Name: 형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 학습하세요 형질 전환 쥐를 이용한 남성 생식 세포 돌연변이 정량화 방법입니다. 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발 물질에 노출된 수컷 생식 세포에서 유도된 돌연변이 빈도를 측정하는 효율적인 실험 기법을 익히세요.

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이 연구는 캐나다 생명공학 규제 시스템(CRSB) 및 화학물질 관리 계획(CMP) 이니셔티브의 지원을 받았습니다.

동물 사육, 유지 보수 및 처리를 포함한 모든 프로토콜은 건강 캐나다의 동물 보호위원회에 의해 승인되었다. 1 동물 노출 <ol><li> 무작위로 선택된 관리 시간에 대한 적절한 노출 경로로 시험 화합물 및 관련 제어 그룹 및 치료 그룹 (최소 그룹 당 = 5) .Treat 마우스를 제어하는​​ (8~12주 이전) 형질 전환 수컷 마우스를 배포 할 수 있습니다. 관심 정자 세포 형 (도 3)에 따라 적절한 샘플링 시간을 선택. </li><li> 샘플링 시간 후, 이소 플루오 란 마취하에 자궁 경부 전위 (또는 다른 적절한 방법)에 의해 쥐를 안락사. 조심스럽게 마미의 epididymides을 복부 또는 음낭 절개에서 고환을 그리고 절제. (그림 4, 부고환 컬렉션의 상세한 영상을 볼 Duselis 등. 24 볼). 정소 세관을 분석하는 경우에 대안 적으로, 고환 수집의 세포. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 액체 질소 저장에 냉동. </li></ol> 2 분리 및 소화 카우 정자의 <ol><li> 얼음 카우 부고환을 제상. 페트리 접시에 해동 카우를 전송하고 철저하게 메스 나 면도기 블레이드 말하다. </li><li> 페트리 접시에 실온 D-PBS 700 μl를 추가합니다. 그리기 및 D-PBS 정자 (약 10 배) 흐린 될 때까지 정지를 해제하여 카우에서 와이드 보어 1000 μL 피펫 팁, 릴리스 정자를 사용. 참고 : 넓은 구멍 피펫 팁을 준비하려면 플라스틱 피펫 팁의 끝에서 2-3mm를 잘라. </li><li> 1.5 ml의 신선한 관에 스테인레스 메쉬 필터를 통해 필터 현탁액. D-PBS의 추가 700 μL와 페트리 접시를 씻고 메쉬 필터를 통해 동일한 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 얼음에 튜브를 놓고 메쉬를 제거합니다. </li><li> 반복하여 나머지 샘플에 대한 2.1-2.3 단계를 반복합니다. </li><li> 3 분 동안 11,000 XG samplesat 스핀. 조심스럽게 캔트 상층. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 1.0 ml의 차가운 1X 식염수 구연산 나트륨 (SSC)를 추가합니다. 펠렛까지 소용돌이를 완전히 다시 일시 중단됩니다. 이것은 때때로 소용돌이로 교반 몇 차례를 취할 것입니다. </li><li> 10 % SDS의 15 μl를 추가합니다. 반전 / 비 정자 세포를 파괴하기 위해 30 초 동안 흔들어. 너무 부드럽게 흔들리는 것은 불충분 중단 될 것이며, 펠릿은 다음 단계에서 제대로 형성되지 않습니다. </li><li> 2 분 동안 11,000 XG에 스핀. 이른바 &quot;무성&quot;펠릿 부족 단계 2.7에서 진탕 체세포 분열 불완전한 나타낸다. 이 경우, 단순히 다시 샘플을 흔들어 꽉 펠릿이 형성 될 때까지 리 스핀. 조심스럽게 상층 액을 가만히 따르다. 펠렛을 방해하지 마십시오. 간단히 다시 회전 및 200 ㎕를 피펫으로 남아있는 상층 액을 제거합니다. </li><li> 펠릿을 재현 탁 할 때까지 940 μL의 0.2 배 차가운 SSC와 소용돌이를 추가합니다. 이 펠릿을 다시 중단하기가 매우 어려울 수 있습니다 및 볼텍스를 몇 차례 걸릴 수 있습니다. S의 경우에 덩어리파마는 피할 수 있습니다. </li><li> 120 μL의 β-머 캅토 에탄올, 100 ㎕의 10 % SDS, 20 ㎕의 0.5M EDTA, pH가 8, 20 μL의 단백질 분해 효소 K을 (60 밀리그램 / ㎖, 신선한 준비)를 추가합니다. 잘 혼합하고 37 ° C에서 회전 하룻밤 소화. 페놀 / 클로로포름 추출을 진행합니다. </li></ol> 카우 정자에서 DNA의 3 페놀 / 클로로포름 추출 참고 : 후기의 정자 성숙 정자의 핵 DNA는 프로타민 착화되고, 높은 체세포의 DNA에 비해 응축되어 있기 때문에, 기존의 핵산 분리 방법은 돌연변이 분석이 작동하기에 충분한 수율과 고순도의 DNA를 생성하지 않습니다 효율적. 공격적인 소화 후 여러 페놀 - 클로로포름 추출을 해제하고 (15에서 방법에 따라) 정자 DNA를 정화해야합니다. <ol><li> 전송 정자 세포는 15 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브에 다이제스트. </li><li> 혼합물을 클로로포름 : 페놀 2 ㎖ (1 : 1). 22 rpm에서 튜브를 회전3 분. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 퍼지 인터페이스 계층과 함께 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 반복 3.1.2과 3.1.3 배, 그러나 각각 3 분, 4 분, 6 분,로 회전 시간을 변경하는 단계를 반복합니다. 최종 반복에서, &quot;퍼지&quot;계면 층 중 하나를 전송하는 피. </li><li> 이소 아밀 알코올 (24 : 1) 네 번째 추출 후, 3M NaAc, pH가 5.2 일 당 수성 추출물 ml의 클로로포름 2 ㎖의 70 μl를 추가합니다. 12 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 무수 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 부드럽게 부드러운 락과의 측면에 튜브를 회전하여 DNA를 침전. </li><li> 열 밀봉 목초지 피펫의 팁에 감아 DNA를 수집합니다. 5 분 동안 70 % 에탄올 및 공기 건조에 피펫 팁을 소용돌이에 의해 DNA를 씻어. </li><li> 100 ㎕의 트라이 - 추출 후 40 DNA 침전물을 용해S-EDTA 버퍼, pH를 4 ° C에서 8 점. DNA는 lacZ의 돌연변이 분석을 진행하기 전에 이일 최소 4 ° C에서 용해 할 수 있습니다. 용해도 문제가 발생하면, DNA가 더 사용하기 전에 15 분 동안 65 ° C에서 용해 될 수있다. 260에 spectrophotometre와 DNA의 농도를 결정하고 용해 된 DNA의 농도가 200-2,000 NG / μL 사이에 있는지 확인합니다. </li></ol> 정 세관에서 생식 세포 (4) 분리 및 소화 <ol><li> 동결시, 얼음 (약 1 시간)를 고환을 해동. 