </li><li> 1.0 ㎖의 건조 클로로포름과 소용돌이에 총 지질 추출물을 용해. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열을 샘플을 적용하고 중력에서 스크류 캡 튜브를 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다. 더 이상 물감이 빠지지 않을 때, 진공 청소기를 이용하여 남아있는 액체를 제거합니다. </li><li> 건조 클로로포름 2 × 1.0 ㎖의 세척과 열을 세척, 진공 하에서 TAG 및 CE 부분을 용출. </li><li> 모든 액체가 제거 될 때, TAG 및 CE fractio 말려40 ℃에서 질소하에 N 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 열 아래에있는 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 PC를 놓습니다. </li><li> 2 × 1.0 ㎖의 건조 클로로포름 첨가 진공 하에서 PC 분획을 용출 : 메탄올 (60:40, V / V) 모든 액체가 컬럼으로부터 제거 될 때까지. </li><li> 40 ℃에서 질소하에 제거하고 건조 PC 분율 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 PE를 삽입하고 진공 상태에서 1.0 ML 건조 메탄올의 추가와 함께 PE 분획을 용출. </li><li> 40 ℃에서 질소하에 제거하고 건조 PE 분획 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 NEFA를 놓고 건조 클로로포름 2 × 1.0 ㎖의 세척을 첨가하여 진공 상태에서 NEFA의 부분을 용출 : 메탄올 : 빙초산. (100:2:2, V / V / V)주의 : 빙초산은 위험합니다. </li><li> 40 ℃에서 질소하에 수집 된 NEFA의 부분 건조를 제거 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> SPE 탱크에 새로운 아미노 실리카 SPE 카트리지를 삽입하고 폐기물을 수집하는 카트리지에 따라 탱크 트레이에 스크류 캡 유리 튜브를 놓습니다. </li><li> 3 진공 건조 헥산으로 세척 및 중력에 따라 다음 최종 1.0 ㎖ 세척과 열을 씻으십시오. . 카트리지 (헥산 레벨이 카트리지 매트릭스에 근접 할 때 폐쇄 위치로 카트리지 컬럼 채널을 돌려)주의 건조 될 수 있도록하지 마십시오 헥산는 위험합니다. </li><li> 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 CE와 폐기물 튜브를 교체합니다. </li><li> 건조 헥산과 소용돌이의 1.0 ㎖에 (단계 3.6에서 준비) 건조 TAG 및 CE 부분을 녹입니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열이를 적용하고 G 아래까지 떨어 뜨리지ravity. </li><li> 더 이상 물감이 빠지지 않을 때, 진공 상태에서 남아있는 액체를 제거합니다. </li><li> 진공에서 40 ℃에서 질소하에 CE 및 건조 수집 부분을 용출 건조 헥산 2 × 1.0 ㎖의 세척과 열을 씻어 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 건조 헥산 2 × 1.0 ㎖의 세척을 추가하여 탱크 트레이 및 용출 TAG 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 태그를 : 메탄올 : 에틸 아세테이트 (100:5:5) 진공. </li><li> 40 ℃에서 질소하에 건조 수집 분수 . 샘플은 일주일에 최대주의를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 : 에틸 아세테이트는 위험합니다. </li></ol> 4. 명예의 준비 CE 10 <ol><li> . 분리 CE 분율 (단계 3.19에서 수집)와 소용돌이주의에 건조 톨루엔 0.5 ㎖를 추가 톨루엔은 위험합니다. </li><li> 2 % (v의 메틸화 시약을 준비한다 (건조 메탄올/ v) 1.0 ㎖를 샘플 당 요구되는 건 H 2 SO 4). 유리 또는 뚜껑에 적합한 플라스틱 용기에 건조 메탄올의 양을 분배하고 SO 4 적하 후주의 반전하여 혼합 H 2의 필요한 양을 추가합니다. 황산 위험한입니다. </li><li> 건조 톨루엔에 용해 된 샘플을 메틸화 시약 1.0 mL를 넣고 단단히 튜브 캡을 조심스럽게 섞는다. </li><li> 50 ℃에서 2 시간 동안 샘플을 가열 </li><li> 2 시간 후 열에서 튜브를 제거합니다. . 