형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

본 실험 절차의 전반적인 목표는 화학적 또는 물리적 돌연변이 유발 물질에 노출된 수컷 형질전환 생쥐의 생식세포에서 회수된 리포터 유전자의 유도 돌연변이 빈도를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수컷 생쥐를 생식세포 돌연변이 유발 의심 물질에 노출시킵니다. 두 번째 단계는 정자 형성의 원하는 단계가 진행된 후 생식세포를 수집하는 것입니다.

다음으로 돌연변이 보고 트랜스진이 포함된 DNA를 생식세포로부터 회수합니다. 마지막 단계는 회수된 보고 유전자를 람다 파지 입자에 패키징하는 것입니다. 최종적으로, 생식세포에서 회수된 보고 유전자 중 돌연변이가 일어난 비율을 측정하기 위해 인 비트로(in vitro) 양성 선택 분석법이 사용됩니다.

특정 유전자 좌위 검사(specific locus test)나 도미노 리틀 검사(domino little test)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 돌연변이 자손을 평가하는 대신 생식 세포에서 돌연변이를 직접 측정한다는 점입니다. 단일 수컷으로부터 다수의 생식 세포를 조사할 수 있어 기존 방법보다 분석 민감도를 높이는 동시에, 동물 자원과 소요 시간을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 이 방법은 생식 세포에 돌연변이를 유발하는 물질의 식별 및 그 작용 기전의 규명과 같이 유전 독성학 및 돌연변이 유발 연구 분야의 핵심 과제들을 해결할 수 있습니다.

본 논문에서는 Muta 마우스 모델을 대상으로 한 방법을 설명하고 있으나, 박테리아 파지 돌연변이 보고 벡터를 보유한 다른 형질전환 설치류 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한, 본 방법은 수컷 생식 세포를 처리하는 과정을 설명하고 있지만, 체세포 조직에도 일반적으로 적용 가능하며, 특히 OECD에서 발행한 국제 조화 시험 가이드라인의 적용을 받습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 분석의 in vitro 단계 중 여러 단계에서 대기 시간이 길기 때문에 시간 조절에 어려움을 겪을 수 있습니다.

본 방법을 적시에 완료하기 위해서는 각 단계를 세심하게 계획하고 조정해야 합니다. 실험을 시작하기 앞서, 저희 실험실의 생물학자인 John Gingrich와 Linda Soper가 절차를 시연할 것입니다. 투여 시간, 샘플링 시간, 그리고 수집할 생식 세포 집단이라는 세 가지 핵심 실험 변수를 선정해야 합니다.

이러한 변수들을 조정하여 다양한 생식 세포 유형과 정자 형성의 서로 다른 단계에서 노출의 영향을 조사할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 8~12주령의 형질 전환 수컷 마우스를 대조군과 실험군으로 무작위 배정하며, 각 그룹당 최소 5마리 이상을 포함시킵니다. 그 후, 선택한 투여 시간 동안 적절한 노출 경로를 통해 시험 화합물과 관련 대조군을 마우스에 처리합니다.

다음으로, 관심 있는 정자 메타제닉 세포 유형에 따라 적절한 샘플링 시간을 선택하십시오. 그 후 샘플링 시간이 되면, 이소플루레인 마취 하에 경추 탈골법으로 마우스를 안락사시킵니다. 고환을 적출하기 위해 복부를 절개하고, 상피 지방 패드의 위치를 확인하십시오.

지방 패드를 조심스럽게 당겨 음낭에서 고환과 부고환을 끌어냅니다. 그런 다음 부고환 꼬리(cauda epididymis)를 절제합니다. 부고환 꼬리를 액체 질소에 급속 냉동한 후, 추후 사용을 위해 -80 °C에서 보관합니다.

Cota 정자를 처리할 준비가 되면, 얼음 위에서 Cota 부고환을 해동한 후 해동된 Cota를 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 메스나 면도날을 사용하여 Cota 부고환을 완전히 잘게 다진 후, 실온의 DPBS 700 µL를 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 광구(wide bore) 1000 µL 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 약 10회 또는 DPBS가 정자로 인해 뿌옇게 될 때까지 흡입 및 배출하여 Cota로부터 정자를 방출시키고, 정자 현탁액을 스테인리스 스틸 메쉬 필터로 걸러 새 1.5 mL 튜브에 담은 후, 튜브를 11,000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다.

펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 튜브에서 상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 그다지 차가운 1x saline sodium citrate 1 mL를 넣고, 펠렛이 완전히 재현탁될 때까지 튜브를 볼텍싱합니다. 다음으로, 10% SDS 15 µL를 튜브에 넣고 30초 동안 튜브를 강하게 흔들어 비정자 세포를 파괴합니다.

그런 다음 튜브를 11,000 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 튜브에서 상층액을 조심스럽게 따라내고, 0.2 x 차가운 saline sodium citrate 940 µL를 첨가한 후 펠렛이 재현탁될 때까지 튜브를 다시 볼텍싱합니다. 여기에 A beta mer capto ethanol 120 µL, 10% SDS 100 µL, 0.5 M EDTA pH 8 20 µL 및 60 mg/mL 용액 20 µL를 첨가합니다.

재현탁된 정자에 Proteinase K를 첨가합니다. 용액을 잘 섞은 후, 튜브를 로테이터에 놓고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 소화시킵니다. 하룻밤 동안의 소화 과정이 끝나면, 텍스트 프로토콜에 기술된 페놀 클로로포름 추출 수행 단계를 따라 정자 꼬리에서 DNA를 추출합니다.

DNA 침전물을 40~100 µL의 pH 8 tris EDTA 완충액에 녹여 4 °C에서 보관하십시오. 다음 단계로 진행하기 전, DNA가 완전히 용해될 수 있도록 며칠 동안 충분히 두십시오. LAX Z 돌연변이 분석을 수행하기 전, 처리할 샘플 수에 맞는 충분한 양의 bottom auger를 준비하여 오토클레이브 멸균하십시오.

그런 다음 무균적으로 agar를 90 millimeter 페트리 접시에 붓고, 50 milliliter 튜브에서 agar가 응고되도록 합니다. LB broth 10 milliliters, 20% maltose solution 100 microliters, 20 milligrams per milliliter ampicillin 25 microliters, 그리고 5 milligrams per milliliter kanamycin 20 microliters를 첨가합니다. 그 후 LAX Z negative GAL e negative e coli를 튜브에 접종하고, 37 degrees Celsius에서 240 RPM으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 키웁니다. 분석 첫째 날에 항생제가 없는 신선한 LB로 하룻밤 배양한 배양액을 1:100으로 희석하여 세포를 계대 배양합니다.

배양물을 37 °C에서 240 RPM으로 진탕하며 약 3시간 동안 또는 OD 600이 1이 될 때까지 배양합니다. OD 600이 1에 도달하면, 세포 현탁액을 50 mL 튜브에 균등하게 나누어 담고 15 °C에서 1,300 ×g로 10분간 원심분리합니다. 그다음 상층액을 제거하고 10 mM 황산 마그네슘이 포함된 LB 배지 원래 부피의 절반 양으로 세포를 재현탁합니다.

다른 시약을 준비하는 동안 세포를 따로 둡니다. 우선 와이드 보어 피펫을 사용하여 꼬리 정자에서 추출한 DNA 4 µL를 1.5 mL 튜브에 넣음으로써 람다 파지 입자에 DNA를 패키징합니다.

파지 패키징 추출물 키트의 첫 번째 튜브를 실온에서 해동한 후, 패키징 추출물 4.8 µL를 DNA가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 피펫 팁으로 용액을 부드럽게 섞어준 뒤 30 °C 항온수조에서 1.5시간 동안 배양합니다. 이어서 두 번째 패키징 추출물 튜브를 해동하고, 다시 4.8 µL를 DNA가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다.

피펫 팁으로 용액을 부드럽게 섞은 다음, 튜브를 30 °C 항온수조에서 1.5시간 동안 배양합니다. 패키징된 파지 입자를 500 µL의 saline magnesium buffer에 재부유시키고, 튜브를 로테이터에 올려 20 RPM으로 30분 동안 회전시킵니다. 회전이 끝나면 샘플을 짧게 볼텍싱한 후, 11,000 ×g에서 30초 동안 원심분리하여 샘플을 튜브 바닥에 모읍니다.