전송 그라운드 유리판 정소. </li><li> 포셉 한 쌍의 고환의 한쪽 끝을 잡고. 고환의 타단에, 또 한 쌍의 집게 나 해부 가위 (도 5a)를 사용하여 상피 캡슐에 구멍을 천공. 구멍을 통해 정 세관을 쥐고 상피 캡슐 (그림 5B)를 폐기합니다. </li><li>DD 디 캡슐화 정 세관에 실온 D-PBS 500 μL. </li><li> 각도 티슈 롤러되도록 일단이 5-10 ° (도 5c)의 대략적인 각도 플레이트와 접촉하는 (실리콘 고무 밀접 자유롭게 회전 5mm 직경의 스테인레스 스틸 튜브, 또는 유사한 장치 위에 장착). 어떤 압력을 적용하지 않고, 부드럽게 그들이 평평하게 될 때까지 세관에 걸쳐 앞뒤로 롤러를 이동하고 D-PBS 출시 세포 (약 5-10x) 흐린된다. </li><li> 몇 번 더 추가 세관을 통해 D-PBS의 또 다른 500 μl를 추가하고 부드럽게 세관 롤오버. </li><li> 전송되는 분리 세뇨관의 양 (도 5D)를 최소화하면서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 를 반복하여 필요한 경우 더 많은 세포를 수집 4.5-4.6 단계를 반복합니다. </li><li> 어떤 실수로 수집 된 세관은 튜브의 바닥에 정착 할 두 분 - 1을 허용합니다. FR에 D-PBS로 이동정착 세관 (D-PBS의 약 100 μL)을 남겨두고 1.5 ml의 튜브를 환경 안전 보건. 이 현탁액의 분취 액 적은 세포 집단의 조성물을 평가하기 위해 현미경 (위상차)에서 확인할 수있다. </li><li> 30 초 동안 11,000 XG에서 세포를 스핀 다운. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 가만히 따르다. 필요한 경우 세포 펠렛이 시점에서 -80 ° C에서 냉동 될 수있다. </li><li> 필요한 경우 세포를 해동. 용해 완충액 5 ㎖에 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 resuspend 세포로 전송 (10 mM 트리스 pH가 7.6, 10 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨, 1 ㎎ / ㎖ 프로 티나 제 K, 1 % SDS). 하룻밤 회전 배양기에서 37 ° C에서 다이제스트. </li><li> 페놀 / 클로로포름 추출을 진행합니다. </li></ol> 정액을 운반하는 Tubule 생식 세포에서 5 페놀 DNA의 / 클로로포름 추출 참고 : 덜 공격적 추출 이러한 종류의 세포는 아직 N을 통해 진행되는 형식을 갖고 있지 않기 때문에, 정 세관의 생식 세포 DNA를 분리하는 데 사용됩니다uclear 응축. <ol><li> 클로로포름 혼합물 (1 : 1)에 하룻밤 정 세관 세포 소화 페놀의 5 ML을 추가합니다. 20 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 를 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ㎖의 튜브에, &quot;퍼지&quot;계면 층을 피하면서, 수성 최상부 층을 옮긴다. </li><li> 5 mL의 수성 추출물을 5 M의 NaCl 100 μl를 추가합니다 (보통 5 ㎖를 복구) </li><li> isoamylalcohol 클로로포름 5 ㎖에 추가 (24 : 1). 12 분 동안 22 rpm에서 튜브를 회전합니다. </li><li> 10 분 동안 1,600 XG에 원심 분리기와 신선한 15 ML 튜브에 수성 상위 계층을 전송합니다. </li><li> 무수 에탄올이 첨가 볼륨을 부드럽게 회전 튜브를 반전시킴으로써 DNA를 침전. </li><li> 밀봉 목초지 피펫의 팁에 감아 DNA를 수집합니다. 5 분 동안 70 % 에탄올 및 공기 건조에 피펫 팁을 소용돌이에 의해 DNA를 씻어. </li><li> 40-100 ㎕의 트리스-EDTA 버퍼, pH를 4 ° C에서 8 스토어에서 DNA를 녹인다. DNA는이 최소 4 ° C에서 용해 할 수 있도록 허용일 lacZ의 돌연변이 분석을 진행하기 전에 (단계 3.9 참조). 용해도 문제가 발생하면, DNA가 더 사용하기 전에 15 분 동안 65 ° C에서 용해 될 수있다. 260에 spectrophotometre와 DNA의 농도를 확인하고 농도가 200와 2000 NG / μL 사이에 있는지 확인합니다. </li></ol> 6 LacZ를 돌연변이 분석 세균 또는 진균의 오염은 패키징 효율뿐만 아니라, 플라크의 성장을 방해하고 채점 할 수있다. 그것은 장비 반응, 호스트 배양 및 성장 매체의 오염을 방지하기위한 적절한 조치를 이용한 무균 lacZ의 분석을 수행하는 것이 중요하다. <ol><li> 일 분석하기 전에 : 아래 한천 및 숙박 문화를 준비 <ol><li> 여덟 판 각각 샘플 당 필요한 한천 8 ㎖의 바닥을 포함 (4 판 역가를 계산, 4 판을 돌연변이 점수) (즉., 64 ㎖의 샘플 당). 바닥 한천은 모두 동일합니다돌연변이 및 역가 카운트 접시. 샘플의 수는 처리되는 충분한 하부 한천을 준비한다. 무균는 90mm 배양 접시 (접시 당 8 ㎖)에 부어 한천이 응고 할 수 있습니다. NOTE : 하부 한천 플레이트를 사전에 일주까지 제조 할 수있다. </li><li> 50 ML 튜브에 10 ㎖의 LB 배지, 20 % 맥아당 용액 100 μL, 25 μL의 암피실린 (20 ㎎ / ㎖) 20 ㎕를 카나마이신 (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. E. 접종 대장균 (lacZ의 - / 게일 -) 25, 240 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤 성장한다. </li></ol></li><li> 1 일 : 하위 문화 셀 <ol><li> 신선한 LB (항생제)에서 하룻밤 문화의 백 희석 : 일을 준비하여 하위 세포를 배양. 하위 문화의 8 ML의 볼륨은 샘플 당 필요합니다. OD 600 = 1 때까지 약 3.5 시간 동안 240 rpm으로 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> 때 OD 600 = 1, 10을 15 ° C에서 1,300 XG에 분할 세포 50 ML 튜브에 균일하게 서스펜션과 원심 분리기분. 상층 액을 제거하고 (예., 샘플 당 4 ml)에 LB의 10 mM의 황산이 포함 된 원래 볼륨의 절반에 세포를 일시 중지 재. [단계 6.2.4.3]을 필요할 때까지 옆으로 세포를 넣습니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 람다 파지 입자에 DNA를 포장 <ol><li> 30 ° C에 물을 욕조를 따뜻하게. </li><li> 와이드 보어 10 μL 피펫 팁, 1.5 ML 튜브로 전송 4 μL의 DNA를 사용하여. 