칼륨 탄산 수소 칼륨, 탄산 유해 일단 차가운 용액 (0.25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3)주의를 중화 1.0 ML를 추가합니다. </li><li> 1.0 ㎖의 건조 헥산과 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 2 분 실온에서 낮은 브레이크 250 XG에 원심 분리기. </li><li> FAME가 들어 위의 위상을 수집하고, 새가 아닌 스크류 캡 일회용 유리 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 에서 수집 된 명성을 건조40 ° C에서 질소 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. CE의 FAME (14)로부터 무료 콜레스테롤 오염 제거 (무료 콜레스테롤은 샘플을 오염시킬 수있는 무료 콜레스테롤 제거하지 않고 예를 들어 크로마토 그래프 추적 그림 1 참조). <ol><li> SPE 탱크에 폐기물 튜브를 놓고 탱크에 실리카겔 SPE 카트리지를 배치합니다. </li><li> 진공 건조 헥산 3 × 1 ㎖ 세척 및 중력에서 1 x 1 ㎖로 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 폐 세척을 제거하고 탱크에 새로운 폐기물 관을 추가합니다. </li><li> 1 ㎖의 건조 헥산, 소용돌이에 CE의 명성을 녹인다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열을 적용하고 중력 하에서 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다. </li><li> 진공 헥산 3 × 1 ㎖ 세척과 열을 씻으십시오. </li><li> 폐 세척을 제거하고 탱크 표시 CE의 명성에 새로운 아닌 스크류 캡 튜브를 놓습니다. </li><li> 용출2 x 1 ㎖의 건조 헥산 CE의 FAME : 디 에틸 에테르 (95:5 V / V) 세척. </li><li> 40 ℃에서 질소하에 건조 . 샘플은 일주일에 최대주의를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 : 디 에틸 에테르는 위험합니다. </li></ol> 6. GC 자동 샘플러 유리 병에 명예의 전송 <ol><li> , 소용돌이 샘플 및 GC 자동 견본 작은 유리 병에 전송하는 75 ㎕의 건조 헥산을 추가합니다. </li><li> , 샘플 소용돌이와 같은 GC 자동 견본 작은 유리 병에 전송하기 위해 추가로 75 ㎕의 건조 헥산을 추가합니다. 샘플은 한 달에 최대를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 7. 가스 크로마토 그래프 (14)를 사용하여 분석 <ol><li> 가스 크로마토 그래프에 명성을 분석합니다. 예 설정 : 30 MX X 0.25 mm 0.25 μm의 BPX-70 온도 프로토콜과 용융 실리카 모세관 컬럼 : 초기 온도 115 ° C, 개최 2 분, 경사 10 ° C / 분 200 ° C에, 245 ° C에 18.5 분, 경사 60 ° C / 분을 보유, H4 세 분. 칼럼 : 헬륨 가스, 유속 1.0, 압력 및 속도 14.6 29. 인젝터 : 온도 = 300 ° C. 검출기 : 수소 흐름 40.0, 공기 온도 = 300 ℃, 45.0 흐름, 가스 헬륨을 구성, 184.0 흐름 </li><li> (CE의 FAME 분석 예를 들어 25:1) 적절하게 설정 분할 비율. </li><li> 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 피크 아래의 영역을 결정하고 기준과 비교하여 명성을 확인합니다. 예제 크로마토 그램 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 전체 지방산의 백분율로서 개별 지방산의 기여도를 계산하는 피크 데이터에서 영역을 사용한다. </li><li> 양만큼 내부 표준의 영역을 분할하여 지방산의 절대 농도를 산출 덧붙였다. 사용 된 조직의 양 내의 각 지방산의 절대 농도를 구하는이 결과에 의해 각 지방산의 영역을 나눈다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

기체 크로마토 그래피는 지방산 분석을 위해 사용하는 정확한 방법이며, 그 재현성이 높은 임상 분석에 적합한이 기술을 판단. 적절한 GC 컬럼은 가능한 열 정지상, 컬럼 길이 및 내경의 극성의 변화를 갖는, 또한 지방산의 식별을 가능하게하기 위해 사용되어야한다. 분석 방법에있어서 용융 실리카 모세관 컬럼의 사용은 우수한 열 안정성과 높은 표면 불활성 양호한 해상도 8에 의한 유지 시간의 재현성을 제공한다. 이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 하위 및 상위 단계의 수집 단계 (프로토콜 2.7 및 4.8 단계) 있습니다. 그것은 올바른 위상이 많이가 원하지 않는 단계의 오염없이 가능한 수집하는 것이 중요합니다. 샘플의 오염 물질의 존재는 바람직하지 크로마토 그래피 결과가 유도된다도 2에 도시 된 바와 같이. SPE 동안 CE를 수집하는 경우에는 카트리지 열이 샘플 TAG에서 CE의 성...

