Name: 비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 학습하세요 비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포에서 단일 RNA 전사체를 실시간 영상화하는 방법을. 형광 현미경으로 RNA 역학을 관찰하여 유전자 발현 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (0953583) 및 건강 NCI / R21-CA116102의 국립 연구소, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서는 하나의 올리고 뉴클레오티드 (RBMB1)는 CF640R 기자 염료와의 5&#39;-끝 부분에 표시하고, 순서를 가지고 : 5&#39; mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC 뮤 mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 &#39;. 머리 핀의 자형 구조의 형성을 구동 자체 보완 도메인은 굵게 표시되어 있습니다. 둘째 올리고 뉴클레오티드 (RBMB2)는 아이오와 블랙 RQ-SP 거제와 &#39;말단에 표지와 순서가되었다 : 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. RBMBs의 1 준비 <ol><li> RBMB1 및 RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 튜브의 빠른 스핀을 수행 건조 올리고 뉴클레오티드는 100 μM의 최종 농도의 DNase와의 RNase가없는 물에 튜브의 바닥 및 재현 탁입니다 보장합니다. 예를 들어, 올리고 뉴클레오티드의 10 nmol을 샘플을 물 100 ㎕에 재현 탁한다. </li><li> MEAS우레 UV-VIS 분광에 의해 RBMB1 및 RBMB2 재고 샘플의 정확한 농도. <ol><li> microcentrifuge 관에서 (칼슘과 마그네슘없이) 117 μL의 DPBS로 RBMB 샘플 3 μl를 섞는다. </li><li> DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다. </li><li> 식을 이용하여, 260 나노 미터 (또는 650 nm의 RBMB1)에서의 흡광도에 기초 RBMB 샘플 스톡 농도를 계산 스톡 농도 (M)는 260 (260) nm에서 흡광도 및 희석 배수가 40 인 260 * 희석 팩터 / 흡광 계수 =. 주 : RBMB 대한 흡광 계수는 올리고 뉴클레오티드 제조업체에서 제공 사양서에서 찾을 수있다. 650 nm에서 CF640R의 흡광 계수는 103000이다. </li></ol></li><li> 100 μM의 RBMB1의 20 μL, 100 μM의 RBMB2의 30 μl를, 혼합 6 ㎕의 10 배, 인산염 완충액 (10 배 인산염 완충액 : 480 밀리미터 K 2 HPO 4, 45 mM의 KH 2 PO 4, 140 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2) 4 μL의 DNase의와의 RNase없는 물입니다. 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 주 : 이것은 일반적으로 약 50 연구에 충분하다. </li><li> 모든 unhybridized RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 제거하기 위해 75 학년 준비하고, Superdex를 사용하여 액체 크로마토 그래피 컬럼을 준비합니다. 혼합 된 프로브의 작은 볼륨을 정화 ~ 4 ml의 침대 볼륨과 8 ㎖ (0.7 × 20cm) 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다. </li><li> 세척은 0.6 ㎖ / 분의 유속으로 유동 실행 주사기 펌프를 사용하여 ~ 1X 인산 완충액 50 ㎖를하고, Superdex을 평형화하고. 유체가 모두 베드 부피로 진입하기 전에, 주사기 펌프를 정지하여 분리하고 남은 액체는 중력에 의해 열을 가자. </li><li> 크로마토 그래피 컬럼 상에 RBMB 혼합물 (60 μl를) 넣습니다. <ol><li> RBMB 샘플은 완전히이 후베드 입력 천천히 전체 샘플을 완전히 열 진입했음을 확인하기 위해 베드의 상부에 1X 인산 완충액 250 ㎕를 또 다른 추가. </li><li> 1X 인산 버퍼 림에 열을 채 웁니다. 상단을 닫고, 주사기 펌프를 시작 - 주사기가 충전되어야 ~ 50 mL의 PBS 1X 및 0.6 ml / 분의 유속으로 실행. </li><li> RBMB 컬럼의 하단에 가까워지면 - RBMB 시료 전형적 용이 프로브에 혼입 염료의 색으로 인해 가시화 될 수있다 - microcentrifuge 관 당 2 방울 (1.5 ㎖)에 흐름을 통해 수집한다. 마이크로 원심 튜브 내에서 색이 분명해진다 일단 샘플을 수집 중지합니다. </li></ol></li><li> 일반적으로 5 ~ 6 튜브 - - 컬러 RBMB 샘플이 들어있는 튜브를 결합하고 원심 필터 장치 (10,000 MW 컷오프)로로드합니다. 20 분 동안이나 원하는 볼륨까지 10,000 RCF에서 샘플을 원심 분리기. 주 :이 속도와 시간은 것입니다 일반적으로~ 30 μL의 최종 부피를 수득 하였다. </li><li> UV-VIS 스펙트럼에 의해 정제 RBMB 샘플의 정확한 농도를 측정한다. <ol><li> 농축 RBMB 샘플 3 μl를 타고 microcentrifuge 관에 117 μL의 DPBS와 혼합. </li><li> DPBS 빈 분광 광도계는 200 ~ 800 nm의에서 흡광도를 측정한다. 참고 : 피크가 260 nm에서 흡광도 650 nm의가 볼 수 있어야합니다. </li><li> 식을 이용하여, 650 nm에서의 흡광도에 기초하여 혼성화 RBMB의 스톡 농도를 계산 스톡 농도 (M)는 650 (650) nm에서 흡광도가 650 * 희석 팩터 / 소멸 계수 = 희석 인자는 40이다. 주 :하는 650nm에서 CF640R 대한 흡광 계수가 103000이고 아이오와 블랙 RQ 대한 흡광 계수가 20,000 ~. 흡광 계수는 첨가제 아르와 하이브리드로 구분하지 않습니다. 따라서, 주식 RBMB 샘플 approximatel의 조합 흡광 계수가650 nm에서 Y 123000. </li></ol></li><li> 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 이름과 농도 및 저장 적절하게 튜브를 레이블을 지정합니다. </li></ol> 8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 폴리-D-라이신의 2 준비 <ol><li> 무균 환경에서 멸균 물 25 ㎖ 중의 폴리-D-라이신 (동결 건조 분말, g-조사) 5mg을 용해시켜 폴리-D-라이신의 0.2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비한다. </li><li> 무균 환경에서, 8 잘 챔버 커버 글라스의 각 웰에 0.2 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 용액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 세포 배양 후드에서 16 ~ 18 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> 폴리-D-라이신을 대기음 멸균 증류수로 잘 3 번 씻는다. 