주 :이 단계는 준비 시간을 줄이기 위해 사전에 하루 이상을 행할 수있다. </li><li> 파지 포장 추출 키트에서 제 1 튜브 (적색) (모든이 샘플에 대한 1 관)를 따뜻하게. 간단히 튜브의 하단에있는 추출물을 수집하는 스핀. </li><li> DNA 샘플에 대한 첫 번째 관에서 포장 추출물의 4.8 μl를 전송하고 피펫 팁과 부드러운 교반 혼합한다. 간단히 튜브 샘플을 스핀 다운. 30 ° C의 물을 욕조에 1.5 시간 동안 품어. </li><li> 초 (파란색) 포장 추출 튜브 (~ 15 샘플에 대한 1 관)를 따뜻하게. 간단히 하단의 추출물을 수집하는 스핀관. </li><li> DNA 샘플의 두 번째 튜브에서 포장 추출물의 4.8 μl를 전송하고 부드러운 교반 혼합한다. 간단히 튜브 샘플을 스핀 다운. 30 ° C의 물을 욕조에 추가로 1.5 시간 동안 품어. </li><li> 500 μL의 SM 완충액에 패키지 파지 입자를 일시 중지하고 다시 20 rpm으로 30 분 동안 회전하여 혼합한다. </li><li> 튜브의 하단에 샘플을 수집하기 위해 30 초 동안 11,000 XG에 잠시 소용돌이 샘플 및 원심 분리기를 회전 한 후. 파지 입자는 감염 [단계 6.2.4]에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 최고 한천을 준비 <ol><li> 역가 판과 돌연변이 선택 플레이트에 대해 별도의 최고 한천을 준비합니다. 각 샘플은 4 역가 플레이트, 4 돌연변이 판을 필요로한다. 각 판은 8 ml의 최고 한천이 필요합니다. 만 한천 돌연변이 선택 가기 선택제 페닐-β-D-갈 락토 피 (P-갈)를 추가합니다. 모두 최고 한천 사전에 (분석의 일)를 준비하고 모두 최고 한천에 황산을 추가하기 전에 50 ° C로 유지하고, PG알은 선택 한천의 돌연변이입니다. </li></ol></li><li> 1 일 : 포장 된 파지 및 도금에 감염 세포 <ol><li> 샘플 당이 50 ml의 튜브 레이블 : 샘플 당 한 &quot;돌연변이&quot;튜브 및 샘플 당 1 &quot;역가&quot;관 </li><li> 샘플 당 4 &quot;돌연변이&quot;접시와 샘플 당 4 &quot;역가&quot;판 : 샘플 당 판 한천 라벨 8 </li><li> 나누어지는 각 튜브 [단계 6.2.1.2에서] 현탁 세포 2 ㎖. </li><li> 에 &quot;돌연변이&quot;50 ML 튜브 (포함하는 셀) [단계 6.2.2.8에서] 포장 파지 입자의 500 μl를 추가합니다. 조심스럽게 혼합하여 파지 입자를 실온에서 30 분 동안 세포를 감염시킬 수있다. </li><li> 30 분 후, 잠시 소용돌이가 세포를 감염 (세포를 포함하는) 적절한 50ml의 &quot;역가&quot;튜브에 감염된 세포의 15 μl를 전송합니다. </li><li> 판 역가 샘플에, 따뜻한 (50 ° C) &quot;역가&quot;최고 한천 (포함하지 않는 P-갈)을 &quot;역가&quot;50 ML 튜브의 30 ML을 추가합니다. 즉시 DISTRIB4 &quot;역가&quot;한천 플레이트 사이 UTE / 세포 혼합액 (~ 플레이트 당 8 mL)을 첨가 하였다. 상단 한천은 피펫에 냉각 및 공기 방울을 소개하지 않는 시도를하지 않도록 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 다음 &quot;돌연변이&quot;샘플 플레이트. P-갈이 &quot;돌연변이 선택&quot;최고 한천에 추가되어 있는지 확인합니다. 따뜻한 &quot;돌연변이 선택&quot;한천 (포함하는 P-갈)을 &quot;돌연변이&quot;50 ML 튜브의 30 ML을 추가합니다. 즉시 (~ 접시 당 8 ㎖) 4 &quot;돌연변이&quot;판 사이 한천 / 세포 혼합물을 배포 할 수 있습니다. </li><li> 판 다음 (~ 15 분) 강화 반전 밤새 37 ° C에서 배양 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 주 2 : 계산 플라크 <ol><li> 밤새 배양 한 후에, 돌연변이 및 역가 플레이트에 플라크의 수를 계산. 플라크 다수 들어, 전체 개수를 추정하기 위해 판의 부분만을 카운트 (예. 종종 ¼ 타이 터 플레이트의 사이 100-200 플라크있을 것이다). 100 플라크의 최소 때를 기를 접시 당 계산해야한다플레이트 부 nting. </li><li> 세포의 μL 당 플라크 형성 단위 (PFUs)의 수를 계산합니다. 이 도금 셀 체적 (15 μL)에 의해 &quot;역가&quot;플레이트에 플라크의 개수를 나눔으로써 수행된다. </li><li> / μL &quot;돌연변이&quot;판 (PFUs / μL의 *의에 도금 감염된 세포의 총 부피에 PFUs의 총 수를 추정하기 PFUs의 수를 사용하여 [2 ㎖의 세포 + 0.5 ㎖의 패키지 파지 입자 - 역가 플레이트 15 μl를] ). </li><li> &quot;역가&quot;플레이트로부터 결정 감염된 세포의 총 부피에 PFUs의 예상 총 개수에 의해 4 &quot;돌연변이&quot;플레이트에 플라크 카운트 돌연변이의 전체 수를 나누어 MF 견적. </li></ol></li><li> 그것은 MutaMouse 배아 세포, OECD 가이드 라인은 동물 수 스크린 당 125,000 ~ 300,000 비 돌연변이 PFUs 최소 권장으로서 자발 lacZ의 MF는 대조군의 3 × 10-5의 순서로되면안정적인 기준 신호를 얻기 위해 돌연변이 ED. 기타 형질 전환 모델은 PFUs 더 많은 수의이 필요할 수 있는데,이 경우에 낮은 자연 MF가있을 수 있습니다. 통계적 전력 시험 원하는 해상도를 얻기 위해 필요한 PFUs 동물의 최소 수를 결정하기 위해 수행 될 수있다. 다중 반복 실험의 데이터는,이 최소 PFU 요구 사항을 충족시키기 풀링들은 상당히 상이한 돌연변이 주파수를 생성하지 않는 제공 될 수있다. </li></ol> (7) 통계 분석을위한 실험 장치는 마우스이다. 이 분석에서 생성 된 데이터는 일반적으로 정규 분포되지 않습니다. 이와 같이, 데이터의 분포 특성에 기초하여 분석을위한 통계적 방법을 선택한다. NOTE : 적절한 데이터 변환 observa의 범위에 걸쳐 응답의 분산을 동등하게 적용되는 경우 기본 파라 메트릭 분석 (. 예 ANOVA)을 채용 할 수있다기. 푸 아송 또는 이항 회귀 분석은 종종 더 적합합니다. 비모수 분석이 또한 사용될 수있다. 우리는 일상적으로 일반화 된 선형 모델 절차를 사용하여 포아송 회귀 분석을 사용 (예., 시저 GENMOD) 르뮤 등 (26)에 의해 설명 된대로 SAS의 v.9.2에서 (SAS 연구소, 캐리, NC).

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