기체 크로마토 그래피 (GC)의 보급이나 생리적 비만과 같은 조건 (및 당뇨병과 같은 관련 질환) 또는 임신 3 중에 지질 풀 및 세포막 1,2으로 지방산의 혼입을 식별하고 정량화하기 위해 사용 노포 기법 - 5. 또한 식품의 유형과 지방의 양을 분석에 적합하다. 실험 사료의 특성뿐만 아니라, 식품 업계가 규정을 준수 함을 보장하는 경우에 유용합니다. 예를 들어, GC는 라벨링가 정확하고 규제가 6,7에 부착되도록하는 등 건강 보조 식품 등의 제품 내의 아이덴티티 및 지방산의 양을 확인하기 위하여 사용될 수있다. 지방산의 분석은 질병과 건강식이 변화의 영향 및 생리적 상태 8의 변동 효과 지질 대사에 가치있는 통찰을 제공 할 수있다. 임신 중에 샘플을 연구하는 GC의 사용은 중요한 제공하고 있습니다지방산과 복합 지질 항상성 3의 변화에 대한 정보를 제공합니다. 크로마토 그래피 분리에 앞서, 지질은 일반적 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에서의 지질 용해도를 사용하여 샘​​플로부터 추출된다. 염화나트륨 9,10 단계를 포함하는 수성 및 유기 지방질로 혼합물의 분리를 용이하게하기 위해 첨가된다. 그 복잡한 지질 클래스는 고체상 추출 (SPE)에 의해 총 지질 추출물로부터 분리 될 수있다. 이 분리 기술은 극성 또는 결합 친화도에 따라 지질 클래스를 용출. Triacyglycerols (TAG) 및 콜레 스테 릴 에스테르 (CE)가 결합 분획, 상기 클래스, 포스파티딜콜린 (PC)와 같은 제 용출, 포스파티딜 에탄올 아민 (PE), 비 에스테르 화 지방산 (NEFA)은 용출 용매의 극성을 증가시킴으로써 용출 . CE에서 TAG의 분리는 신선한 SPE의 cartri에 태그의 결합을 이용DGE, CE가 용출 될 수 있도록. TAG는 용출 용매 9,10의 극성을 증가시킴으로써 용출 될 수있다. 이 방법은보다 높은 수율로 동시에 분리 될 여러 샘플들이 비교적 작은 크기의 샘플 (예를 들어 &lt;100 μl의 혈장 또는 혈청, &lt;100 밀리그램 티슈) (11, 12)를 분석 할 수 있음을 의미하는, 박막 크로마토 그래피로 달성한다. GC는 제 1950에 기재된 잘 확립 된 기술이며, 이는 다음 액체 - 액체 시스템에서의 이동상이 증기로 대체 될 수 있다고 제안 하였다. 그것은 초기 석유 분석에 사용하지만 급속 같은 아미노산 분석 및 주요 관심 여전히 지질 생화학 같은 다른 영역으로 확장되었다. 이러한 이전에 사용 된 포장 열에서 모세관 컬럼의 개발과 같은 GC 장비 및 기술의 발전은 지방산이 될 수있는 우리의 현재 기술을 주도하고있다GC 일상적 조사 (13)의 넓은 범위에서 지방산을 식별하고 정량화하기 위해 사용되는 결과로 낮은 온도에서 더 효율적으로 분리된다. GC들은 열분해없이 알맞은 온도에서 용출 될 정도로 충분히 휘발성이 될 수 있도록 유도되는 지방산을 필요로한다. 이것은 보통 분석 에스테르, 티오 에스테르 또는 아미드를 형성하는 수소 함유 작용기의 치환을 포함한다. 메틸 에스테르는 일반적으로 메틸화에 의해 생성되는 파생 상품을 연구한다. 이 방법에서는 복합 지질의 에스테르 결합은 지방산 메틸 에스테르 (FAME)을 형성 transmethylated되는 유리 지방산을 방출하는 가수 분해된다. GC에 의해 결정 FAME의 결과 프로파일은, 지방산 조성이라고 쉽게 다른 실험군 9,10 사이에 비교 될 수있다. 기술은 허용 individ의 비율 모두연간 지방산과 그 농도를 측정한다. 영양 연구 및 식품 산업 내의 지방산 분석을위한 GC의 용도 이외에, 분석적 기술은 폭 넓은 분야에서 사용할 수있다. 예를 들어, GC를 이용하여, 환경 분석은 살충제 및 토양에서 수질 오염을 측정 포함하는 클로로 벤젠 함량을 측정 분석한다. 독물학에서 GC 또한 소변 및 개인의 혈액 샘플에서 불법 물질을 식별하기 위해 사용 된, 예컨대 스포츠 퍼포먼스 강화제 (12)와 탄화수소의 복잡한 혼합물을 분리하는 능력은 화학 분석 (12)에 대한 석유 산업에서이 기술은 대중 만든다. 임신 구체적 오메가 -3 법적 산모 조직의 지방산 조성에 상당한 변화, (N-3) 및 오메가 -6 (N-6) 고도 불포화 지방산 ACI와 연결된DS (PUFA) 3. 현재 연구에서, 우리는 다른 오일 소스와 낮은 고지방식이를 공급 처녀 임신 랫트로부터 취한 간 조직의 지방산 조성의 분석에서의 사용을 설명하는 순서 지방산의 측정에서 GC를 사용하는 방법을 예시. 여기에 제공된 실험 다이어트는 저지방 콩기름 식단, 고지방 대두유 기반의 다이어트 (130.9 g 총 지방 / kg 총 지방) 또는 높은 지방 아마씨 기름 기반의 다이어트 (130.9 g 총 지방 / kg이었다 20 일에 대한 가격을 제공하는 다이어트). 이러한 다이어트의 전체 영양 및 지방산 조성은 이전에 14 설명 하였다. 콩기름 다이어트는 리놀레산 (18시 2분 N-6)이 풍부하고, 아마씨 기름 다이어트 α-리놀렌산이 풍부 동안 일부 α-리놀렌산 (18시 3분 N-3)가 포함되어 있습니다. 이러한 높은 지방 다이어트는 리놀레산 α-리놀렌산하는 산 (각각 8:1 1:1의 배급)의 다른 식량을 나타냅니다. 개인 지질 클래스와 GC에 의한 분석의 분리를위한 방법은 우리입니다LL 설립 및 검증, 이전에 10 만, 여기에있는 자세한 기술 설명없이 게시되었습니다.