참고 : 코팅 챔버 슬라이드가 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3 프로브 배달 주 : 적어도 4 연속 바인드 RNA를 발현 통합 유전자 구조를 포함해야 사용 전지 시스템3&#39;-비 번역 영역 (UTR)의 RBMB에 대한 사이트를 보내고. 표적 서열은 RBMB의 루프 보완해야한다. 이는 음성 대조군으로서, 동일 세포주가 동일한 유전자 구조를 표현할 수 있도록 설계되는 것이 권고되지만 탠덤 반복하지 않고있다. 이 프로토콜에서, 인간 섬유 육종 세포주는 HT1080, 3&#39;-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복으로 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다. 제어 세포주가 야생형 GFP의 RNA를 발현하도록 설계 하였다. <ol><li> 일일 프로브 배달 전에 40~50%의 포화 상태에서 T25 플라스크에 플레이트 세포. 농경 1 % 펜 / 패 혈성 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 매체와 세포 및 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 다음 날, microporator 켜고 950 V,이 펄스, 25 밀리 초에 microporation 매개 변수를 설정합니다. 이러한 매개 변수는 HT1080 세포에 최적화 된,하지만 그들은 의존 세포의 유형과 adjus가 될 수 있습니다테드는 다른 세포 유형에 대한 제조업체의 지침에 설명 된대로. </li><li> 4 ML 전해 버퍼 microporation 튜브를 입력하고 microporation 역에 놓습니다. </li><li> 정제 RBMB의 주식 샘플을 꺼내서 해동. 1X 인산 완충액 12 μM의 최종 농도로 몇 마이크로 리터를 희석. 1 ㎕를 각 microporation 필요합니다. </li><li> 피펫 FBS와하지만 microcentrifuge 관으로 항생제가없는 배지 1 ㎖. 주 :이 당분간 microporation 장치 근처 microporation 직후 세포를 중단하는 데 사용되며, 별도로 설정 될 수있다. 배양 배지에서 항생제의 포함은 microporation 후 세포 생존율을 감소한다. </li><li> 한 번 1 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 2 + - 무료 DPBS로 세포를 씻어 설계 HT1080 세포 (60-80% 합류)에서 세포 배양 배지를 제거하고 1-2 분 동안 한 ML 트립신을 품다. </li><li> trypsinizatio 중지항생제와 페놀 레드없이 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 DMEM 1 ㎖의 매체를 추가하고,이 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송함으로써 N. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 마이크로 원심 튜브에 세포를 스핀 다운. 상층 액에 resuspend를 제거하고 1 ML의 DPBS의 최종 볼륨 세포 펠릿을 결합한다. </li><li> 잘 혼합 된 세포 현탁액에서 10 μl를 가지고 세포를 계산합니다. </li><li> 확실히 그들은 잘 분산하고 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 DPBS 30 만 셀을 전송하고 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운 위아래로 여러 번 세포를 피펫. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 제거합니다. 세포가 잘 분산되도록 11 μL의 재 부상 버퍼와 피펫 위아래로 여러 번에 펠렛을 재현 탁. 공기 방울을 생성하지 않도록해야합니다. 참고 : 공기 거품이 microporation 동안 스파크의 원인이 가난한 RBMB 전달 및 세포 사멸 발생합니다. </li><li> 희석 RBMB (12 μM) 1 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다. 다시 공기 방울을 생성하지 않도록주의하십시오. </li><li> 기음 RBMB 세포 혼합물의 10 μL, microporation 피펫을 사용하고 microporation 튜브에 피펫을 삽입합니다. microporation을 시작하려면 시작 버튼을 누릅니다. 참고 : 끝에서 눈에 보이는 기포가 없어야합니다. </li><li> microporator의 화면이 완료가 표시되면, FBS와하지만, 항생제없이 1 ml의 배지와 함께, 이전 제조 하였다 microcentrifuge 관에 10 ㎕의 혼합물을 배출, 역에서 피펫을 제거합니다. 튜브 좌우 수회 부드럽게 흔들어 섞는다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀과 세포로 전달되지 않은 모든 RBMBs을 제거하기 위해, FBS와 함께하지만, 항생제없이 1 ml의 페놀 레드 무료 배지에서 세포를 두 번 이상 세척. FBS은 있지만없이 400 ㎕의 페놀 레드 무료 문화 매체와 재현 탁항생제. </li><li> 플레이트 잘 당하거나 원하는 자랄 200 μL에서 8 잘 챔버 커버 글라스 코팅 된 폴리-D-라이신에 microporated 세포. </li><li> 선택적 : 그것이 핵이 화상에 바람직한 경우, 0.01 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 세포에 Hoescht 33,342 추가. </li><li> 세포 배양 인큐베이터로 챔버 커버 글라스를 놓습니다. 세포를 커버 글라스의 표면 상에 정착 할 충분한 시간을 가질 수 있도록, 종래 촬상 1-2 시간 동안 세포를 배양한다. 주 : 이미징을 30 분 포스트 - microporation 자마자 수행 될 수있다. </li></ol> 4 이미지 인식 <ol><li> 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템을 켭하고 37 ° C, 5 % CO 2, 75 %의 습도에 도달 할 때까지 그것을 평형. </li><li> 현미경과 형광 광원의 전원을 켜고 MetaMorph로부터 소프트웨어를 엽니 다. 주 : 현미경 제어 및 이미지 획득을위한 다른 유사한 소프트웨어 패키지가 또한 사용될 수있다. </li><li> 에 Immersol 오일을 적용목적. </li><li> 라이브 세포 단계 상위 배양 시스템에 microporated 세포와 챔버 커버 글라스를 전송합니다. 온도가 될 때까지 무대 위에 시스템을 품어 CO 2 농도는 안정된다. </li><li> MetaMorph로부터 소프트웨어에서 획득 탭​​을 엽니 다. 필드를 찾기 위해, 라이브 버튼을 클릭하여 흰색 빛 아래 초점을 조정하고 중지 라이브 버튼을 클릭합니다. </li><li> 획득 탭에서 클릭하고 스트림 인수 팝업 버튼을 열고 원하는 영화 인수 매개 변수를 설정합니다. Cy5에 / CF640R 필터를 사용하여 150 프레임을 획득하고 하드 드라이브에 이미지를 저장합니다. </li></ol>

