에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제 대장균

이 절차의 전반적인 목표는 역전이 사이클링을 통해 대장균에서 폴리펩타이드와 같은 재조합 엘라스틴을 정제하는 것입니다. 이는 먼저 폴리펩타이드와 같은 재조합 엘라스틴을 발현한 대장균 세포에서 용해물을 수집하고 원심분리를 통해 불용성 세포 파편을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 소금이나 열을 첨가하여 폴리펩타이드와 같은 엘라스틴 전이를 유도하여 용해성 오염 물질을 제거하는 것입니다.

그런 다음 원심 분리에 의해 폴리펩티드 코트와 같은 엘라스틴을 수집하고 상등액을 버립니다. 이 단계를 핫 스핀이라고 합니다. 다음으로, 폴리펩타이드와 같은 재현유 엘라스틴 용액을 원심 분리기로 하여 불용성 오염 물질을 제거합니다.

상등액에 있는 폴리펩티드와 같은 용해성 엘라스틴은 유지되고 펠릿은 폐기됩니다. 이 단계를 콜드 스핀이라고 하며, 폴리펩티드와 같은 엘라스틴의 만족스러운 순도가 달성될 때까지 고온 및 냉간 스핀의 반복 주기를 반복합니다. 궁극적으로, 역 전이 사이클링은 다양한 생물 의학 응용 분야에 사용하기 위해 특성화할 수 있는 폴리펩티드 제품과 같은 순수한 엘라스틴을 생성합니다.

이 기술로 정제된 엘라스틴과 같은 폴리펩티드는 바이오센싱, 조직 공학 및 약물 전달을 포함한 여러 가지 유용한 응용 분야를 가지고 있으며, 폴리펩티드와 같은 엘라스틴의 전이 온도 및 생체 고분자 구조를 각 응용 분야에 맞게 특별히 조정할 수 있습니다. 먼저, 수반되는 텍스트 프로토콜에 설명된 조건을 사용하여 원하는 ELP 인코딩 플라스미드를 대장균에서 표현합니다. 인큐베이터에서 1리터 배양액을 섭씨 37도에서 24시간 동안 흔든 후 배양액을 1리터 원심분리기 병에 옮긴 다음 2000G에서 병을 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다.

다음으로 상등액을 버리고 소생합니다. 펠릿을 PBS 물 또는 기타 원하는 완충액에 총 부피 45ml까지 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮겼습니다.

세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 냉각되면 10초 켜기와 20초 끄기 주기로 총 9분 동안 초음파 처리합니다. 85와트의 출력 전력으로. 첫 번째 초음파 처리 후 약 10분 동안 샘플을 얼음 위에서 식힌 다음 9분 초음파 처리 주기를 반복합니다.

용해물을 50ml 원형 바닥 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 문화의 각 리터를 위한 양 폴리에틸렌 당 10%weight의 10%weight 2 밀리리터를 추가하고, 다음에 섞기 위하여 관을 동요하고, 16, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 GS에 관을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상등액을 깨끗한 50ml 원형 바닥 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.

ELP 전이를 유도하기 위해 샘플에 결정질 염화나트륨을 추가합니다. 소금이 용해되면 용액이 흐려지는데, 이는 용액에서 ELP의 상 분리를 나타냅니다. 그런 다음 16, 000 GS에서 샘플을 10분 동안 원심분리하여 ELP를 펠릿

실온에서 ELP 펠릿은 처음에는 불투명하게 나타나고 상층액을 버린 다음 냉각 후 원하는 완충액을 1-5 밀리리터 첨가 할 수 있습니다. ELP 펠릿은 반투명하고 갈색으로 나타날 수 있습니다. Resus는 튜브를 섭씨 4도에서 피펫팅하거나 회전시켜 펠릿을 현탁시킵니다.

다음으로, 재현탁된 ELP 용액의 1ml 부분 표본을 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 16, 000 GS에 4 섭씨 온도에 10 분 동안 관을 분리기를 설치하십시오. 그런 다음 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.

염화나트륨을 첨가하여 ELP 전이를 유도합니다. ELP가 소금만으로는 유도할 수 없는 높은 전이 온도를 갖는 경우 ELP 전이 온도보다 높은 온도에서 15분 동안 열 블록에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 ELP 전이 단계에 사용된 온도보다 높은 온도에서 10분 동안 16, 000GS에서 샘플을 원심분리합니다.

상등액을 버리고 펠릿이 다시 용해될 때까지 섭씨 4도에서 튜브를 피펫팅하거나 회전시켜 ELP 펠릿을 500 - 750마이크로리터의 원하는 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 16, 000 GS에 표본을 4 섭씨 온도에 10 분 동안 어떤 불용해성 오염물든지 펠릿 만들기 위하여 원심 분리하십시오. 그런 다음 스내트를 깨끗한 튜브로 옮기고 펠릿을 버리고 오염 물질 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 역전이 순환을 반복합니다.

이를 위해서는 일반적으로 2-5개의 사이클이 필요합니다. PBS 또는 기타 원하는 완충액에서 일련의 희석 ELP 용액을 준비합니다. 그런 다음 온도 제어 UV v 분광 광도계를 사용하여 분당 섭씨 1도의 속도로 샘플을 가열하면서 온도 범위에서 350나노미터의 광학 밀도를 측정합니다.

광학 밀도의 증가가 보이지 않으면 전이 온도가 상한 온도 한계를 초과할 수 있습니다. 다음으로, 분당 섭씨 1도의 냉각 속도에서 동일한 온도 범위에서 광학 밀도의 감소를 측정합니다. ELP 전이 플롯의 가역성, 광학 밀도 대 온도를 검증하기 위해 호모 폴리머 ELP의 전이 온도를 결정하십시오.

이 탁도 프로파일의 변곡점을 식별함으로써 여기에서 볼 수 있듯이 SDS 페이지에서 LP의 성공적인 정제를 확인할 수 있습니다. 초기 대장균 용해물에서 오염 물질의 수는 한 번의 역 전이 주기 후의 샘플에 비해 훨씬 더 많습니다. ELP 전이 온도는 ELP 호모 폴리머에 대해 온도 프로그래밍된 탁도에 의해 특성화됩니다.

탁도 프로파일은 광학 밀도의 급격한 증가를 나타내며, 이는 주어진 농도에서 전이 온도를 정의합니다. ELP 전이의 가역적 특성은 냉각 탁도 스캔으로 확인됩니다. ELP 다이 블록 공중합체는 호모 폴리머 LP보다 더 복잡한 탁도 프로파일을 나타냅니다.

그런 다음 동적 광 산란 측정을 수행하여 탁도 프로파일 파일에서 추론된 이러한 LP의 동작을 확인할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 역 전이 사이클링을 사용하여 대장균의 폴리펩타이드와 같은 재조합 엘라스틴을 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 아니 아니요.