전통적인 방법에 비해 TGR 생식 세포 돌연변이 분석은 생체 생식 세포 돌연변이 유도 정량화보다 빠르고 경제적, 더욱 민감한 방법을 제공한다. 자손, 동물의 수는 대조적으로, 정자 직접 트랜스 MF를 평가함으로써, 시간 및 단일 화합물의 생식 계열 돌연변이를 평가하는 데 필요한 자원이 크게 감소된다. 감도의 관점에서, 우리는 투여 그룹당 5 동물을 사용하여 25 밀리그램 / kg의 ENU 노출 다음 정조 세포 줄기 세포에서 상당한 MF 2.6 배 증가를 검출 할 수 있었다. 반면, 특정 궤적 분석은 사용이 동일 투여 MF에 중대한 변화&gt; 노출 된 그룹의 3000 마우스와&gt; 500,000 제어 마우스 (28)를 감지 할 수 없습니다. 두 기작 및 규제 조사에 대한 적합성에 추가하여,이 방법은 체세포와 생식 라인 mutati 간 비교 연구를위한 기회를 제공한다오늘. 최근의 증거는 체세포 돌연변이에 필요한 것보다 일부 에이전트에 대한 생식 세포 돌연변이가 낮은 농도로 유도 될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, N-hydroxymethylacrylamide에 장시간 노출되면, 음식 발암 아크릴 아미드 (12)의 대사 산물, 적혈구 소핵 주파수 체세포 염색체 손상 (13)의 기존의 측정 값에 영향을 미치지 않고 생쥐에서 지배적 치명적인 생식 세포 돌연변이의 빈도를 증가시킨다. 또한, 혈액 소핵 주파수 14 증가하지 않는 용량에서 정자의 탠덤 반복 DNA 유전자 좌에서 모두 주류 및 사이드 스트림 담배 연기 원인 높은 돌연변이 주파수에 마우스의 노출. 이러한 결과는 체세포 유전자 독성 시험은 항상 생식선의 보호적인 가정에 도전하고 생식 세포 돌연변이 빈도를 정량화하기위한보다 효율적이고 비용 효과적인 방법에 대한 요구를 강화한다. 그러나, 우선 생식 세포 변이원성에 대한 증거는 아직 약하다대체로 인한 체세포 및 생식 세포 조직에서 돌연변이율을 비교 가능한 데이터의 부족. TGR 돌연변이 분석은 병렬 테스팅과 같은 형질 전환 유전자를 이용하여 여러 조직에서 유도 된 돌연변이의 비율의 비교를 허용한다. 따라서, 비교 돌연변이는 생식 세포 특수한 효과의 가능성을 둘러싼 데이터 차이를 보충하는 데 유용한 TGR 분석법을 사용하여 테스트. 테스트에 대한 규제 체세포 및 생식 세포 돌연변이의 동시 평가는 또한 필요한 동물의 수를 줄여 효율을 향상시킬 것이다. 체세포 돌연변이에 대한 OECD 가이드 라인은 삼일 샘플링 시간 (3 + 28) 다음 이십팔일 관리 시간을 권장합니다. 이 정자의 spermatocyte 및 spermatid 단계 (그림 3) 중 대부분 노출 된 세포를 대상으로하기 때문에 카우 정자의 분석은,이 시점에서 가난한 감도를 제공 할 수 있습니다. 이 단계의 세포는 DNA를 합성하고 점진적으로 DNA 수리 (6)에 대한 능력을 잃지 않는 &lt;/ SUP&gt;. 또한,이 시점에서 샘플링 카우 정자 정조 세포는 줄기 세포에서 일어나는 돌연변이를 발견하지 못할 것이다. 따라서, 28 + 3 디자인에 통합, OECD 가이드 라인은 정 세관에서 생식 세포를 수집하는 것이 좋습니다. 이 혼합 인구는 DN​​A 합성과 줄기 세포를 포함한 수리 능숙 세포 유형으로부터 유래 된 세포를 포함하고, 정자 형성 단계의 대부분에 걸쳐 노출되어있다. 그러나, 이들 세포의 혼합 특성상, 정 세관 세포 분석은 위상 관련 정보를 제공하지 않는다. 또한, 비 - 표적 세포의 존재가 관찰 MF에 영향을 미칠 수 있다는 우려가있다 (예 인해 DNA 복구 결손 생식 세포에서 돌연변이 된 생식 세포 신호의 변이 된 체세포의 오염, 또는 희석에 가양 생식 세포 돌연변이 호출) . 현재 체결 부족한 데이터가 있는지 여부 28 + 세 제공하는 동일한 민감도와 특이도에서 정 세관 세포의 결과나중 시점에서 S의 카우 정자. 우리 연구소는 현재이 점을 해결하기 위해 다양한 샘플링 시간 후 수집 된 정 세관 세포와 마미 정자에서 유도 MFS을 비교한다. 우리는 OECD 가이드 라인은 또한 생식 세포 분석에 적합 할 수있는 간 천천히 나누어 조직에 대한 이십팔일의 다른 샘플링 시간을 알 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이용 가능한 데이터는 여전히 불충분하고, 우리는 체세포 규제 테스트 TGR 돌연변이 분석을 이용한 생식 세포의 동시 분석에 대한 한 번의 실험 설계를 추천 현재 없습니다. 주목해야이 분석의 하나의 특성은 돌연변이 사건이 아닌 뮤린 트랜스에 평가된다는 점이다. 그러나, 도입 유전자가 내생 유전자 20과 유사한 방식으로 환경 돌연변이에 응답하는 것을 제안 할 수있는 충분한 증거가있다. 또한, 독립적 인 돌연변이 때문에 이벤트의 정확한 기원하기 어려운해결 한 결과는 일반적으로 (a 돌연변이 빈도에 대비하여) 돌연변이 빈도로보고되어있다. 결과는 DNA 염기 서열에 의해 (유전자 돌연변이의 관측 주파수에 기여할 수있는 하나의 돌연변이 세포의 예. 분열과 곱셈) 클론 확장을 수정하는 경우 실제 돌연변이 주파수는 해결할 수 있습니다. 이것은 시간과 비용의 분석에 크게 추가하더라도 돌연변이 유전자의 염기 서열은 lacZ의 돌연변이를 특성화하고, 클론 확장 이벤트로부터 유도 될 수있다 돌연변이를 확인하기 위해 수행 될 수있다. 짧은 (294 3,021 염기쌍의 lacZ VS BP,도 1) 및 29 서열 쉽다 λ의 CII 유전자의 변이체의 lacZ 유전자 외에도 theλgt10 형질 전환 벡터는 다른 온도에 따라 돌연변이 리포터 유전자를 항구. 시퀀싱 또한 mutatio에 대한 통찰력을 제공 유도 돌연변이 스펙트럼의 분석을 허용당해 화합물의 NAL기구. 클론 확장의 극단적 인 예는 &quot;대성공&quot;돌연변이의 발생 (즉., 형질 전환 유전자 극적으로 상승 MF에 기여하는 기관의 발전의 초기 단계에서 돌연변이, 때로는 수백 배경보다 수천 배까지). &quot;잭팟&quot;돌연변이 동물 또는 조직 분석에서 제거해야합니다. 우리가 기술 한 분석은 (20에서 검토) 유사한 돌연변이 기자 벡터 항구 모두 BigBlue 마우스와 쥐, 그리고 lacZ의 플라스미드 마우스와 같은 다른 TGR 모델에 광범위하게 적용 할 수있다. 유사한 방법을 사용 날짜에 실시 생식 세포 연구의 대부분은 ENU와 (30에서 검토) 방사선 거의 독점적에 잘 특징 돌연변이를 초점을 맞추고있다. 이 TGR 분석에 대한 OECD 테스트 가이드 라인의 최근 발표와 함께이 분석 될 것으로 예상된다화학 물질 심사 및 규제 평​​가를 위해 점점 더 인기. 규제 시험 전지에 TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 혼입 생식 세포 (11)에 유도 된 돌연변이의 효율적인 평가를 허용함으로써 기존의 갭을 채울 것이다. 또한,이 분석은 동일한 유전 끝점 환경 에이전트 돌연변이 유도에 체세포 및 생식 세포의 상대 감도를 비교하기위한 적절한 수단을 제공하고, 거의 모든 조직에서 MF를 측정하는데 사용될 수있다.