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닥터 마크 Behlke 박사 링 황는 원고에 기술 된 화합물의 일부 유사한 판매 올리고 뉴클레오티드를 제공하는 IDT에 의해 사용된다. IDT는 그러나, 상장 회사, 그리고 그들은 개인적으로 IDT의 / 자기 지분을 보유하고 있지 않습니다.

기존의 넓은 필드 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체 할 수있는 능력은 각 RNA 전 사체 언 바운드 형광 프로브로부터 나오는 낮은 형광 배경에 관련 지을 수있는 밝고 광 안정성 형광 신호를 필요로한다. 이 방법에서, 밝은 형광 신호는 각각의 RNA 전 사체 상에, (96까지) 다중 올리고 뉴클레오티드 계 형광 프로브, 즉 RBMBs 혼성화함으로써 달성된다. 그러나, 몇 네 바인딩 사이트는 16 충분하다. 집합 신호는 실시간으로 추적 할 수있는 밝은 스폿 형광 초래한다. 집단 신호가 손실되기 전에 형광 염료의 실질적인 분획 photobleached되어야하므로 여러 프로브의 존재는 또한, 이상 촬상 시간을 허용한다. 그것은이 기술은 RNA 생물학에 독특한 통찰을 제공 번째 측정에서 레인 징 동작 RNA의 광범위한 연구를 위해 허용되는 것으로 구상표적 RNA의 고유 한 세포 내 현지화 패턴을 관찰하는 다양한 외부 자극, RNA의 운명과 수명을 공부하고, RNA...