<table><tbody><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td>'주의' 흄스 - HPLC 등급</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4966/17</td><td>'주의' 흄 - HPLC 등급</td></tr><tr><td>BHT</td><td>시그마- 알드리치</td><td>W218405</td><td>'주의' 먼지 흄 - 무수</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마- 알드리치</td><td>S9888</td><td>무수</td></tr><tr><td>헥산</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/0406/17</td><td>'주의' 연기 - HPLC 등급</td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>시그마- 알드리치</td><td>695084</td>'<td>주의' 화상 - 99.85%</td></tr><tr><td>황산</td><td>시그마- 알드리치</td><td>339741</td><td>'주의' 화상 - 99.999%</td></tr><tr><td>탄산칼</td>륨 <td>시그마- 알드리치</td><td>209619</td><td>99% ACS 시약 등급</td></tr><tr><td>중탄산칼륨</td><td>시그마- Aldrich</td><td>237205</td><td>99.7% ACS Reasgent grade</td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10204340</td><td>'주의' 흉내 - 99+% GLC SpeciFied</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher Scientific</td><td>T/2300/15</td><td>'주의' 흄크</td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>309966</td><td>'주의' 흄</td></tr><tr><td>질소(무산소) 실린더</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>'주의' 압축 가스 - 폭발 위험</td></tr><tr><td>아미노프로필 실리카 SPE 카트리지</td><td>애질런트</td><td>12102014</td><td>카트리지 - 비드 질량 100mg</td></tr><tr><td>실리카겔 SPE 카트리지</td> 애<td>질런트</td><td>14102010</td><td>카트리지 - 비드 질량 100mg</td></tr><tr><td>분자 seives</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>펠릿, AW-300, 1.6mm</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

기체 크로마토 그래피 (GC)은 높은 정확도 및 재현성 결과를 수득 조직, 세포 및 혈장 / 혈청에서 지질의 지방산 콘텐츠를 식별하고 정량화하기 위해 사용되는 매우 중요한 방법이다. 대사 및 영양 연구에서 GC는 허용 개입을 다음과 지방산 농도 또는 임신 등의 생리적 상태의 변화시 변화의 평가. 아미노 실리카 카트리지를 사용하여 고체상 추출 (SPE)가 허용 트리 아실 글리세롤, 다른 인지질 및 콜레 스테 릴 에스테르 (CE)를 포함한 주요 지질 클래스의 분리. SPE와 함께 GC 다양한 높고 낮은 지방 다이어트를 공급했다 처녀 임신 한 쥐의 간에서 CE 분획의 지방산 조성의 변화를 분석하는 데 사용되었다. 간 CE의 오메가 -3와 오메가 -6 지방산 함량에 따라 상당한 다이어트 / 임신 상호 작용 효과는 임신 한 여성은식이 manipulat에 ​​다른 반응을 나타내는 있습니다보다 이온 처녀 여성 사이에서 볼 수있다.