생식 세포에서 산발적 인 DNA 변이는 감소 생식 성공으로 이어질 수 있고, 상속 된 경우 자손 1-3 암 유전 질환이나 높게 경향의 원인이 될 수 있습니다. 실질적인 증거 드 노보 돌연변이의 큰 비율 부계 생식선 4로부터 상속 함을 입증하고 자손 돌연변이 수가 긍정적 개념 5시 아버지 나이와 상관된다. 남성 돌연변이의 높은 비율은 성별과 배우자 형성시 연령의 차이의 결과로 여겨지고, 여성 생식계 2 oogenic 세포 분열의 수와 비교하여 정자 세포 분열의 더 큰 수와 DNA의 진보적 쇠퇴 남성의 연령 효율을 복구 할 수 있습니다. 이러한 모든 요인은 남성 생식 계열 6의 복제 에러 확률의 증가에 기여한다. 그러나 부계 노출의 영향 ENVIRO 할드 노보 돌연변이의 빈도에 nmental 요인은 불확실하다. 그럼에도 불구하고, 환경 다수의 에이전트가 설치류 7의 생식 세포 돌연변이를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들 제제의 일부는 인간 생식 세포계 8에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 장착되어있다. 이러한 우려에도 불구하고, 화학 물질에 일상적으로 규제 목적으로 체세포 돌연변이를 유도 할 수있는 능력을 테스트하고는 일반적으로 신체 검사가 생식 세포를 보호하기에 충분하다는 것을 가정한다. 따라서 화학 물질은 거의 생식 세포 돌연변이를 유도 할 수있는 능력에 대한 평가가 없습니다. 이유 중 하나는 생식 세포 변이원성 시험은 주로 규제 의사 결정 과정에서 생략 된 것은 실제적인 방법론의 부족이다. 이러한 지배적 인 9 치명적인 특정 궤적 (10) 검사와 같은 전통적인 설치류 기반의 방법은 배아 또는 자손에서 돌연변이 표현형을 득점하여 생식 세포 돌연변이 비율을 추정노출 부모. 이러한 분석법은 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 동물들, 시간 및 리소스를 매우 많은 수의 사용을 필요로한다. 생식 세포 돌연변이를 정량화하기위한 여러 방법들이 현대 최근 등장 하였지만, 많은 자신의 실용성, 효율성 및 생체 적합성의 관점에서 단점을 겪는다. 예를 들어, 확장 간단한 탠덤 반복 (ESTR) 유전자 좌에서 길이 변이를 반복하는 단일 분자 PCR 방법 (15)을 사용하여 남성 생식 세포 정량화 할 수있다. 그러나,이 방법의 실행은 기술적으로 어렵고 힘든 일 수 있으며, 점 돌연변이는 달리, 매우 불안정한 ESTR 궤적의 반복 길이의 변화와 건강 생물학적 중요성은 명확 16 남아있다. 유전성 돌연변이 4,17의 문제에 적용 할 때 도시 전체 게놈 시퀀싱 기술은 생물학적으로 의미있는 풍부한 데이터를 제공 할 수 있지만, 높은 비용, 높은 에러율은 연관된 유효성 필요돌연변이를 확인하고, 생물 정보학 문제는 여전히 규제 테스트 용량 (18)이 옵션의 일상적인 적용을 제한합니다. 여기서, 우리는 유전자 변형 수컷 쥐의 생식 세포에서 직접 유발 돌연변이를 정량화하기위한 실제적인 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 3 번 염색체 19 (도 1)의 두 복사본에 통합 대장균의 lacZ 리포터 유전자를 함유하는 재조합 λgt10 파아지 벡터의 다수의 사본을 가지고 연결된 형질 MutaMouse 모델에 대해 설명한다. 이 프로토콜은 또한 동일한 원칙 (BigBlue 마우스와 쥐, 또는 lacZ의 플라스미드 마우스, 등.) 또는 약간 다른 리포터 유전자 (GPT 델타 마우스와 쥐를 기반으로 다른 형질 전환 쥐 (TGR) 모델과 관련, TGR 모델은 램버트 등 검토 알. 20). 이 방법은 최근 발표에 설명 TGR 돌연변이 분석에 기초및 OECD 테스트 가이드 라인 (21)을 개정 우리는 때문에 정자의 고유 한 특성의 남성 생식 세포에 돌연변이의 평가를 수용하기 위해 필요한 특수 고려 사항에 자세히 설명. 간단히, 분석은 사전 돌연변이 병변이 안정 돌연변이로 고정 샘플링 시간 다음에 돌연변이 유발 물질 유전자 변형 수컷 생쥐를 노출 포함한다. 선택된 샘플링 시간에, 마우스를 안락사와 생식 세포가 카우의 부고환 또는 정 세관 하나에서 수집된다. 후술하는 바와 같이, 정자 형성의 서로 다른 단계에서의 돌연변이 유발 효과는 노광 및 샘플 수집 간격을 선택함으로써 결정될 수있다. 셀 당 λ 파지 게놈의 여러 복사본을 포함하는 형질 전환 인서트는, 생식 세포 게놈 DNA를 분리 한 후 E.를 감염하는 데 사용되는 감염성 λ 파지 입자를 만드는 빈 λ 파지의 캡시드로 포장되어 대장균 호스트. 감염된 박테리아는 SELEC에 재배야생형의 lacZ를 형질 세포의 lacZ의 돌연변이 된 복사본 벡터를 함유하는 세포를 구분할 수 TIVE 매체. 남성 생식 세포에 노출 돌연변이 유발 효과 (램버트 외. 20에서 검토도 2) 제어 및 처리 마우스 사이의 유전자 돌연변이의 빈도를 비교하여 결정된다. 세균 세포의 많은 수의 요구되는 동물의 수를 감소시키면서, 기존의 방법에 비해이 분석 우수한 감도를 제공 한 마우스에서 정량 할 수있다. 더 전문적인 장비 나 교육이 필요하지 않습니다 때문에,이 분석은 가장 현대적인 독성 / 분자 생물학 실험실에서 생식 세포 돌연변이 테스트를위한 실용적이고 효율적인 옵션을 제공합니다. TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 효과적인 적용을위한 하나의 필수 요구 사항은 정자 사이클 (그림 3)에 대한 이해이다. 성에서 진행하는 마우스 생식​​ 세포에 대한 시간마지막으로 정조 세포, 정모 세포, 정자, 그리고에 정 세관에서 전각 세포 (예. 정자)이 약 사십구일입니다 부고환에서 정자를 성숙. 돌연변이는이 사이클의 다양한 단계에서 발생하고 종종 화합물 특정 할 수 있습니다. 남성 생식 세포에 돌연변이에 특히 관련이있는 두 가지 핵심 기능은 초기 감수 분열시 DNA 합성의 중단, 늦은 후 감수 분열시 DNA 수리 능력 (6)의 진보적 인 손실의 유도와 고정에 필요한 두 개의 프로세스 아르 대부분의 돌연변이. 정자 때문에 이러한 독특한 특성, TGR 생식 세포 돌연변이 분석의 수행을위한 세 가지 중요한 실험 변수가있다 : (1) 시험 화합물의 투여 시간; (2) 샘플링 시간; 및 (3) 생식 세포 집단의 선택은 분석 (도 3 및 표 1)에 대해 수집. 투여 시간이다 experime긴 대상 세포를 시험 화합물에 노출되는 방법을 결정 ntal 변수. 투여 시간의 길이는 특정 세포 유형 또는 정자 형성의 단계에 노출을 타겟팅하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 하루의 투여는 특정 세포 유형에 대한 급성 노출 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. 마찬가지로 노출은 meiotically 분할 정모 세포를 표적으로하거나 mitotically 이주 투여 시간 및 적절한 샘플링 시간 정조 세포를 이용하여 분할함으로써, 예를 들면, 전체 정자 상에 집중 될 수있다. 만성 및 하위 만성 투여 시간은 시험 화합물의 충분한 약물 동력학 분포를 확보, 또는 28 일의 투여 시간은 OECD 시험에서 추천 예 약함 돌연변이에서 돌연변이 충분한 축적 (허용, 장기 노출의 효과를 평가하는 데 사용 가이드 라인). 샘플링 시간을 결정하는 중요한 변수되는정자의 위상은 표적 세포는 노광시에 있었다. 샘플링 시간은 얼마나 많은 시간을 지시, 따라서 얼마나 더 정자 사이클을 따라, 세포는 노출 후 통과합니다. 예를 들어, 줄기 세포 정조 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해, 샘플링 시간&gt; 사십구일은&gt; 사십이일 완전히 성숙 된 정자를 수집하는 경우에는 필요, 또는 수집 된 모든 세포에 충분한 시간이 있는지 확인하기 위해 정 세관에서 미​​성숙 생식 세포를 수집하는 경우 노출에서 개발은 줄기 세포를. 이것은 적어도 70 일의 샘플링 시간이 정자 이후 단계에서 노출 세포의 제거를 위해, 독성 물질의 약물 동력 학적 분포를위한 충분한 시간을 제공하는 진정한 줄기 세포 효과를 입증하는 것이 바람직 할 것이며, 고려하여주의하는 것이 중요 높은 돌연변이 유발 물질에 노출 된 후 22 ~ 육주를 발생할 수 있습니다 일시적 불임의 기간. 비슷하게 21 일의 샘플링 시간은 정자 이거를 보장 할마미의 부고환에서 cted은 노출의 마지막 날 감수 분열을 완료 한 것입니다. 생식 세포는 카우의 부고환에서, 또는 정 세관에서 다양 정자 세포 유형의 혼합물로서 성숙한 정자로서 수집 될 수있다. 성숙한 정자 상대 정확도 정자 주어진 실험 설계를 위해 시작된 정자 세포 유형 또는 위상으로 결정하는 것을 가능하게 ~ 3 일간 카우 남아있다. 따라서, 카우 정자 허가의 분석은 높은 단계 특정 돌연변이 효과의 조사 대상. 한편, 정 세관에서 수집 된 세포 현탁액의 개발 단계에서 여러 가지 세균 세포 유형의 혼합물을 포함하고, 이와 같이 돌연변이 유래 된 정자의 불량한 위상 분해능을 제공한다. 또한, 정 세관 세포로부터 회수 현탁액 정모 세포 뒤에 정자의 과잉 표현, 및 버전을 포함하는 경향Y 몇 정조 세포 및 줄기 세포 (이 비율은 그림 3과를 졸업 흰색 막대로 표시됩니다). 또한, 정 세관에서 제조 된 현탁액은 다양한 체세포를 포함 할 수있다. 많은 세포 종류가 존재하기 때문에 이와 같이, 돌연변이 효과는 비 대상 세포의 종류에 의해 영향을받을 수있다. 그러나 정 세관에서 샘플을 수집하는 동시에 여러 생식 세포 유형 및 체세포 돌연변이에 대한 표준 OECD 시험 프로토콜에 생식 세포 분석의 쉬운 통합을 스크리닝 경제적 인 옵션을 제공합니다. 조사자, 투여 시간, 및 샘플링 시간 수집 세포 집단의 필요에 따라, 반복 다양한 세포 유형 및 정자 형성의 서로 다른 단계에서의 노출 효과를 심문하도록 조정될 수있다. 이러한 변수를 신중하게 선택함으로써, 실험, 또는 더 일반화 규제 시험 대상으로 역학적 연구를 위해 설계 될 수있다목적을 보내고. 분석에서 높은 점수를 얻기 위해, 우리는 70 일의 샘플링 시간 포지티브 제어 하였다 / kg N-에틸-N-니트로 소 우레아 100 mg의 (ENU)의 급성 경구 투여에의 사용을 추천한다. 카우 정자의 분석은 따라서 일반적으로 ENU이 높은 돌연변이 용량 다음과 같은 컨트롤을 통해 돌연변이 주파수 (MF)의 4 ~ 5 배 증가를 전시 정원 줄기 세포 (그림 3)를 대상으로합니다. 이는 따라서 짧은 샘플링 시간에 대한 적절한 도즈 제어되지 않을 수도 선량이 무균 6주 노광을 게시 유도하는 것으로 알려져 있음에 유의해야한다. 이 용량은 대부분의 신체 조직 20 MF에서 검출 증가를 생성합니다. 아래에 제시 대표 결과 및 100 ㎎ / ㎏을 포함하여 ENU의 세 가지 용량을 사용하여 급성 70 노출 요법 다음 생성 된.

