높은 수익률 정화 변형체 falciparum의 Merozoites

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 인간 항체에 의한 옵소닌화의 정량화를 위해 순수한 plasmodium falciparum maites를 높은 수율로 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 E 64로 S schon 파열을 억제하여 멤브레인으로 둘러싸인 마이트 구조를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 유리 마이트를 수확한 다음 정량화를 위해 AUM 브로마이드로 염색하고, 최종 단계에서는 마이트를 다양한 인간 혈장 샘플 및 THP one 인간 단핵구와 함께 배양합니다.

궁극적으로, 서로 다른 인간 혈장 샘플에 의한 마이트의 옵소니화는 유세포 분석으로 구별될 수 있습니다. 말라리아 마이트에 대한 기능적 면역에 대한 기존 분석법과 비교했을 때 이 기술의 장점은 온전한 MES가 사용되고 식세포작용 반응이 강력하고 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 말라리아 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 백신 또는 자연적으로 노출된 개인에서 말라리아에 대한 면역을 위해 산화 항체 및 식균작용의 중요성은 무엇입니까?

E 64의 타이밍은 메조의 형성을 보장하는 데 필수적이므로 이 기술의 시각화는 매우 중요합니다. 그리고 메조 준비 및 계수는 기술적으로 까다롭기 때문에 말기 P falciparum Trophozoites의 자기 분리 후 100% 메탄올에 기생충의 얇은 얼룩을 10초 동안 고정하고 기자에서 3분 동안 염색하여 기생충 성숙을 평가합니다. 현미경으로 얼룩 슬라이드를 검사하여 기생충이 적혈구를 거의 채우고 초기 선 단계에 있는 것처럼 보이는지 확인합니다.

기생충이 적절한 성숙 단계에 도달하지 않은 경우 적절하게 발달할 때까지 계속 배양하십시오. 적절하게 성숙되면 분리된 shon을 10마이크로몰 E 64로 처리하고 6-10시간 동안 더 배양합니다. E 64로 배양한 후 처리된 기생충의 도말을 준비합니다.

슬라이드를 100% 메탄올로 고정하고 기자로 염색하여 기생충의 50% 이상이 막을 형성했는지 확인합니다. 동봉 된 마이트는 실온에서 1900 Gs에서 8 분 동안 나머지 E 64 처리 된 schon을 펠릿화합니다. 그런 다음 기생충을 실온 50ml에서 씻으십시오.

배지를 세척하여 남아 있는 인간 혈청을 제거합니다. 상층액을 버린 후, 기생충 펠릿을 2ml의 세척 매체에 재현탁시킨 다음 1.2 마이크로미터 주사기 필터를 통해 세포 현탁액을 여과하여 10 밀리리터 튜브에 마이트와 헤몬 결정을 수집합니다. 다음으로, 작은 자기 기둥을 자석에 부착하고 500 마이크로 리터의 THP 1 매체로 평형을 이룹니다.

여과액을 자기 기둥 위로 세 번 통과시켜 매번 흐름의 마이트를 수집합니다. 그런 다음 2ml의 실온으로 컬럼을 헹굽니다. THP one 매체는 남아 있는 마이트를 수집합니다.

헤민을 제거하는 것은 마이트를 정화하기 위한 중요한 단계입니다. 마이트가 헤민에서 분리되지 않으면 마이트 헤민 클러스터가 형성되어 유세포 분석에 의한 마이트 계수가 부정확해집니다. THP one cells con phagocytose hem hemin, 그래서 meite hemin 클러스터도 ceto가 될 수 있습니다.

따라서 헤민이 제거되지 않으면 테스트 중인 플라즈마의 옵소니징 전위도 과대평가됩니다. 수집된 마이트를 빛으로부터 보호된 실온에서 밀리리터당 10마이크로그램의 브로마이드로 염색합니다. 30 분 후, 마이 트를 스핀 다운하고 상층액을 적절한 폐기물 용기에 버리고 마이트 펠릿을 4 밀리리터의 THP 1 매체 펠렛 마이 트로 세척합니다.

그런 다음 resus는 빛으로부터 보호되는 15ml의 TP 매체에 세포를 현탁시킵니다. 유세포 분석법(flow cytometry)으로 마이트를 정량화합니다. 마이트는 100분의 1, 50분의 1, 25분의 1로 희석합니다.

먼저 940, 930 및 910 마이크로리터의 PBS와 BSA를 세 개의 다른 팩스 튜브에 분배하고 각 튜브에 각각 10, 20 및 40 마이크로리터의 정제된 마이트를 추가합니다. 다음으로, 와류 실온에서 30 초 동안 구슬을 계산 한 다음 희석 된 마이트가 들어있는 각 팩스 튜브에 50 마이크로 리터의 구슬을 추가합니다. 488 나노미터 레이저가 장착된 유세포 분석기에서 3개의 희석된 마이트 샘플을 실행하고, 아테륨 브로마이드 및 GFP 이중 형광 게이트를 기반으로 마이트에 대한 엄격한 게이트를 설정하고, 별도의 채널에서 비드를 게이트하고, 2000개의 비드가 수집될 때까지 이벤트를 획득합니다.