이 방법의 성공은 정확하게 프로토콜을 다음에와 &#39;노이즈&#39;와 크로마토 그램에 표시 할 수있는 오염을 줄이기 위해 청정 용매 및 시약을 사용하는 방법에 따라 달라집니다. 오염 된 샘플은 곡선 아래 면적 계산의 정확도를 저하 분석 할 더 많은 도전이다. 프로토콜이 분명 대칭, 잘 정의 된 피크와 최소한의 배경 소음이 성공적으로 크로마토 그램을 따라하는 경우 (그림 3)을 얻을 수 있어야합니다. 오염이 발생한 경우에는 추가 크로마토 그램 피크를 보여주고,도 4에 도시 된 바와 같이 비대칭 (비뚤어진) 피크를 나타낸다. 콜레스테롤이 제거되지 않는 프로토콜 5에 설명 된대로) (그림 1 참조 (CE에서 파생 된 FAME를 실행하는 경우 무료로 콜레스테롤에서 오염이 발생합니다. 준비된 교정 믹스의 사용은 일의 FAME의 식별 가능전자 샘플. 교정 믹스 크로마토 그램은도 ...

임신 산모 조직의 지방산 조성에 상당한 변화를 이끈다. 지질 쥐 사이의 식별 및 개별 지질 클래스에있는 지방산의 정량 임신 중에 다양한 높고 낮은 지방 다이어트를 공급 할 수 있도록 가스 크로마토 그래피를 통해 얻을 수있다.

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 간의 지방산 조성을 분석하는 것입니다. 우선 간 샘플의 무게를 측정하고 이를 균질화하여 수행합니다. 두 번째 단계는 균질화된 간 샘플에서 모든 지질을 추출하는 것입니다.다음으로, 고체상 추출법을 사용하여 콜레스테롤 에스테르와 같은 개별 지질 클래스를 분리합니다. 마지막 단계는 지질 클래스를 지방산 메틸 에스테르로 정제 및 유도체화하는 것입니다. 최종적으로 가스 크로마토그래피를 사용하여 영양 중재 후 조직의 지방산 조성이 어떻게 변화하는지, 또는 임신과 같은 생리적 상태의 변화에 의해 어떤 영향을 받는지 확인합니다.이 방법은 조직의 지방산 조성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 오일, 종자, 식품과 같은 다른 시료 유형에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술이 처음인 사용자는 상층과 하층을 반복적으로 수집하는 과정과 같이 수작업의 정밀함과 연습이 필요한 프로토콜 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 해당 절차의 시연은 본 연구실의 기술자인 Hena, Fisk 및 박사 과정 학생인 Annette West가 진행하겠습니다.먼저 냉동된 간 조직 약 100 milligrams를 절단하여 무게를 측정합니다. 조직을 얼음 버킷에 담긴 플라스틱 튜브에 넣고, 얼음처럼 차가운 0.9%sodium chloride 0.5 milliliters를 첨가합니다. 그 후 조직을 균질화하여 나사 캡이 달린 유리 튜브로 옮깁니다.0.9% sodium chloride 0.3 mL를 추가로 사용하여 남은 조직을 유리 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 그 후, 2:1 건식 chloroform과 methanol에 용해된 100 µg의 cholesterol hepta dechen 표준물을 튜브에 넣고, 이어서 50 mg/L의 butylated hydroxy toluene이 포함된 동일한 용매 용액 5 mL를 추가합니다. 1 M sodium chloride 1 mL를 첨가한 후, 튜브의 캡을 닫고 시료가 균일해질 때까지 볼텍싱하여 충분히 혼합합니다.그 다음, 상온에서 low break 설정을 사용하여 샘플을 1000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 완료되면, 글라스 파스퇴르 피펫을 사용하여 하층을 수집하고 새 스크류 캡 유리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 40 °C에서 질소 기류 하에 샘플을 건조시킵니다.