<table><tbody><tr><td>MutaMouse</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (lacZ-/galE-)</td><td>Covance-See</td><td></td> <td>reference 25 in manuscript</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Caledon</td><td>3001-2-40</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.5M, pH 8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690 FLUKA</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>Caledon</td><td>2/10/7900</td><td></td></tr><tr><td>Lennon LB 육수 기반</td><td>Invitrogen</td><td>12780-029</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 메쉬 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3770</td><td></td></tr><tr><td>트랜스팩 포장 추출물</td><td>Agilent Technologies</td><td>200220</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 무수 (EtOH)</td><td>상업용 알코올-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>dH2O에 20mg/ml 준비</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>11815-024</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>페놀</td><td>인비트로겐</td><td>15509-097에서 5mg/ml 준비</td><td>제조 업체 지시에 따라 0.1 M 트리스 HCl에 포화</td></tr><tr><td>페닐 -&베타 - D- 갈락 토피라 노사이드 (P-Gal)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>P6501</td><td>디메틸 포름 아미드</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td> 10 ml 당 3g <td>준비 60 mg / ml 용액 dH 2 O 사용 직전, 20 &micro; l 샘플당</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨(NaAc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>3M 용해, pH 5.2</td></tr><tr><td>황산나트륨(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>1M MgSO4</td><td></td><td></td><td>에서 10% 용액 준비24.6 g MgSO4&middot; 100ml dH<<>sub>2<>O, 오토클레이브, 실온에서 최대 1년</td></tr><tr><td>LB 육수</td><td></td><td></td><td>5.0g LB 베이스, 1L dH2O당 6.4g NaCl 오토클레이브 및 냉각</td></tr><tr><td>식염수 구연산나트륨(SSC)</td><td></td><td></td><td>150mM NaCl, 15 mM 시트르산 트리소듐, pH 7.0&nbsp;</td></tr><tr><td>SM 버퍼</td><td></td><td></td><td>5.8g NaCl, 2.0g MgSO4&middot; 7H2O, 50ml 1M Tris-HCl(pH 7.5), 젤라틴 5.0ml(2% w/v), 1L dH2O, 오토클레이브, 최대 1년</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8</td></tr></tbody></table>

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo 돌연변이는 대부분 남성 생식계열에서 발생하며 다음 세대에 건강에 해로운 결과를 초래할 수 있습니다. 생식 세포 돌연변이의 유도를 평가하는 전통적인 방법은 많은 수의 동물을 사용해야 하기 때문에 실용적이지 않습니다. 따라서 생식세포 돌연변이원성은 화학 테스트 및 위험 평가 중에 거의 평가되지 않습니다. 본 명세서에서는 최근 승인된 경제협력개발기구(OECD) 테스트 가이드라인을 기반으로 하는 형질전환 설치류 모델을 사용하여 생체 내 남성 생식 세포 돌연변이 분석을 설명합니다. 이 방법은 in vitro positive selection assay를 사용하여 노출된 수컷의 생식 세포에서 직접 리포터 유전자를 지닌 형질전환 λgt10 벡터에서 유도된 생체 내 돌연변이를 측정합니다. 또한 생식 세포에서 회수된 전이유전자의 돌연변이 검출을 사용하여 노출 기간(투여 시간), 노출과 샘플 수집 사이의 시간(샘플링 시간) 및 분석을 위해 수집된 세포 집단의 세 가지 실험 매개변수를 제어하여 돌연변이 유발 노출에 대한 다양한 정자 생성 세포 유형의 단계별 민감도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 한 명의 남성으로부터 많은 수의 생식 세포를 분석할 수 있기 때문에 이 방법은 기존 방법에 비해 감도가 우수하고 동물 수가 적어 시간과 자원이 훨씬 적습니다.