각 희석에서 마이트의 수를 정량화하려면 세 가지 마이트 농도 측정의 평균을 구합니다. 그런 다음 resus는 THP 1 매체의 밀리리터 당 6 마이트에 8 곱하기 10으로 마이 트를 현탁시켜 THP 1 세포 당 4 마이트의 최종 비율을 보장하여 마이 트의 phagocytosisis를 측정합니다. 첫 번째 펠릿, 분석을 위한 THP 1 세포를 충분히 펠릿화하고 THP 1 배지에서 밀리리터당 5번째 세포에 6.7 곱하기 10으로 현탁시킵니다.

다음으로, 150 마이크로리터의 THP에서, FCS에 테스트하기 위해 각 조건에 대해 웰당 1개의 셀이 3배로 차단되고, 96 웰 U 바닥 플레이트에서 최종 10 - 웰 당 5번째 셀 농도가 차단됩니다. 마이트를 추가할 때까지 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 그런 다음 150 마이크로 리터의 분리 된 마이 트를 8 곱하기 10 웰 농도에서 6 밀리리터 씩 별도의 FCS 차단 96 웰 U 바닥 플레이트에 추가하여 테스트 할 조건당 1 웰

준비된 희석된 혈장 샘플 10마이크로리터를 마이트의 각 웰에 추가하고 철저히 혼합하여 균일한 용액을 보장합니다. 그런 다음 THP의 각 웰에 50마이크로리터의 마이트 플라즈마 용액을 추가하고 테스트 중인 각 플라즈마 샘플에 대해 한 플레이트를 세 번 추가합니다. 샘플을 잘 혼합한 다음 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 덮인 공동 배양물을 5% 이산화탄소로 배양합니다.

40분 후, 식세포작용을 막기 위해 미리 냉각된 원심분리기에서 샘플을 스핀다운합니다. 그런 다음 두 번째 세척 후 얼음처럼 차가운 팩스 버퍼에서 셀을 두 번 세척합니다. 90마이크로리터의 팩스 고정제에 세포를 고정하고 얼음 위에 두십시오.

획득할 때까지 빛으로부터 보호됩니다. E 64 처리 전 기생충의 성숙 단계는 막으로 둘러싸인 마이트를 생성하는 데 중요합니다. 기생충은 크고, 적혈구를 거의 가득 채우고, 얼룩덜룩한 보석이 얼룩져 보여야 합니다.

이 단계에서 E 64를 추가하면 6-10시간 동안 배양한 후 멤브레인으로 둘러싸인 마이트가 생성됩니다. E 64가 영양동물에 더 일찍 첨가되면 기생충 병기 막으로 둘러싸인 마이트가 생성되지 않습니다. 나중에 E64를 schon schon schon 파열에 첨가하면 억제되지 않습니다.

높은 수준의 기생충 동기화가 필요합니다. 그렇지 않으면, aum 브로마이드 형광에 의한 E 64 처리 phagocytosis 측정이 GFP 형광 단독보다 기생충 phagocytosis의 우수한 해상도를 가능하게 한 후 설명된 세 가지 결과의 범위를 모두 볼 수 있습니다. TP one cell에 대한 maites의 비율을 높이면 THP one cell에 대한 maites의 부착력이 증가합니다.

마이트 특이적 항체가 없는 경우, MEITE 대 THP 1 세포 비율을 증가시키면 식세포작용이 0에서 78% 사이로 증가합니다.파푸아뉴기니 혈장 샘플을 사용하여 MAITE 대 THP 1 세포 비율로 마이트의 옵소니화가 관찰되었습니다. 이 데이터는 파푸아뉴기니를 대표하는 4명의 개인으로부터 PHA 산성 반응의 4사분위수의 예를 보여줍니다. 이 분석을 사용하여 측정된 옵소니징 항체는 이 절차를 시도하는 동안 말라리아에 대한 임상적 면역과 관련이 있는 것으로 나타났습니다.

성공적인 PE 세포를 만들기 위해 기억해야 할 핵심 사항은 완전히 성숙하고 온전한 마이트를 얻기 위해 고도로 동기화된 기생충을 보유하고, t HB one cell 배양을 적절하게 유지하는 것입니다. 이 절차에서 간략하게 설명된 meite 정제 기술은 marizone, invasion, assay, proteomics, 또는 serology와 같이 고품질 말라리아 마이트를 필요로 하는 모든 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 E 64 방법을 사용하여 마이트를 정제하고 THP one 세포에 의한 식균작용을 측정하여 옵소니징 항체를 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.