비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

이 실험 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내의 단일 RNA 전사체를 실시간으로 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 ratio metric molecular beacon으로 알려진 헤어핀 형성 프로브를 형성하도록 설계된 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 ratio metric molecular beacon을 정제하는 것입니다.

다음으로, 마이크로포레이션을 통해 엔지니어링된 RNA 표적을 발현하는 세포 내로 분자 비콘(molecular beacons)에 의한 비율 측정 지표를 도입합니다. 마지막 단계는 라이브 셀 현미경 관찰에 적합한 마이크로웰 플레이트에 세포를 접종하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 단일 세포 내에서 밝은 형광 점으로 시각화된 개별 RNA 전사체의 이동을 모니터링합니다.

이 기술의 주요 장점은 밝고 광안정성이 뛰어나며 높은 신호 대 배경비(signal to background)를 나타내는 합성 프로브를 사용한다는 점이며, 이를 통해 모든 내인성 RNA를 이미지화할 수 있는 가능성이 열립니다. 튜브에 다음 시약들을 혼합하여 RBM B 또는 분자 비콘(molecular beacons)을 이용한 ratio metric 준비를 시작하십시오. Rbm B one 20 µL, Rbm B two 30 µL, 10x 인산염 완충액(phosphate buffer) 6 µL, 그리고 DNA 및 RNA free water 4 µL를 넣습니다. 이 양은 일반적으로 약 50회의 실험에 충분한 양입니다.

혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그동안 하이브리드화되지 않은 RBM B two 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위해 액체 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 주입 펌프를 사용하여 0.6 mL/min의 유속으로, 약 4 mL의 베드 부피를 가진 8 mL 액체 크로마토그래피 컬럼에 75 prep grade super deck을 사용합니다.

모든 액체가 베드 부피(bed volume)에 들어가기 전, 약 50 milliliters의 1x 인산 완충액으로 SUEx를 세척하고 평형화합니다. 시린지 펌프를 정지시키고 분리한 후, 남은 액체가 중력에 의해 컬럼을 통과하도록 둡니다. 다음으로, RBMB 혼합물을 크로마토그래피 컬럼에 로딩합니다.

RBMB 시료가 완전히 베드에 진입한 후, 시료 전체가 컬럼에 완전히 들어갔는지 확인하기 위해 1x phosphate buffer 250 µL를 베드 상단에 천천히 추가합니다. 1x phosphate buffer를 사용하여 컬럼의 가장자리까지 채웁니다. 상단을 닫고 시린지 펌프를 작동시킵니다.

주사기에 1X PBS 약 50 milliliters를 채우고 0.6 milliliters per minute의 유속으로 흘려줍니다. 일반적으로 프로브에 포함된 염료의 색상 덕분에 RBMB 샘플을 쉽게 시각화할 수 있습니다. RBMB가 컬럼 바닥에 가까워지면, 마이크로 원심분리 튜브당 두 방울씩 통과액을 수집하십시오.

시료 수집을 중단합니다. 마이크로 원심분리 튜브 내 시료의 색상이 투명해지면, 일반적으로 5~6개인 색상이 있는 RBMB 시료 포함 튜브들을 하나로 합쳐 원심분리 필터 장치에 넣습니다. 시료를 10,000 RCF에서 20분 동안 또는 원하는 부피가 될 때까지 원심분리합니다.

이 속도와 시간으로 진행하면 일반적으로 최종 부피는 약 30 µL가 됩니다. 본 프로토콜에서는 3' UTR에 RBMB 표적 서열이 96회 직렬 반복되어 발현되도록 제작된 인간 섬유육종 세포주와, 대조군으로 야생형 Q-F-P-R-N-A를 발현하도록 제작된 세포주를 사용하였습니다. 프로브 전달 하루 전, T 25 플라스크의 세포를 40~50% 합류도(confluency)로 배양합니다. 1% pen strep와 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하며, 다음 날 과정을 진행합니다.

마이크로포레이터를 켜고 HT 10 80 세포에 최적화된 마이크로포레이션 파라미터를 설정합니다. 마이크로포레이션 튜브에 4 mL의 전해질 완충액을 채운 후 마이크로 준비 스테이션에 배치합니다. 정제된 RBMB 스톡 샘플을 해동하고, 수 µL를 1x 인산 완충액으로 희석하여 최종 농도를 12 µM로 맞춥니다.

각 마이크로 포리온(micro porion)당 1 µL가 필요합니다. 각 마이크로 포리온 반응을 위해, 항생제가 포함되지 않고 FBS가 포함된 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리 튜브에 분주하십시오. 이를 마이크로 포리온 장치 근처에 둡니다.

이는 마이크로 전처리 직후 세포를 부유시키는 데 사용될 것입니다. 마이크로 전처리 후 세포 생존율을 저하시킬 수 있으므로 항생제는 사용하지 않습니다. 전날 분주한 조작된 HT 10 80 세포는 이제 60~80% 정도의 밀도로 증식해 있어야 합니다.