이제 파지 입자를 감염시킬 준비가 되었습니다. 다음으로, 각 타이터 및 돌연변이 플레이트용으로 8 mL의 top auger를 준비합니다. 황산마그네슘을 10 mM로 첨가하기 전까지 top auger를 50 °C로 유지하고, 돌연변이 선택 시에는 선택제인 PGAL을 L당 3 g 첨가합니다.

세포 감염 전 상단 오거(auger)만 사용하십시오. 샘플당 50 milliliter 튜브 두 개에 각각 mutant와 titer라고 라벨을 붙입니다. 그다음 샘플당 오거 플레이트 8개에 각각 mutant 4개, titer 4개로 라벨을 붙입니다.

다음으로, 재현탁된 세포 2 mL를 각각의 50 mL 튜브에 피펫팅하여 넣습니다. 'mutant'라고 표시된 50 mL 튜브에 패키징된 파지 입자 500 µL를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 파지 입자가 세포를 감염시키도록 둡니다.

30분간 배양한 후, 감염된 세포를 짧게 볼텍싱하고 감염된 세포 15 µL를 해당 50 mL 타이터 튜브로 옮깁니다. 50 °C로 가열된 타이터 top auger 30 mL를 50 mL 타이터 튜브에 넣습니다. 즉시 auger와 세포 혼합물을 4개의 타이터 플레이트에 분배합니다.

50 °C 돌연변이 선택용 어거(auger)에 L당 3 g의 P gal이 첨가되었는지 확인하십시오. 다음으로, PGAL이 포함된 돌연변이 선택용 어거 30 mL를 돌연변이 50 mL 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 즉시 어거와 세포 혼합물을 4개의 돌연변이 플레이트에 분배하십시오.

플레이트를 응고시킨 후, 플레이트를 뒤집어 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양이 끝나면 변이주 플레이트와 타이터 플레이트의 플라크 수를 측정합니다. 그다음 4개의 변이주 플레이트에서 측정된 총 변이 플라크 수를 타이터 플레이트에서 결정된 감염 세포 총 부피 내의 추정 총 플라크 형성 단위(PFU) 수로 나누어 변이 빈도를 추정합니다.

전형적인 형질전환 설치류 생식세포 돌연변이 분석에서는 특히 대조군 용량 그룹의 돌연변이 증식 플레이트에서 매우 적은 수의 플라크가 관찰됩니다. 반면, 역가 플레이트에서는 수백 개의 플라크가 검출됩니다. mutt 마우스 수컷에게 0, 25, 50, 100 mg/kg의 ENU를 단회 급성 경구 투여하고 70일의 샘플링 기간을 거침으로써 정원줄기세포의 돌연변이 사건을 측정할 수 있었습니다.

저용량의 ENU는 대조군 대비 돌연변이 빈도를 2.6배 증가시켰으며, 최대 용량에서는 4.4배의 증가를 유도했습니다. 이 절차를 사용하는 실험을 설계할 때는 항상 타이밍을 고려하는 것이 중요합니다. 원하는 정자 메타제닉(metagenic) 세포 유형에서 기인하는 효과를 관찰하기 위해서는 정자 메타제닉 주기, 투여 시간, 샘플링 시간 및 수집 세포 유형을 신중하게 선택해야 합니다.

이 절차를 통해 돌연변이 플라크의 DNA 서열 분석을 수행하여 돌연변이의 특성을 규명하고, 클론 확장 이벤트로 인해 발생했을 수 있는 돌연변이체를 식별할 수 있습니다. 이 기술은 유전 독성학 분야의 연구자들이 생식선을 표적으로 하는 돌연변이원 물질을 식별하는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 돌연변이원에 노출된 생식 세포 또는 형질전환 수컷 마우스에서 유도된 돌연변이 빈도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 분석법은 생식세포 돌연변이원성에 대한 규제 시험 및 보다 표적화된 메커니즘 연구에 응용될 가능성이 있습니다.