동물 당 200,000 플라크 평균 플라크 카운트, 우리는 일반적으로 우리 대조군에서 1.7 × 10 -5, 표준 편차는 약 2.8 × 10 -5 수컷 생식 세포에서의 평균 배경 MF 관찰 (독립 팔 데이터에 기초 실험). N = 5 동물이 플라크 수, 배경 수준과 분산, 투여 그룹과 각 전원&gt; 0.8와 MF의 2 배의 증가를 감지하기에 충분하다. 결과는 일반적으로 표 2와 그림 6은 공의 단일 급성 경구 투여, 25, 50에 노출 MutaMouse 남성의 카우 정자 (그룹 당 n = 5)에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 표 또는 그래픽 형식으로보고하고, 100 ㎎ / ㎏ 아르 70 일의 샘플링 시간이어서 N-에틸-N-니트로 소 우레아 (ENU). 이 칠십일 기간은 노광시의 정원 줄기 세포가 있었다 정자 발생 돌연변이 사건의 측정 (도 3을 허용). 돌연변이 및 역가 플레이트에 플라크 전형적인 밀도가도 7에 도시된다. 표 2 및도 6에 도시 된 바와 같이, 급성 ENU 노출은 정원 줄기 세포의 MF에서 용량 의존적으로 유의 한 증가를 유도. 낮은 복용량은 2.6 × 10 -5의 기준 MF했다 컨트롤을 통해 상당한 2.6 배 증가를 유도. 최대 유도 제어에 비해 4.4 배 증가를 유도 높은 복용량에서 발생했습니다. 정소 세관 생식 세포에서 수행이 분석의 예는 더글라스 외. 27 MF가 / kg ENU 50 mg을 오일 반복 복강 내 주사 다음 다양한 시간 간격 세뇨관 세균 세포에서 측정 하였다에서 찾을 수있다. 이 연구에서, 정액을 운반하는 세포에서 돌연변이 주파수는 치료 후 15 일까지 증가하고 그 이후 일정하게 유지되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> 엑스포확인 요법 </td><td> 수집 된 조직 </td><td> 수집 된 세포 유형 (타겟 셀) </td><td> 노출의 처음에 타겟 셀의 위상 </td><td> 단계 노출시 전달 </td></tr><tr><td> 급성 + 70 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 정조 세포 </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 세포 </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatid 성숙한 정자 </td></tr><tr><td></td><td> 세관 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 정조 세포 </td><td> SPermatogonia </td><td> 정조 세포 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> 카우 </td><td> 성숙한 정자 </td><td> 줄기 CEL </td><td> 줄기 세포 </td></tr><tr><td></td><td> 세관 </td><td> 줄기 세포 정조 세포 Spermatocyte Spermatid </td><td> 줄기 세포 </td><td> 줄기 세포 </td></tr></tbody></table> 다양한 실험 설계에 의한 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석의 대상이되는 표 1 셀 유형과 정자의 단계. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 투여군 </td><td> 동물 # </td><td> 돌연변이 PFU </td><td> 총 PFU </td><td> MF (배10 -5) </td><td> 평균 MF (× 10 -5) </td><td> 배 변경 </td><td> P 값 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 이 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 이 </td><td> 431396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg을 / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg을 / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ TD&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 ㎎을 / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2 형질 전환 남성 m의 카우 정자의 lacZ의 돌연변이 주파수그들은 정원 줄기 세포 (= 일일 관리 시간, 샘플링 시간 = 칠십일) 일 때 얼음 ENU에 심하게 노출. PFU는 플라크 형성 단위, MF = 돌연변이 주파수를 =. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> 도 1 λgt10 파아지 구조의 개략도. <img alt="그림이" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> 그림 2 형질 전환 쥐의 생식 세포 돌연변이 분석의 개요. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> 도 3 및 마우스에서 정자 세포 유형과 같은 PHA의 개략도다양한 실험 설계에 의한 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석의 대상이 아르 에스 주 :.. 졸업 흰색 막대는 정 ​​세관에서 제조 된 세포 현탁액에 존재하는 세포 유형 (즉, 정자&gt; 정모 세포&gt; 정조 세포&gt; 줄기 세포)의 상대적 비율을 나타내는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> 마우스 마미의 부고환의 4 컬렉션을줍니다. A)) 음낭. B 방향으로 복부 절개를 부드럽게 고환과 부고환을 그립니다 지방 패드를 당겨) 부고환 지방 패드. C를 확인합니다. D) 찾아 마미의 부고환을 절제. 정 세관에서 생식 세포의 현탁액 (5) 준비 그림. A) 절개에 5 ~ 10 ° 각도로 정 세관은 캡슐. C) 조직 롤러가 부드럽게 세관을 통해 전달의 압박이있는 정 세관. B)를 노출 고환의 상피 캡슐에서 이루어집니다 . D에 포함 된 생식 세포) 생식 세포 현탁액을 추가 처리를 위해 수집을 놓습니다. <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> MutaMouse 정자에서의 lacZ 돌연변이 주파수의 그림 6 그래픽 표현 (N = 5) ENU에 줄기 세포로 급성 노출. 각삼각형은 한 동물의 MF를 나타냅니다. * P &lt;0.05 포아송 회귀 분석에 의해 결정. <img alt="그림 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> 플라크와 형질 전환 쥐의 돌연변이 분석에서 그림 7 대표 한천 플레이트는 E.의 잔디밭에 형성 콜라이 숙주 박테리아. A) &quot;돌연변이&quot;판은 가끔 어떤 접시에 제로 플라크. B) &quot;역가&quot;판 플라크의 수백을 가질 수있을 것이다 특히 제어 투여 그룹에서 화살표로 표시된 거의 플라크 ()를,해야합니다.

남성 생식계열의 새로운 돌연변이는 다음 세대에서 건강에 해로운 결과에 기여할 수 있습니다. 여기에서는 환경 인자에 의해 유도된 수컷 생식 세포의 돌연변이를 정량화하기 위한 형질전환 설치류 모델의 사용 프로토콜에 대해 설명합니다.

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발 물질에 노출된 수컷 형질전환 생쥐의 생식세포에서 회수된 리포터 유전자의 유도 돌연변이 빈도를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수컷 생쥐를 생식세포 돌연변이 유발 의심 물질에 노출시킵니다. 두 번째 단계는 정자 형성의 원하는 단계가 진행된 후 생식세포를 수집하는 것입니다.다음으로 돌연변이 보고 트랜스진이 포함된 DNA를 생식세포로부터 회수합니다. 마지막 단계는 회수된 보고 유전자를 람다 파지 입자에 패키징하는 것입니다. 최종적으로, 생식세포에서 회수된 보고 유전자 중 돌연변이가 일어난 비율을 측정하기 위해 인 비트로(in vitro) 양성 선택 분석법이 사용됩니다.특정 유전자 좌위 검사(specific locus test)나 도미노 리틀 검사(domino little test)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 돌연변이 자손을 평가하는 대신 생식 세포에서 돌연변이를 직접 측정한다는 점입니다. 단일 수컷으로부터 다수의 생식 세포를 조사할 수 있어 기존 방법보다 분석 민감도를 높이는 동시에, 동물 자원과 소요 시간을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 이 방법은 생식 세포에 돌연변이를 유발하는 물질의 식별 및 그 작용 기전의 규명과 같이 유전 독성학 및 돌연변이 유발 연구 분야의 핵심 과제들을 해결할 수 있습니다.본 논문에서는 Muta 마우스 모델을 대상으로 한 방법을 설명하고 있으나, 박테리아 파지 돌연변이 보고 벡터를 보유한 다른 형질전환 설치류 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한, 본 방법은 수컷 생식 세포를 처리하는 과정을 설명하고 있지만, 체세포 조직에도 일반적으로 적용 가능하며, 특히 OECD에서 발행한 국제 조화 시험 가이드라인의 적용을 받습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 분석의 in vitro 단계 중 여러 단계에서 대기 시간이 길기 때문에 시간 조절에 어려움을 겪을 수 있습니다.본 방법을 적시에 완료하기 위해서는 각 단계를 세심하게 계획하고 조정해야 합니다. 실험을 시작하기 앞서, 저희 실험실의 생물학자인 John Gingrich와 Linda Soper가 절차를 시연할 것입니다. 투여 시간, 샘플링 시간, 그리고 수집할 생식 세포 집단이라는 세 가지 핵심 실험 변수를 선정해야 합니다.이러한 변수들을 조정하여 다양한 생식 세포 유형과 정자 형성의 서로 다른 단계에서 노출의 영향을 조사할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 8~12주령의 형질 전환 수컷 마우스를 대조군과 실험군으로 무작위 배정하며, 각 그룹당 최소 5마리 이상을 포함시킵니다. 