세포 배양 배지를 제거하고 calcium 및 magnesium이 없는 DPBS 1 mL로 세포를 한 번 세척한 후, trypsin 1 mL를 넣고 1~2분 동안 인큐베이션합니다. 항생제와 phenol red가 없는 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지 1 mL를 넣어 trypsin 반응을 중단시키고, 세포를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 2개에 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거한 후, 세포 펠렛을 최종 부피 1 mL의 DPBS로 재부유하여 합칩니다. 세포 수를 측정하기 위해 잘 혼합된 세포 현탁액에서 10 µL를 취하고, 세포가 잘 분산되도록 피펫으로 여러 번 위아래로 섞어준 뒤, 300,000개의 세포를 DPBS와 함께 새로운 1.5 mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하십시오. 펠렛을 11 µL의 Resus suspension buffer에 재현탁하고, 세포가 잘 분산되도록 피펫으로 여러 번 흡입 및 배출하십시오. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

희석된 RBMB 1 µL를 첨가하고 피펫팅을 여러 번 반복하여 잘 섞어줍니다. 이때 공기 방울이 생기지 않도록 다시 한번 주의하십시오. RBMB 현탁액에 공기 방울이 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 공기 방울은 마이크로 조작 중 스파크를 일으켜 RBMB 전달 효율을 떨어뜨리고 세포 사멸을 초래하기 때문입니다.

마이크로 프렙 피펫을 사용하여 RBMB 세포 혼합액 10 µL를 흡입한 다음, 피펫을 마이크로 프렙 튜브에 삽입하십시오. 시작 버튼을 눌러 마이크로 포레이션을 시작하십시오. 마이크로 포 화면에 완료 표시가 떴을 때 팁에 눈에 보이는 기포가 없어야 합니다.

피펫을 스테이션에서 제거하고, 10 µL 혼합물을 FBS가 포함되어 있으나 항생제는 없는 1 mL 배지가 들어있는 기준비된 마이크로 원심분리 튜브에 분주한 후, 튜브를 양옆으로 여러 번 가볍게 흔들어 섞어줍니다. 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 내로 전달되지 않은 rbm BS를 제거하기 위해, FBS가 포함되어 있으나 항생제는 없는 1 mL의 phenol red free 배지로 세포를 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 항생제가 포함되지 않은 FBS 함유 phenol red free 배양 배지 400 µL에 세포를 재부유합니다. 재부유된 세포를 미리 준비된 poly-D-lysine 코팅 8웰 챔버 커버 글라스에 웰당 200 µL 또는 원하는 합류도(confluency)로 분주합니다.

챔버 커버 글라스를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이미징은 마이크로 준비 후 30분 뒤부터 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 라이브 셀 스테이지 상단 배양 시스템을 켜고 37 °C, 5% carbon dioxide 및 75% 습도에 도달할 때까지 평형을 맞춥니다.

현미경과 형광 광원을 켜고 metamorph 이미지 획득 소프트웨어를 실행합니다. 대물렌즈에 이머전 오일을 도포합니다. 마이크로포어 세포가 담긴 챔버 커버글라스를 라이브 셀 스테이지로 옮깁니다.

상단 배양 시스템. 온도와 이산화탄소 수치가 안정될 때까지 스테이지 상단 시스템을 배양하십시오. Metamorph 소프트웨어에서 acquire 탭을 엽니다.

라이브 보기 버튼을 클릭하여 관찰 영역을 찾습니다. 백색광 상태에서 초점을 조정한 후 라이브 중지 버튼을 클릭합니다. 획득 탭에서 진행합니다.

스트림 획득 팝업 버튼을 클릭하여 열고 원하는 동영상 획득 파라미터를 설정하십시오. SCI five CF six 40 R 필터를 사용하여 150 프레임을 획득하십시오. 이미지를 하드 드라이브에 저장하십시오.

여기 제시된 이미지는 3' UTR에 96회의 탠덤 반복 서열 또는 RBMB 결합 부위의 4회 탠덤 반복 서열을 포함하는 RNA를 안정적으로 발현하는 HT 10 80 세포의 대표 이미지입니다. mbs를 세포 내로 전달한 후의 모습입니다. 96회의 탠덤 반복 서열이 존재함으로써 개별 RNA 전사체가 밝은 형광 점으로 나타나게 됩니다.

이와 대조적으로, 4개의 탠덤 반복 서열만을 포함하는 RNA는 매우 희미한 형광 점으로 나타나며, 배경 신호가 매우 낮은 영역에서만 검출 가능한 경우가 많습니다. 스트리밍 이미지를 획득하면 개별 RNA 전사체를 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 브라운 운동 또는 하확산 운동을 하는 세포의 세포질과 핵 내에서 개별 RNA 전사체를 쉽게 관찰할 수 있습니다.

드문 경우지만, 지향성 수송(directed transport)을 거치는 RNA가 여기에서 보이는 것과 같이 관찰됩니다. 지향성 수송을 거치는 RNA 전사체는 일반적으로 직선 경로를 따라 빠르게 이동합니다. 이 몽타주에서는 시계열의 단일 프레임 위에 RNA 전사체의 궤적이 겹쳐져 표시되어 있습니다.

지향성 RNA 이동은 미세소관 및 미세필라멘트를 따른 RNA 수송과 일치합니다. 이 영상을 시청한 후, 분자 비콘을 이용하여 RNA 메트릭을 준비하고 정제하는 방법, 마이크로인젝션을 통해 세포 내로 분자 비콘 RNA 메트릭을 전달하는 방법, 그리고 형광 현미경으로 단일 RNA 전사체를 이미지화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.