RNA 전 사체의 발현 및 조절은 세포의 행동과 운명을 제어하기위한 주로 담당하는 복잡하고 역동적 인 과정이다. 지시 된 세포 기능의 RNA의 중요성이 얼마 동안 알려져 있지만,이 가장 RNA 분석 도구는 전사 붕괴 중요 규제 이벤트를 캡처하기 위해 필요한 공간 및 시간 해상도가 부족하기 때문에, RNA 들간의 연결을 그리는 힘들다 인신 매매 및 지역화 된 RNA 처리. 이것은 각각의 RNA 전 사체가 실시간 1에 살아있는 세포에 시각화 할 수 있도록 여러 기술의 출현하게되었다. 아마,이 기술의 가장 눈에 띄는는 3&#39;-UTR 2,3에 MS2 결합 부위의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다 RNA를 대상으로 GFP-MS2 융합 단백질을 이용한다. 가까운 거리에 여러 GFP 분자를 제공함으로써, 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 나타나는형광 현미경을 통한. GFP-MS2 시스템은 직접 시각화 및 전사의 측정 4,5 분출 독특한 서브 셀룰러 지역화 및 처리 6-9의 검출, 및 RNA 수송층 (10)의 실시간 영상을 포함한 RNA 동작으로 전례 통찰력을 제공하고있다. 그러나, GFP-MS2 시스템의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 언 바운드 GFP-MS2 융합 단백질이 기술의 다양성과 동적 범위를 제한하는 높은 배경 형광 신호를 생성 할 수 있습니다. 몇몇 접근법은 세포 내 비 결합 GFP-MS2 (10)의 구획화, 단백질 단편 상보성 (11), 및 대체 RNA 결합 단백질을 포함하여, 이러한 배경 신호를 제한하기 위해 개발 및 12을 표적으로되었다. 그러나 이러한 접근 방법은 모든 RNA 표적과 MS2-GFP 융합 단백질의 상대적 총 발현에 민감한 남아있다. 로GFP-MS2 시스템에 lternative, 분자 비콘은 3&#39;-UTR 13,14에 상보적인 결합 부위의 탠덤 반복으로 조작 된 RNA 전 사체를 검출하기 위해 사용되어왔다. 분자 비콘은 소광 한 끝에 형광 리포터와 함께 타단 개는 헤어핀 - 형성 올리고 뉴클레오티드 프로브이다. 소광 RNA에게 형광 기자를 대상으로 바인딩하지 않을 경우 낮은 형광 상태의 결과로, 가까이에 남아있다. 하이브리드시, 형광 기자와 소광 떨어져 강제로 형광이 복원됩니다. GFP-MS2 시스템, 형광 현미경으로 식별 할 수있는 밝은 형광 반점의 단일 RNA 전 사체의 결과로 여러 분자 표지의 결합에 유사; 그러나, 배경 형광 인해 비 결합 분자 비컨 켄칭 구성으로, 훨씬 낮은 것으로 예상된다. 불행하게도, 영리 활성화 메커니즘에도 불구하고 그 m에 통합olecular 표지 디자인, 살아있는 세포에 도입 할 때 머리 핀의 자형 형태를 유지하지 않는 분자 비콘을 unhybridized 성장 증거가 지금있다. 결과적으로, 그들은 훨씬 신호대 배경을 감소 위양성 신호를 생성한다. 15, 16,이 단점을 극복하기 위해, 우리는 최근 살아있는 세포, 비율 계량 생체 분자 비콘 (그림 1A RBMBs)에 영상 RNA에 대한 새로운 합성 프로브를 개발했다. RBMBs 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를) 및 분자 비콘 모두의 기능을 가진 복합 구조체를 형성하는 두 개의 2&#39;-O-메틸 가닥 올리고 뉴클레오티드로 구성된다. 3&#39;-오버행과 UU 긴 이중 가닥 도메인 shRNA를 더 특징 인 반면 루프 및 형광 활성화 메커니즘, 분자 비콘 유사하다. shRNA를 기능은 최소한의 관찰 저하 우리는&gt; 24 시간으로 증가에게 세포 수명을 발견 핵 수출을 구동하도록 설계되어루프의 비 특정 개방을 방지 할 수 있습니다. 결과 RBMBs 분자 비콘보다 훨씬 높은 신호 대 배경을 나타내고있다. RBMBs가 RNA 기반 프로브와 같은 핵 수출 기능을 소유하지 않은 DNA 프로브 기반하기 때문에, DNA 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 제조 할 수 없다는 것을 또한 주목해야한다. 구조적 RBMB 루프는 일반적으로 RNA 혼성화시 특이성 및 선택성 사이의 균형을 만들기 위해, 길이 (15) 및베이스 (21) 사이에있을 수 있도록 설계된다. 이 자체 보완 도메인에서 형성하는 짧은 줄기는 보통 4 기지가 될 수 있도록 설계되었습니다. 이상 줄기가 선택된 경우 RBMB 루프와 표적 RNA와 혼성화 속도는 상당히 17,18 둔화된다. 줄기 짧은 시퀀스가​​ 선택되면 반대로, 용융 온도가 높은 백그라운드 신호 선도, 37 ° C에서 스템 - 루프 구조를 유지하기 위해 종종 너무 낮다. RBMB의 특이성은 빨간색입니다줄기 길이를 짧게 같이 uced. 또한 RBMB 성능에 영향을 미칠 수 RBMB 스템 - 루프의 서열 때문에, 조심스럽게 19을 선택한다. 특히, 이상적인 루프 서열은, 최소한의 이차 구조를 가져야 최소한 이차 구조와 RNA 서열에 혼성화, 단백질 결합 부위를 방지하고, 바인딩 표적 이탈 방지. RBMB 및 RNA 이차 구조 모두의 예측은 mfold (20)와 같은 소프트웨어를 사용하여 얻을 수있다. 보완 오프 대상 사이트는 염기 기본 지역 지정 검색 도구 (BLAST)를 사용하여 식별 할 수 있습니다. 그러나, 모델 예측과 단백질 기다리고 사이트를 식별하는 데 어려움 불일치의 모든 RBMBs의 특이도는 궁극적으로 실험적으로 검증되어야합니다. 바람직한 경우, 혼성화 상태에 민감하다 unquenched 기준 염료 RBMB (15)에 첨가 될 수있다. 기준 염료의 추가 홍보 할 수 있습니다프로브 배달 마커 ovide 총 형광 세포의보다 정확한 측정이 요구되는 경우, 비율 적 촬상에 사용될. 기준 염료 측정 배달 세포 간 차이로 인해 배경에서의 차이에 대해 조정될 수있다. 그러나, 개개의 RNA를 묘화 할 때 참조하면 염료가 필요하지 않다 사체. 특히, 일부 참조 염료는 핵에 약간 더 높은 배경 신호로 이어지는 핵에서 RBMBs의 수출을 방해 할 수 있습니다. 적절하게 설계하면 표적 RNA는 적어도 네 RBMB 결합 부위 (도 1b) (16)를 포함하도록 설계된다면, RBMBs는 단일 살아있는 세포에서 개별 이미지 RNA 전 사체에 사용될 수있다. RBMBs 효율적으로 세포 생존율 (21)에 아무런 영향이 거의, microporation 통해 세포 유형의 넓은 범위로 제공 될 수 있으며, 유전자 발현의 정량적 인 측정을 할 수있다30 분 이내에 취득했다. 바인드 RBMBs부터 형광을 효율적으로 급냉되기 때문에 더욱이, 방법은, RBMB 농도와 표적 RNA 수준에 비교적 둔감하다. 여기서 우리는 RBMBs을 제조하고 정제하는 데 사용되는 방법의 상세한 설명뿐만 아니라 microporation 통해 라이브 세포로 RBMBs의 전달을위한 일반 절차와 실시간 단일 RNA 전 사체의 화상을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>DEPC 처리 없음</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>No Ca2+ 및 Mg2+</td></tr><tr><td>Cary 100 UV-Vis 분광 광도계</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>크로마토그래피 컬럼</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 준비 등급</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td>, <td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml, Luer-lok 팁</td></tr>, <tr><td>원심 필터 장치</td><td>, Millipore</td><td>UFC501096</td><td>MW 10,000 차단</td></tr><tr><td>원심분리기 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>동결건조 분말, g-방사선 조사</td></tr><tr><td>8웰 챔버 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>작업량 0.2-0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>인간 섬유육종 세포주</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 없는</td> 고포도당 DMEM <td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td>고혈당</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페네실린/스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>생명 기술</td><td>25300054</td><td>0.05% 트립신-EDTA</td></tr><tr><td>네온 형질주입 시스템</td><td>생명 기술</td><td>MPK5000</td><td></td>네온 형</tr><tr><td>질주입 시스템 키트</td><td>생명 기술</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 도립 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA 광 엔진</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>분자 장치</td><td></td><td>소프트웨어 제어 현미경</td></tr><tr><td>Immersol 오일 518F</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 rna 성적 증명서의 실시간 영상

