임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

이 절차의 전반적인 목표는 간의 지방산 조성을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 간 샘플의 무게를 측정하고 균질화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 균질화된 간 샘플에서 모든 지질을 추출하는 것입니다.

다음으로, 콜레스테롤 에스테르와 같은 개별 지질 부류는 고체상 추출을 사용하여 분리됩니다. 마지막 단계는 지질 부류를 지방산 메틸 에스테르로 ification 및 유도체화하는 것입니다. 궁극적으로 가스 크로마토그래피는 영양 개입 후 조직의 지방산 조성이 어떻게 변하거나 임신과 같은 생리적 상태의 변화에 의해 영향을 받을 수 있는지 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 조직 지방산 조성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 오일, 씨앗 및 식품과 같은 다른 샘플 유형에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 사용하는 사용자는 프로토콜의 일부 부분이 수동 손재주가 필요하고 상위 및 하위 단계의 반복적인 수집과 같은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Hena, Fisk 및 우리 실험실의 기술자이자 박사 과정 학생인 Annette West입니다.

먼저 약 100mg의 냉동 간을 자르고 조직의 무게를 잰다. 티슈를 얼음 양동이 안의 플라스틱 튜브에 넣고 차가운 얼음 0.5ml, 염화나트륨 0.9%를 추가합니다. 그런 다음 조직을 균질화하고 유리 나사로 덮인 튜브로 옮깁니다.

0.3ml의 0.9%염화나트륨을 추가로 사용하여 남아 있는 조직을 유리 나사로 덮인 튜브로 옮깁니다. 그 후, 2 대 1에 용해 된 콜레스테롤 헤타 데첸 표준 100 마이크로 그램을 첨가하고, 건조 클로로포름에서 메탄올로 튜브에 첨가 한 다음, 부틸 화 하이드 록시 톨루엔 1 리터 당 50 밀리그램을 함유 한 동일한 용매 용액 5 밀리리터를 추가한다. 1몰 염화나트륨 1ml를 첨가한 후 튜브를 덮고 균일하게 보일 때까지 볼텍싱하여 샘플을 철저히 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 낮은 휴식으로 10분 동안 1000배 G로 샘플을 원심분리합니다. 완료되면 피펫을 지나 유리를 사용하여 하부상을 수집하고 새 스크류 캡 유리관으로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 40도의 질소에서 샘플을 건조시킵니다.

이 시점에서 SPE 탱크를 진공 펌프에 연결하고 탱크에 아미노 프로필 실리카 SPE 카트리지를 놓습니다. TAG 및 CCE라고 표시된 새 나사 뚜껑 유리관을 컬럼 아래의 탱크 랙에 놓고 첫 번째 분획을 수집합니다. 총 지질 추출물을 1ml의 건조 클로로포름에 용해시키고 볼텍싱(vortexing)하여 샘플을 혼합합니다.

그런 다음 유리 페이스트 피펫을 사용하여 샘플을 컬럼으로 옮기고 액체가 중력에 의해 스크류 캡 튜브로 떨어지도록 합니다. 액체가 더 이상 컬럼에서 떨어지지 않으면 진공으로 남은 액체를 제거하십시오. 다음으로, 진공 상태에서 1ml의 건조 클로로포름으로 컬럼을 두 번 세척하여 TAG 및 CE 분획을 용리시킵니다.

모든 액체가 컬럼에서 암시되면 TAG와 CE 분획을 섭씨 40도의 질소 하에서 건조시킵니다. SPE 탱크에 새 아미노 프로필 실리카 SPE 카트리지를 놓고 카트리지 아래의 탱크 트레이에 나사 캡 유리관을 놓아 폐기물을 수집합니다. 진공 상태에서 1ml의 건조 헥산으로 컬럼을 세 번 세척합니다.

진공 청소기를 끈 후 중력 하에서 마지막 1ml의 H 헥산으로 컬럼을 세척합니다. 폐기물 튜브를 ce라고 표시된 새 나사 캡 유리관으로 교체한 후 건조된 TAG와 CE 분획을 건조 헥산 1ml에 용해시키고 볼텍싱으로 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 유리 패스 또는 피펫을 사용하여 샘플을 컬럼으로 옮기고 액체가 중력 하에서 컬럼을 통해 떨어지도록 합니다.

액체가 더 이상 컬럼에서 떨어지지 않으면 진공 상태에서 진공 상태에서 남아 있는 액체를 제거합니다. 1ml의 건조 헥산으로 컬럼을 두 번 세척하여 CE를 용리시키고 수집된 분획을 섭씨 40도의 질소로 건조시킵니다. 그 후, 분리된 CE 분획에 0.5ml의 건조 톨루엔을 첨가하고 볼텍싱으로 샘플을 혼합합니다.