이제 SPE 탱크를 진공 펌프에 연결하고, 탱크 위에 아미노 프로필 실리카 SPE 카트리지를 장착합니다. 첫 번째 분획을 수집하기 위해 TAG 및 CCE라고 표시된 새로운 스크류 캡 유리 튜브를 컬럼 아래의 탱크 랙에 배치합니다. 총 지질 추출물을 1 mL의 건조한 클로로포름에 녹이고 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다.그 다음, 유리 페이스트 피펫을 사용하여 샘플을 컬럼으로 옮기고 액체가 중력에 의해 스크류 캡 튜브로 떨어지게 합니다. 액체가 더 이상 컬럼에서 떨어지지 않으면, 진공 장치를 사용하여 남은 액체를 제거합니다. 이어서, 진공 상태에서 1 mL의 건조 클로로폼으로 컬럼을 두 번 세척하여 TAG 및 CE 분획을 용출합니다.컬럼에서 모든 액체가 빠져나오면, TAG 및 CE 분획을 40 °C의 질소 기류 하에서 건조합니다. SPE 탱크에 새로운 amino propyl silica SPE 카트리지를 장착하고, 카트리지 아래의 탱크 트레이에 폐액 수집용 스크류 캡 유리 튜브를 배치합니다. 진공 상태에서 1 mL의 건조한 hexane으로 컬럼을 3회 세척합니다.진공을 끈 후, 중력 하에 1 mL의 H hexane으로 컬럼을 마지막으로 세척합니다. 폐액 튜브를 ce라고 표시된 새 스크류 캡 유리 튜브로 교체한 후, 건조된 TAG 및 CE 분획을 1 mL의 건조한 hexane에 녹이고 볼텍싱하여 시료를 혼합합니다. 그런 다음 글라스 패스나 피펫을 사용하여 시료를 컬럼로 옮기고, 액체가 중력에 의해 컬럼을 통해 떨어지도록 둡니다.컬럼에서 더 이상 액체가 떨어지지 않으면, 남은 액체를 진공 상태에서 제거합니다. 건조한 hexane 1 mL로 컬럼을 두 번 세척하여 CE를 용출시키고, 수집된 분획을 40 °C에서 질소 기류 하에 건조합니다. 그 후, 분리된 CE 분획에 건조한 toluene 0.5 mL를 첨가하고 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다.건조 톨루엔에 용해된 시료에 미리 준비한 메틸화 시약 1 mL를 첨가합니다. 그다음 튜브 캡을 단단히 닫고 혼합합니다. 시료를 50 °C에서 2시간 동안 완만하게 가열합니다. 시료가 상온으로 식으면 중화 용액 1 mL를 첨가합니다.다음으로, 샘플에 dry hexane을 추가합니다. Vortexing 후, 실온에서 low break 설정으로 250 ×g에서 2분 동안 샘플을 원심분리합니다. 완료되면 상층의 fame phase를 수집하여 새로운 비나사형 캡 일회용 유리 튜브로 옮깁니다. 수집된 fame 샘플을 40 °C의 질소 기류 하에서 건조시킵니다.SPE 탱크에 폐액 튜브를 넣고 실리카 겔 SPE 카트리지를 탱크 위에 장착한 후, 진공 상태에서 1 mL의 건조한 hexane으로 3회 세척하고, 중력 하에서 1 mL의 건조한 hexane으로 다시 세척합니다. 세척액을 제거한 후, 탱크에 새 폐액 튜브를 넣고 CE flame 샘플을 1 mL의 건조한 hexane에 녹입니다.볼텍싱으로 시료를 혼합한 후, 글라스 패스나 피펫을 사용하여 컬럼으로 옮깁니다. 액체가 중력에 의해 컬럼을 통해 모두 떨어지면, 진공 상태에서 1 mL의 헥산으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 다음으로, 폐세척액을 제거하고 CE fame이라고 표시된 새의 나사 캡 튜브를 탱크에 넣습니다.CE fame 분획을 95:5 비율의 건조한 hexane과 diethyl ether 혼합액 1 mL씩 두 번 사용하여 용출합니다. 그 후 수집된 분획을 40 °C의 질소 기류 하에서 건조시키고, 건조된 분획을 75 µL의 건조한 hexane에 녹인 후 볼텍싱하여 시료를 혼합합니다. 