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

두 유전자 발현의 시공간적 규제 세포 기능에 중요한 영향을 미칠 수 성장 실현 단일 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체를 시각화하기 위해 다양한 기술이 개발되었다. 최근에 설명 된 한가지 유망한 기술은 3&#39;-비 번역 영역 RBMB 표적 서열의 적어도 네 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었다 RNA 전 사체를 검출 올리고 뉴클레오타이드 기반의 광학 탐침, 비율 적 이분자 비컨 (RBMB)를 이용한다. RBMBs 구체적으로 보완 RNA에 혼성화에 따라 밝은 형광 신호를 방출하도록 설계되어 있지만, 그렇지 않으면 침묵 상태로 유지됩니다. 이 방법에서는 프로브의 합성 사용 적색 편이, 광 안정성 허용하고, 높은 발광 유기 염료는 촬상을 위해 사용된다. 넓은 필드 형광 현미경으로 볼 때 개별 형광 명소의 설계 RNA 전 사체 결과에 여러 RBMBs의 결합. 결과적으로, 각각의 RNA 전 사체의 이동이 용이 형광 화상의 시계열을 촬영하여 실시간으로 시각화 될 수있다. 여기에서 우리는 microporation에 의해 세포로 제조 및 정제 RBMBs의 배달을 설명하고 살고 셀 단일 RNA 전 사체의 이미지를.

넓은 필드 형광 현미경 (도 2)에 의해 촬상 할 때 곧 RBMBs의 존재 HT1080 세포 microporation 따라, 조작 된 개별 RNA 전 사체들이 3&#39;-UTR에서 여러 RBMB 결합 부위를 포함 할뿐만 밝은 형광 점으로 나타나는. 적은 네 RBMB 결합 부위 개별 RNA 전 사체는 라이브 세포 이미징 될 수 있지만, 3&#39;-UTR에 결합 부위보다 RBMB, 강한 형광 신호. 신호 인해 photobleaching에 손실되기 전에 또한, 이상 각 증명서에 바인딩 더 RBMBs는 RNA가 가시화 될 수있다. 이 프로토콜에서, RNA는 3&#39;-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되었다. 스트리밍 영상의 획득은 개별 RNA 전 사체를 실시간 (동영상 1)에서 이미지를 만들 수 있습니다. 개인 RNA 전 사체는 쉽게 세포질과 핵 O 내에서 이동 볼 수 있습니다세포 바. 관광 명소의 대부분은 드문 경우에, 브라운...