건조 톨루엔에 용해된 샘플에 미리 준비된 메틸화 시약 1ml를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 단단히 덮고 혼합합니다.샘플을 섭씨 50도에서 2시간 동안 부드럽게 가열합니다. 샘플이 실온으로 냉각되면 1ml의 중화 용액을 추가합니다.

다음으로, 건조 헥산 중 하나를 시료에 첨가하고 볼텍싱 원심 분리 후 실온에서 낮은 파손으로 2분 동안 250배 G로 시료를 추출합니다. 완료되면 상위 명성 위상을 수집하고 새로운 나사가 없는 캡 일회용 유리관으로 옮깁니다. 수집된 명성 샘플을 섭씨 40도의 질소에서 건조시킵니다.

폐기물 튜브를 SPE 탱크에 넣고 실리카겔, SPE 카트리지를 탱크에 넣은 후 진공 상태에서 1ml의 건조 헥산과 중력 상태에서 1ml의 건조 헥산으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 폐기물 제거 후 세척. 탱크에 새 폐기물 튜브를 추가 한 다음 CE 명성 샘플을 1 밀리리터의 건조 헥산에 용해시킵니다.

볼텍싱(vortexing)으로 샘플을 혼합한 후 유리 패스 또는 피펫을 사용하여 컬럼으로 옮깁니다. 중력 하에서 액체가 컬럼을 통해 떨어지면 진공 상태에서 1ml의 헥산으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 다음으로, 폐기물 세척을 제거하고 CE 명성이라고 표시된 새 비 나사 캡 튜브를 탱크에 넣습니다.

CE 명성 분획을 95 대 5 개의 건조 헥산에서 d 에틸 에테르로 2 개의 1 밀리리터로 용리합니다. 그런 다음 수집 된 분획을 섭씨 40도의 질소로 건조시키고 건조 된 분획을 75 마이크로 리터의 건조 헥산에 용해시키고 샘플이 와류에 의해 혼합 된 후 와류로 샘플을 혼합합니다. 이전 단계를 반복한 후 GC 자동 시료 바이알로 옮깁니다.

프로토콜이 성공적으로 준수되었는지 가스 크로마토그래프에서 샘플을 분석합니다. 명확한 대칭적이고 잘 정의된 피크와 최소한의 배경 잡음이 있는 크로마토그램은 여기에 설명된 대로 얻어야 합니다. 오염이 발생한 경우 크로마토그램은 추가 피크를 표시하고 여기에 표시된 것처럼 비대칭 또는 왜곡된 피크를 나타냅니다.

자유 콜레스테롤로 인한 오염은 콜레스테롤이 제거되지 않는 한 CE에서 파생 된 명성을 실행할 때 발생합니다. 준비된 보정 혼합물을 사용하면 샘플의 명성을 식별할 수 있습니다. 검량 혼합물은 샘플과 동일한 기기 설정을 사용하여 실행되므로 여기에 표시된 바와 같이 머무름 시간을 기반으로 식별된 샘플 및 피크와 크로마토그램을 비교할 수 있습니다.

16 zero peak는 상단 크로마토그램의 보정 혼합물과 지방산의 머무름 시간을 비교하기 위해 여기에 강조 표시되어 있습니다. 하단 샘플 추적에서 지방산의 올바른 라벨링을 허용하는 피크 영역은 전체 내 특정 지방산의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다. 데이터가 수집되면 여기에 표시된 대로 이상값을 검사하는 것이 유용합니다.

그런 다음 이상치 샘플을 추가로 조사하고 필요한 경우 추출 및/또는 분석을 반복할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 쥐 간 CE 내의 명성은 간 CE 내 총 지방산의 백분율로 설명됩니다. 이 데이터는 세 가지 다른 다이어트 중 하나에 20 일 동안 먹인 처녀 또는 임신 한 쥐의 간에있는 CE 지방산을 설명합니다.

Two Factor Innova를 사용한 통계 분석은 여러 지방산의 비율에 대한 식단과 임신의 유의미한 효과뿐만 아니라 임신 상호 작용에 의한 유의미한 식단을 보여줍니다. 예를 들어, 임신한 쥐에서 간 CE의 온산 함량은 처녀 암컷보다 식단의 영향을 더 많이 받습니다. 이 기술을 사용하면 올바르게 수행되면 하루에 20개의 샘플을 처음부터 끝까지 완료할 수 있습니다.

일단 마스터링되면 샘플을 일괄 처리하면 처리량이 증가하고 일주일 내에 처리량이 두 배로 늘어날 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 고체상 추출 및 가스 크로마토그래피를 사용하여 개별 지질 등급의 지방산 조성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 용제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드에서 작업하고 적절한 PPE를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.