비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 단일 RNA 전사체를 실시간으로 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 분자 비콘에 의한 비율 메트릭으로 알려진 헤어핀 형성 프로브를 형성하도록 설계된 두 개의 올리고뉴클레오티드를 혼성화하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 분자 비콘에 의한 비율 미터법을 정제하는 것입니다.

다음으로, 분자 비콘에 의한 비율 메트릭은 마이크로 포리온을 통해 엔지니어링된 RNA 표적을 발현하는 세포에 도입됩니다. 마지막 단계는 살아있는 세포 현미경 검사에 적합한 마이크로웰 플레이트로 세포를 보는 것입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사는 단일 세포 내에서 밝은 형광 반점으로 시각화된 개별 RNA 전사체의 움직임을 모니터링하는 데 사용됩니다.

이 기술의 주요 장점은 밝은 광안정성이 있고 배경에 높은 신호를 나타내는 합성 프로브를 사용하여 내인성 RNA를 이미징 할 수있는 가능성을 열어줍니다 튜브에 다음 시약을 혼합하여 분자 비콘 또는 RBM BS에 의한 비율 메트릭 준비를 시작합니다.Rbm B 20 마이크로 리터 Rbm B 30 마이크로 리터 1 개 10 x 인산염 완충액 6 마이크로 리터 2 개, 그리고 4 마이크로 리터의 DNA와 RNA는 물을 함유하지 않습니다. 이는 일반적으로 약 50건의 연구에 충분합니다.

혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 한편, UN 혼성화 RBM B 2 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 액체 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 분당 0.6ml의 유속으로 작동하는 주사기 펌프를 사용하여 약 4ml 베드 부피의 8ml 액체 크로마토그래피 컬럼에 75개의 프렙 등급 슈퍼 데크를 사용합니다.

모든 유체가 베드 부피에 들어가기 전에 약 50ml의 1 x 인산염 완충액으로 SUEx를 세척하고 평형을 이룹니다. 주사기 펌프를 중지하고 분리한 다음 남은 액체가 중력에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 다음으로, RBMB 혼합물을 크로마토그래피 컬럼에 로드합니다.

RBMB 샘플이 베드에 완전히 들어간 후 전체 샘플이 컬럼에 완전히 진입했는지 확인하기 위해 베드 상단에 250마이크로리터의 1 x 인산염 완충액을 천천히 추가합니다. 1개의 x phosphate buffer로 테두리까지 컬럼을 채웁니다. 상단을 닫고 주사기 펌프를 시작합니다.

주사기는 약 50ml의 XPBS로 채워져 있으며 분당 0.6ml의 유속으로 작동합니다. 일반적으로 RBMB 샘플은 프로브에 통합된 염료의 색상으로 인해 쉽게 시각화할 수 있습니다. RBMB가 컬럼 바닥에 가까워지면 마이크로 원심분리기 튜브당 2방울로 흐름을 수집합니다.

샘플 수집을 중지합니다. 마이크로 원심분리기 튜브 내의 시료 색상이 명확해지면 착색된 RBMB 시료가 들어 있는 튜브(일반적으로 5-6개의 튜브)를 결합하고 원심 필터 장치에 로드합니다. 10, 000 RCF에 20 분 동안 또는 원한 양까지 표본을 분리기

이 속도와 시간은 일반적으로 약 30마이크로리터의 최종 부피를 산출합니다. 이 프로토콜에서 인간 섬유육종 세포주는 3개의 프라임 UTR에서 RBMB 표적 서열의 96회 탠덤 반복으로 Q-F-P-R-N-A를 발현하도록 설계되었으며, 대조 세포주는 40 - 50% co 유창성 배양에서 T 25 플라스크에서 프로브 전달 플레이트 세포를 하루 전에 야생형 Q-F-P-R-N-A를 발현하도록 조작되었습니다. 1%의 펜 연쇄상구균과 10%의 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지를 가진 세포는 다음 날 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양합니다.

마이크로 por을 켜고 HT 10 80 셀에 최적화된 마이크로 포트 매개변수를 설정합니다. 마이크로 포리온 튜브에 4ml의 전해 완충액을 채우고 마이크로 준비 스테이션에 놓습니다. 정제된 RBMB의 스톡 샘플을 해동하고 1개의 x 인산염 완충액을 사용하여 몇 마이크로리터를 최종 농도인 12마이크로몰로 희석합니다.

각 마이크로 포리온에는 1마이크로리터가 필요합니다. 각 마이크로 포리온 반응에 대해 FBS가 있는 1ml의 배양 배지를 항생제 없이 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 마이크로 포리온 장치 근처에 보관하십시오.

나중에 마이크로 제제 직후 세포를 현탁시키는 데 사용됩니다. 항생제는 미량 전제 후 세포 생존력을 감소시키기 때문에 사용되지 않습니다. 전날 도금된 엔지니어링된 HT 10 80 셀은 이제 60-80% 융합이 되어야 합니다.

세포 배양 배지를 제거하고 1ml의 칼슘 및 무마그네슘 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 1ml의 트립신으로 1-2분 동안 배양합니다. 항생제를 사용하지 않은 10%소 태아 혈청과 페놀 레드가 보충된 DMEM 배지 1ml를 첨가하여 트립신을 중지하고 세포를 두 개의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 세포를 200배 G로 5분 동안 스핀다운합니다.