이전 단계를 반복한 후 이를 GC 자동 시료 주입 바이알로 옮깁니다.프로토콜이 성공적으로 수행되었다면 가스 크로마토그래프로 샘플을 분석하십시오. 여기에 예시된 바와 같이, 배경 노이즈가 최소화되고 대칭적이며 뚜렷한 피크를 가진 크로마토그램이 얻어져야 합니다. 오염이 발생한 경우, 여기에 표시된 것처럼 크로마토그램에 추가 피크가 나타나거나 비대칭 또는 왜곡된 피크가 관찰될 것입니다.콜레스테롤을 제거하지 않은 상태에서 CE 유래 FAME을 분석하면 유리 콜레스테롤로 인한 오염이 발생합니다. 미리 준비된 검정 혼합물을 사용하면 시료 내의 FAME을 식별할 수 있습니다. 검정 혼합물은 시료와 동일한 기기 설정으로 분석하므로, 여기에 나타난 것과 같이 크로마토그램을 시료와 비교하여 머무름 시간을 기준으로 피크를 식별할 수 있습니다.상단 크로마토그램의 교정 혼합물과 지방산의 머무름 시간을 비교하여 보여주기 위해 16:0 피크를 여기에 강조 표시하였습니다. 하단 샘플 트레이스에서는 지방산 피크 면적에 정확한 라벨을 지정하여 전체 지방산 중 특정 지방산의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다. 데이터 수집이 완료되면, 여기에 표시된 것처럼 이상치가 있는지 검토하는 것이 유용합니다.이후 이상치 샘플에 대해 추가 조사를 수행하고, 필요한 경우 추출 및 분석을 반복할 수 있습니다. 여기서 보여주는 것처럼, 쥐 간 내 CE의 지방산 조성은 간 CE 내 총 지방산의 백분율로 기술됩니다. 이 데이터는 세 가지 서로 다른 식단 중 하나를 20일 동안 섭취한 미경산 또는 임신한 쥐의 간 내 CE 지방산을 나타냅니다.두 요인 Innova를 이용한 통계 분석 결과, 여러 지방산의 비율에 대해 식단과 임신이 유의미한 영향을 미치며, 식단과 임신 간의 유의미한 상호작용이 있음이 밝혀졌습니다. 일례로, 임신한 쥐 간 CE의 onic acid 함량은 미경산 female에 비해 식단의 영향을 더 많이 받습니다. 이 기술을 정확하게 수행하면 하루에 20개의 샘플을 처음부터 끝까지 처리할 수 있습니다.숙련된 후에는 샘플을 배치 처리함으로써 처리량을 늘리고 일주일 동안 처리하는 양을 두 배로 늘릴 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 고상 추출과 가스 크로마토그래피를 사용하여 개별 지질 클래스의 지방산 조성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 용매를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 흄 후드 내에서 작업하고 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Chemistry

화학

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시스테인 함유의 올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정은 설명합니다. 실험은 트리플 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 펩티드의 상대적인 산성도는 충돌에 의한 분리 실험을 사용하여 측정하고 있으며, 양적 산성도가 확장 요리사에게 운동 방법을 사용하여 결정됩니다.

올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정

학습하세요 임신 중 쥐 간 조직의 지방산 작곡 변화를 가스 크로마토그래피로 분석하는 방법을. 고체상 추출과 메틸 에스터화를 통해 지질 클래스를 분리 정량하고, 영양 개입과 생리적 변화가 지방산 조성에 미치는 영향을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

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