비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 살아있는 세포 내의 단일 RNA 전사체를 실시간으로 이미징하는 것입니다. 이는 먼저 ratio metric molecular beacon으로 알려진 헤어핀 형성 프로브를 형성하도록 설계된 두 개의 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 ratio metric molecular beacon을 정제하는 것입니다.다음으로, 마이크로포레이션을 통해 엔지니어링된 RNA 표적을 발현하는 세포 내로 분자 비콘(molecular beacons)에 의한 비율 측정 지표를 도입합니다. 마지막 단계는 라이브 셀 현미경 관찰에 적합한 마이크로웰 플레이트에 세포를 접종하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 단일 세포 내에서 밝은 형광 점으로 시각화된 개별 RNA 전사체의 이동을 모니터링합니다.이 기술의 주요 장점은 밝고 광안정성이 뛰어나며 높은 신호 대 배경비(signal to background)를 나타내는 합성 프로브를 사용한다는 점이며, 이를 통해 모든 내인성 RNA를 이미지화할 수 있는 가능성이 열립니다. 튜브에 다음 시약들을 혼합하여 RBM B 또는 분자 비콘(molecular beacons)을 이용한 ratio metric 준비를 시작하십시오. Rbm B one 20 µL, Rbm B two 30 µL, 10x 인산염 완충액(phosphate buffer) 6 µL, 그리고 DNA 및 RNA free water 4 µL를 넣습니다. 이 양은 일반적으로 약 50회의 실험에 충분한 양입니다.혼합물을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그동안 하이브리드화되지 않은 RBM B two 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위해 액체 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 주입 펌프를 사용하여 0.6 mL/min의 유속으로, 약 4 mL의 베드 부피를 가진 8 mL 액체 크로마토그래피 컬럼에 75 prep grade super deck을 사용합니다.모든 액체가 베드 부피(bed volume)에 들어가기 전, 약 50 milliliters의 1x 인산 완충액으로 SUEx를 세척하고 평형화합니다. 시린지 펌프를 정지시키고 분리한 후, 남은 액체가 중력에 의해 컬럼을 통과하도록 둡니다. 다음으로, RBMB 혼합물을 크로마토그래피 컬럼에 로딩합니다.RBMB 시료가 완전히 베드에 진입한 후, 시료 전체가 컬럼에 완전히 들어갔는지 확인하기 위해 1x phosphate buffer 250 µL를 베드 상단에 천천히 추가합니다. 1x phosphate buffer를 사용하여 컬럼의 가장자리까지 채웁니다. 상단을 닫고 시린지 펌프를 작동시킵니다.주사기에 1X PBS 약 50 milliliters를 채우고 0.6 milliliters per minute의 유속으로 흘려줍니다. 일반적으로 프로브에 포함된 염료의 색상 덕분에 RBMB 샘플을 쉽게 시각화할 수 있습니다. RBMB가 컬럼 바닥에 가까워지면, 마이크로 원심분리 튜브당 두 방울씩 통과액을 수집하십시오.시료 수집을 중단합니다. 마이크로 원심분리 튜브 내 시료의 색상이 투명해지면, 일반적으로 5~6개인 색상이 있는 RBMB 시료 포함 튜브들을 하나로 합쳐 원심분리 필터 장치에 넣습니다. 시료를 10,000 RCF에서 20분 동안 또는 원하는 부피가 될 때까지 원심분리합니다.이 속도와 시간으로 진행하면 일반적으로 최종 부피는 약 30 µL가 됩니다. 본 프로토콜에서는 3' UTR에 RBMB 표적 서열이 96회 직렬 반복되어 발현되도록 제작된 인간 섬유육종 세포주와, 대조군으로 야생형 Q-F-P-R-N-A를 발현하도록 제작된 세포주를 사용하였습니다. 프로브 전달 하루 전, T 25 플라스크의 세포를 40~50% 합류도(confluency)로 배양합니다. 1% pen strep와 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하며, 다음 날 과정을 진행합니다.마이크로포레이터를 켜고 HT 10 80 세포에 최적화된 마이크로포레이션 파라미터를 설정합니다. 마이크로포레이션 튜브에 4 mL의 전해질 완충액을 채운 후 마이크로 준비 스테이션에 배치합니다. 정제된 RBMB 스톡 샘플을 해동하고, 수 µL를 1x 인산 완충액으로 희석하여 최종 농도를 12 µM로 맞춥니다.각 마이크로 포리온(micro porion)당 1 µL가 필요합니다. 각 마이크로 포리온 반응을 위해, 항생제가 포함되지 않고 FBS가 포함된 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리 튜브에 분주하십시오. 이를 마이크로 포리온 장치 근처에 둡니다.이는 마이크로 전처리 직후 세포를 부유시키는 데 사용될 것입니다. 마이크로 전처리 후 세포 생존율을 저하시킬 수 있으므로 항생제는 사용하지 않습니다. 전날 분주한 조작된 HT 10 80 세포는 이제 60~80% 정도의 밀도로 증식해 있어야 합니다.세포 배양 배지를 제거하고 calcium 및 magnesium이 없는 DPBS 1 mL로 세포를 한 번 세척한 후, trypsin 1 mL를 넣고 1~2분 동안 인큐베이션합니다. 