그 후, 선택한 투여 시간 동안 적절한 노출 경로를 통해 시험 화합물과 관련 대조군을 마우스에 처리합니다.다음으로, 관심 있는 정자 메타제닉 세포 유형에 따라 적절한 샘플링 시간을 선택하십시오. 그 후 샘플링 시간이 되면, 이소플루레인 마취 하에 경추 탈골법으로 마우스를 안락사시킵니다. 고환을 적출하기 위해 복부를 절개하고, 상피 지방 패드의 위치를 확인하십시오.지방 패드를 조심스럽게 당겨 음낭에서 고환과 부고환을 끌어냅니다. 그런 다음 부고환 꼬리(cauda epididymis)를 절제합니다. 부고환 꼬리를 액체 질소에 급속 냉동한 후, 추후 사용을 위해 -80 °C에서 보관합니다.Cota 정자를 처리할 준비가 되면, 얼음 위에서 Cota 부고환을 해동한 후 해동된 Cota를 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 메스나 면도날을 사용하여 Cota 부고환을 완전히 잘게 다진 후, 실온의 DPBS 700 µL를 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 광구(wide bore) 1000 µL 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 약 10회 또는 DPBS가 정자로 인해 뿌옇게 될 때까지 흡입 및 배출하여 Cota로부터 정자를 방출시키고, 정자 현탁액을 스테인리스 스틸 메쉬 필터로 걸러 새 1.5 mL 튜브에 담은 후, 튜브를 11,000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다.펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 튜브에서 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 그다지 차가운 1x saline sodium citrate 1 mL를 넣고, 펠렛이 완전히 재현탁될 때까지 튜브를 볼텍싱합니다. 다음으로, 10% SDS 15 µL를 튜브에 넣고 30초 동안 튜브를 강하게 흔들어 비정자 세포를 파괴합니다.그런 다음 튜브를 11,000 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 튜브에서 상층액을 조심스럽게 따라내고, 0.2 x 차가운 saline sodium citrate 940 µL를 첨가한 후 펠렛이 재현탁될 때까지 튜브를 다시 볼텍싱합니다. 여기에 A beta mer capto ethanol 120 µL, 10% SDS 100 µL, 0.5 M EDTA pH 8 20 µL 및 60 mg/mL 용액 20 µL를 첨가합니다.재현탁된 정자에 Proteinase K를 첨가합니다. 용액을 잘 섞은 후, 튜브를 로테이터에 놓고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 소화시킵니다. 하룻밤 동안의 소화 과정이 끝나면, 텍스트 프로토콜에 기술된 페놀 클로로포름 추출 수행 단계를 따라 정자 꼬리에서 DNA를 추출합니다.DNA 침전물을 40~100 µL의 pH 8 tris EDTA 완충액에 녹여 4 °C에서 보관하십시오. 다음 단계로 진행하기 전, DNA가 완전히 용해될 수 있도록 며칠 동안 충분히 두십시오. LAX Z 돌연변이 분석을 수행하기 전, 처리할 샘플 수에 맞는 충분한 양의 bottom auger를 준비하여 오토클레이브 멸균하십시오.그런 다음 무균적으로 agar를 90 millimeter 페트리 접시에 붓고, 50 milliliter 튜브에서 agar가 응고되도록 합니다. LB broth 10 milliliters, 20% maltose solution 100 microliters, 20 milligrams per milliliter ampicillin 25 microliters, 그리고 5 milligrams per milliliter kanamycin 20 microliters를 첨가합니다. 그 후 LAX Z negative GAL e negative e coli를 튜브에 접종하고, 37 degrees Celsius에서 240 RPM으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 키웁니다. 분석 첫째 날에 항생제가 없는 신선한 LB로 하룻밤 배양한 배양액을 1:100으로 희석하여 세포를 계대 배양합니다.배양물을 37 °C에서 240 RPM으로 진탕하며 약 3시간 동안 또는 OD 600이 1이 될 때까지 배양합니다. OD 600이 1에 도달하면, 세포 현탁액을 50 mL 튜브에 균등하게 나누어 담고 15 °C에서 1,300 ×g로 10분간 원심분리합니다. 그다음 상층액을 제거하고 10 mM 황산 마그네슘이 포함된 LB 배지 원래 부피의 절반 양으로 세포를 재현탁합니다.다른 시약을 준비하는 동안 세포를 따로 둡니다. 우선 와이드 보어 피펫을 사용하여 꼬리 정자에서 추출한 DNA 4 µL를 1.5 mL 튜브에 넣음으로써 람다 파지 입자에 DNA를 패키징합니다.파지 패키징 추출물 키트의 첫 번째 튜브를 실온에서 해동한 후, 패키징 추출물 4.8 µL를 DNA가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 섞어준 뒤 30 °C 항온수조에서 1.5시간 동안 배양합니다. 이어서 두 번째 패키징 추출물 튜브를 해동하고, 다시 4.8 µL를 DNA가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다.피펫 팁으로 용액을 부드럽게 섞은 다음, 튜브를 30 °C 항온수조에서 1.5시간 동안 배양합니다. 패키징된 파지 입자를 500 µL의 saline magnesium buffer에 재부유시키고, 튜브를 로테이터에 올려 20 RPM으로 30분 동안 회전시킵니다. 회전이 끝나면 샘플을 짧게 볼텍싱한 후, 11,000 ×g에서 30초 동안 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥에 모읍니다.이제 파지 입자를 감염시킬 준비가 되었습니다. 다음으로, 각 타이터 및 돌연변이 플레이트용으로 8 mL의 top auger를 준비합니다. 황산마그네슘을 10 mM로 첨가하기 전까지 top auger를 50 °C로 유지하고, 돌연변이 선택 시에는 선택제인 PGAL을 L당 3 g 첨가합니다.세포 감염 전 상단 오거(auger)만 사용하십시오. 샘플당 50 milliliter 튜브 두 개에 각각 mutant와 titer라고 라벨을 붙입니다. 그다음 샘플당 오거 플레이트 8개에 각각 mutant 4개, titer 4개로 라벨을 붙입니다.다음으로, 재현탁된 세포 2 mL를 각각의 50 mL 튜브에 피펫팅하여 넣습니다. 'mutant'라고 표시된 50 mL 튜브에 패키징된 파지 입자 500 µL를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 파지 입자가 세포를 감염시키도록 둡니다.30분간 배양한 후, 감염된 세포를 짧게 볼텍싱하고 감염된 세포 15 µL를 해당 50 mL 타이터 튜브로 옮깁니다. 50 °C로 가열된 타이터 top auger 30 mL를 50 mL 타이터 튜브에 넣습니다. 즉시 auger와 세포 혼합물을 4개의 타이터 플레이트에 분배합니다.50 °C 돌연변이 선택용 어거(auger)에 L당 3 g의 P gal이 첨가되었는지 확인하십시오. 다음으로, PGAL이 포함된 돌연변이 선택용 어거 30 mL를 돌연변이 50 mL 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 즉시 어거와 세포 혼합물을 4개의 돌연변이 플레이트에 분배하십시오.플레이트를 응고시킨 후, 플레이트를 뒤집어 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝나면 변이주 플레이트와 타이터 플레이트의 플라크 수를 측정합니다. 그다음 4개의 변이주 플레이트에서 측정된 총 변이 플라크 수를 타이터 플레이트에서 결정된 감염 세포 총 부피 내의 추정 총 플라크 형성 단위(PFU) 수로 나누어 변이 빈도를 추정합니다.전형적인 형질전환 설치류 생식세포 돌연변이 분석에서는 특히 대조군 용량 그룹의 돌연변이 증식 플레이트에서 매우 적은 수의 플라크가 관찰됩니다. 반면, 역가 플레이트에서는 수백 개의 플라크가 검출됩니다. mutt 마우스 수컷에게 0, 25, 50, 100 mg/kg의 ENU를 단회 급성 경구 투여하고 70일의 샘플링 기간을 거침으로써 정원줄기세포의 돌연변이 사건을 측정할 수 있었습니다.저용량의 ENU는 대조군 대비 돌연변이 빈도를 2.6배 증가시켰으며, 최대 용량에서는 4.4배의 증가를 유도했습니다. 이 절차를 사용하는 실험을 설계할 때는 항상 타이밍을 고려하는 것이 중요합니다. 원하는 정자 메타제닉(metagenic) 세포 유형에서 기인하는 효과를 관찰하기 위해서는 정자 메타제닉 주기, 투여 시간, 샘플링 시간 및 수집 세포 유형을 신중하게 선택해야 합니다.이 절차를 통해 돌연변이 플라크의 DNA 서열 분석을 수행하여 돌연변이의 특성을 규명하고, 클론 확장 이벤트로 인해 발생했을 수 있는 돌연변이체를 식별할 수 있습니다. 이 기술은 유전 독성학 분야의 연구자들이 생식선을 표적으로 하는 돌연변이원 물질을 식별하는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 돌연변이원에 노출된 생식 세포 또는 형질전환 수컷 마우스에서 유도된 돌연변이 빈도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 분석법은 생식세포 돌연변이원성에 대한 규제 시험 및 보다 표적화된 메커니즘 연구에 응용될 가능성이 있습니다.

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

마우스 라운드 Spermatid 주입

학습하세요 형질 전환 쥐를 이용한 남성 생식 세포 돌연변이 정량화 방법입니다. 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발 물질에 노출된 수컷 생식 세포에서 유도된 돌연변이 빈도를 측정하는 효율적인 실험 기법을 익히세요.

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