상등액을 제거하고 재현탁액을 제거하고 세포 펠릿을 1ml DPBS의 최종 부피로 결합합니다. 세포를 세기 위하여 잘 섞인 세포 현탁액에서 10 마이크로리터를 제거하고, 잘 이산된다는 것을 확인하기 위하여 세포를 여기저기 피펫으로 바르고 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 DPBS를 가진 300의 000의 세포를 옮깁니다. 200배 G로 5분 동안 스핀다운합니다.

세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 제거합니다. 11마이크로리터의 Resus 현탁액, 완충액 및 피펫에 펠릿을 여러 번 재현탁하여 세포가 잘 분산되도록 합니다. 기포가 발생하지 않도록 하십시오.

희석된 RBMB 1마이크로리터를 넣고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 다시 말하지만, 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 기포는 마이크로 작동 중에 스파크를 일으켜 RBMB 전달 불량 및 세포 사멸을 초래할 수 있으므로 RBMB 판매 중단에 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다.

마이크로 준비 피펫을 사용하여 RBMB 셀 혼합물 10마이크로리터를 흡입하고 피펫을 마이크로 준비 튜브에 삽입합니다. 시작 버튼을 눌러 마이크로 코퍼레이션을 시작하십시오. 마이크로 por의 화면이 완료를 표시할 때 팁에 보이는 기포가 없어야 합니다.

스테이션에서 피펫을 제거하고 10마이크로리터 혼합물을 FBS가 있는 1밀리리터의 배양 배지가 들어 있는 미리 준비된 마이크로 원심분리 튜브로 배출하되 튜브를 좌우로 여러 번 흔들어 부드럽게 혼합하지 않습니다. 5분 동안 200배 G로 세포를 회전시킵니다. FBS가 있는 1ml의 페놀 레드 유리 배양 배지에서 세포를 두 번 세척하되 세포로 전달되지 않은 rbm BS를 제거하기 위해 항생제를 사용하지 않습니다.

두 번째 세척 후. Resus는 FBS가 있는 400마이크로리터의 페놀 레드 유리 배양 배지에 세포를 현탁시키지만 항생제는 사용하지 않습니다. 마이크로 비례 배분된 세포를 이전에 준비된 폴리 드 라이신으로 코팅된 8개의 웰 챔버 커버 유리에 웰당 200마이크로리터 또는 원하는 co-fluency로 플레이트화합니다.

챔버 커버 유리를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이미징은 마이크로 전처리 후 30분 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 라이브 셀 스테이지 상단 배양 시스템을 켜고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 75%에 도달할 때까지 평형을 이룹니다.

현미경과 형광등을 켜고 변형 이미지 획득 소프트웨어를 엽니다. 대물렌즈에 이머살 오일을 바르십시오. 미세 기공 세포가 있는 챔버 커버 유리를 살아 있는 세포 단계로 옮깁니다.

최고의 배양 시스템. 온도와 이산화탄소 수치가 안정될 때까지 스테이지 상단 시스템을 배양합니다. metamorph 소프트웨어에서 획득 탭을 엽니다.

라이브 표시 버튼을 클릭하여 필드를 찾습니다. 백색광 아래에서 초점을 조정하고 라이브 중지 버튼을 클릭합니다. 획득 탭 아래.

스트림 획득 팝업 버튼을 클릭하여 열고 원하는 동영상 획득 매개변수를 설정합니다. SCI five CF six 40 R 필터를 사용하여 150개의 프레임을 획득합니다. 이미지를 하드 드라이브에 저장합니다.

여기에 표시된 것은 96개의 탠덤 반복 또는 3개의 프라임 UTR에서 RBMB 결합 부위의 4개의 탠덤 반복으로 RNA를 안정적으로 발현하는 HT 10 80 세포의 대표적인 이미지입니다. mbs의 세포 내 전달 후. 96개의 탠덤 반복이 존재하면 개별 RNA 전사체가 밝은 형광 반점으로 나타날 수 있습니다.

대조적으로, 4개의 탠덤 반복만 포함하는 RNA는 매우 어두운 형광 반점으로 나타나며 종종 예외적으로 낮은 배경 영역에서만 검출할 수 있습니다. 스트리밍 이미지를 획득하면 개별 RNA 전사체를 실시간으로 이미지화할 수 있습니다. 개별 RNA 전사체는 갈색 또는 하위 확산 운동을 겪는 세포의 세포질과 핵 내에서 쉽게 볼 수 있습니다.

드문 경우지만, 지시된 수송을 진행하는 RNA가 여기에 표시된 것처럼 관찰될 것입니다. 유도 수송을 거치는 RNA 전사체는 일반적으로 직선 경로를 따라 빠르게 이동합니다. 이 몽타주에서 RNA 전사체의 궤적은 시계열의 단일 프레임에 겹쳐진 것으로 표시됩니다.

유도된 RNA 이동은 미세소관 및 미세 필라멘트를 따라 RNA가 이동하는 것과 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분자 비콘으로 인종 메트릭을 준비하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 마이크로 파리온을 통해 분자 비콘을 통해 세포에 인종 미터법을 전달하고 형광 현미경으로 단일 RNA 전사체를 이미지화합니다.