항생제와 phenol red가 없는 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지 1 mL를 넣어 trypsin 반응을 중단시키고, 세포를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 2개에 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거한 후, 세포 펠렛을 최종 부피 1 mL의 DPBS로 재부유하여 합칩니다. 세포 수를 측정하기 위해 잘 혼합된 세포 현탁액에서 10 µL를 취하고, 세포가 잘 분산되도록 피펫으로 여러 번 위아래로 섞어준 뒤, 300,000개의 세포를 DPBS와 함께 새로운 1.5 mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하십시오. 펠렛을 11 µL의 Resus suspension buffer에 재현탁하고, 세포가 잘 분산되도록 피펫으로 여러 번 흡입 및 배출하십시오. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.희석된 RBMB 1 µL를 첨가하고 피펫팅을 여러 번 반복하여 잘 섞어줍니다. 이때 공기 방울이 생기지 않도록 다시 한번 주의하십시오. RBMB 현탁액에 공기 방울이 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 공기 방울은 마이크로 조작 중 스파크를 일으켜 RBMB 전달 효율을 떨어뜨리고 세포 사멸을 초래하기 때문입니다.마이크로 프렙 피펫을 사용하여 RBMB 세포 혼합액 10 µL를 흡입한 다음, 피펫을 마이크로 프렙 튜브에 삽입하십시오. 시작 버튼을 눌러 마이크로 포레이션을 시작하십시오. 마이크로 포 화면에 완료 표시가 떴을 때 팁에 눈에 보이는 기포가 없어야 합니다.피펫을 스테이션에서 제거하고, 10 µL 혼합물을 FBS가 포함되어 있으나 항생제는 없는 1 mL 배지가 들어있는 기준비된 마이크로 원심분리 튜브에 분주한 후, 튜브를 양옆으로 여러 번 가볍게 흔들어 섞어줍니다. 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 내로 전달되지 않은 rbm BS를 제거하기 위해, FBS가 포함되어 있으나 항생제는 없는 1 mL의 phenol red free 배지로 세포를 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후, 항생제가 포함되지 않은 FBS 함유 phenol red free 배양 배지 400 µL에 세포를 재부유합니다. 재부유된 세포를 미리 준비된 poly-D-lysine 코팅 8웰 챔버 커버 글라스에 웰당 200 µL 또는 원하는 합류도(confluency)로 분주합니다.챔버 커버 글라스를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이미징은 마이크로 준비 후 30분 뒤부터 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 라이브 셀 스테이지 상단 배양 시스템을 켜고 37 °C, 5% carbon dioxide 및 75% 습도에 도달할 때까지 평형을 맞춥니다.현미경과 형광 광원을 켜고 metamorph 이미지 획득 소프트웨어를 실행합니다. 대물렌즈에 이머전 오일을 도포합니다. 마이크로포어 세포가 담긴 챔버 커버글라스를 라이브 셀 스테이지로 옮깁니다.상단 배양 시스템. 온도와 이산화탄소 수치가 안정될 때까지 스테이지 상단 시스템을 배양하십시오. Metamorph 소프트웨어에서 acquire 탭을 엽니다.라이브 보기 버튼을 클릭하여 관찰 영역을 찾습니다. 백색광 상태에서 초점을 조정한 후 라이브 중지 버튼을 클릭합니다. 획득 탭에서 진행합니다.스트림 획득 팝업 버튼을 클릭하여 열고 원하는 동영상 획득 파라미터를 설정하십시오. SCI five CF six 40 R 필터를 사용하여 150 프레임을 획득하십시오. 이미지를 하드 드라이브에 저장하십시오.여기 제시된 이미지는 3' UTR에 96회의 탠덤 반복 서열 또는 RBMB 결합 부위의 4회 탠덤 반복 서열을 포함하는 RNA를 안정적으로 발현하는 HT 10 80 세포의 대표 이미지입니다. mbs를 세포 내로 전달한 후의 모습입니다. 96회의 탠덤 반복 서열이 존재함으로써 개별 RNA 전사체가 밝은 형광 점으로 나타나게 됩니다.이와 대조적으로, 4개의 탠덤 반복 서열만을 포함하는 RNA는 매우 희미한 형광 점으로 나타나며, 배경 신호가 매우 낮은 영역에서만 검출 가능한 경우가 많습니다. 스트리밍 이미지를 획득하면 개별 RNA 전사체를 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 브라운 운동 또는 하확산 운동을 하는 세포의 세포질과 핵 내에서 개별 RNA 전사체를 쉽게 관찰할 수 있습니다.드문 경우지만, 지향성 수송(directed transport)을 거치는 RNA가 여기에서 보이는 것과 같이 관찰됩니다. 지향성 수송을 거치는 RNA 전사체는 일반적으로 직선 경로를 따라 빠르게 이동합니다. 이 몽타주에서는 시계열의 단일 프레임 위에 RNA 전사체의 궤적이 겹쳐져 표시되어 있습니다.지향성 RNA 이동은 미세소관 및 미세필라멘트를 따른 RNA 수송과 일치합니다. 이 영상을 시청한 후, 분자 비콘을 이용하여 RNA 메트릭을 준비하고 정제하는 방법, 마이크로인젝션을 통해 세포 내로 분자 비콘 RNA 메트릭을 전달하는 방법, 그리고 형광 현미경으로 단일 RNA 전사체를 이미지화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

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우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데...

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

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단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

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단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

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비드 로딩은 단백질, 플라스미드 및 입자를 부착 된 포유류 세포로 소개합니다. 이 셀 로딩 기술은 저렴하고 빠르며 세포 건강에 실질적으로 영향을 미치지 않습니다. 그것은 살아있는 세포 화상 진찰에 가장 적합합니다.

구슬로 단백질과 핵산을 부착된 인간 세포로

이 프로토콜은 단일 분자 감도를 가진 DNA 이중 가닥 브레이크에서 전사를 검출하기 위하여 새로운 기자 유전자 시스템 및 실험적인 설치를 제시합니다.

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이 프로토콜의 목표는 시험관 내에서, 생체 포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 재현 가능한 RNA 영상 워크플로우를 위해 Riboglow 프로브의 정량적 형광 수명 측정을 가능하게 하는 것입니다. 우리는 편향되지 않은 형광 수명 측정을 추출하기 위한 샘플 준비, 프로브 전달, 데이터 수집 및 정량적 분석 워크플로우를 개괄합니다.

생포유류 세포 및 3차원 세포 모델에서 형광 평생 영상 기초로 리보글로우 프로브를 시험 관 내에서 특성화하기

학습하세요 비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포에서 단일 RNA 전사체를 실시간 영상화하는 방법을. 형광 현미경으로 RNA 역학을 관찰하여 유전자 발현 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

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