종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사​​용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

다음 실험의 전반적인 목표는 고처리량 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 명시야 현미경으로 촬영한 3차원 종양 스페로이드의 크기를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 3D 종양 스페로이드가 포함된 모든 이미지를 해당 스페로이드 크기 측정 프로그램에 맞는 올바른 디렉토리 구조와 파일 이름으로 정리합니다. 두 번째 단계로, 스페로이드 크기 측정 프로그램이 능동 윤곽 알고리즘(active contour algorithm)을 기반으로 스페로이드의 경계를 자동으로 계산하고 스페로이드의 크기를 측정합니다.

다음으로, 모든 이미지에서 최적의 결과를 보장하기 위해 정교하게 설계된 품질 관리 검토를 수행합니다. 데이터 내의 결과를 분석하면, 실험적 처리에 따른 3D 스테로이드의 성장을 규명할 수 있습니다. 이 컴퓨터 프로그램의 주요 장점은 강력한 자동 이미지 분석 알고리즘과 품질 관리 워크플로우를 통합하여 고처리량 이미지 분석을 지원한다는 점입니다.

이 소프트웨어는 불균일하거나 노이즈가 있는 이미지 배경을 허용합니다. 이는 노동력을 현저히 줄여주며 분석 프로세스의 속도를 높여줍니다. 이 소프트웨어를 도입하는 것은 3D 종양 스페로이드가 산업계와 학계 모두에서 약물 스크리닝을 위한 일상적인 in vitro 모델로 자리 잡는 데 유익합니다.

Sphe sizer를 사용하려면 신호 처리 및 이미지 처리 툴박스가 포함된 MATLAB이 필요합니다. 선택적으로 병렬 처리 툴박스를 사용할 수 있습니다. Rutgers 서버에서 OID sizer를 다운로드하여 설치 디렉토리에 압축을 푸십시오. 이 디렉토리는 이후 단계에서 필요합니다. 이제 이미지를 준비하십시오.

먼저, 이미징 시스템의 이미지 해상도와 픽셀당 마이크론 단위의 이미지 절대 스케일을 결정하십시오. 최종적으로 실험에 사용되는 각 이미지의 스케일은 모두 동일해야 합니다. 독점적인 이미지 파일 형식은 TIFF나 jpeg와 같이 범용적으로 수용되는 파일 형식으로 반드시 변환하십시오.

이제 소프트웨어에서 요구하는 특정 파일 이름과 디렉터리 구조를 사용하여 파일을 저장하십시오. 파일 이름은 플레이트, 행, 열별로 지정해야 하며, 파일 디렉터리는 디렉터리당 하나의 실험으로 구성하고 실험 내 각 시점(time point)에 대해 단일 하위 디렉터리를 배치해야 합니다. 특정 시점의 모든 플레이트에서 얻은 모든 이미지는 동일한 하위 디렉터리를 공유해야 합니다. 먼저 MATLAB을 실행하고 명령 창에서 sphe sizer의 설치 디렉터리로 이동하십시오.

그런 다음 Sphe sizer one zero를 입력하고 return 키를 눌러 이 OID sizer 프로그램을 실행합니다. 이제 새 창에서 browse 버튼을 클릭하고 실험의 모든 이미지가 준비된 디렉토리를 선택하십시오. 그런 다음 폴더 텍스트 필드에서 품질 관리를 위해 include sub folders 토글을 선택하십시오.

실시간 표시(on the fly display) 옵션을 선택하십시오. 다음 단계는 이미지의 해상도를 지정하는 것이며, 이는 프로그램이 픽셀을 밀리미터(mm)로 정확하게 변환하기 위해 반드시 수행되어야 합니다. 이 시점에서 사용자는 고급 메뉴로 진입하여 이 특수 색상 상자의 더 많은 설정에 접근할 수 있습니다.

8비트 또는 16비트 이미지인 경우 'none'으로 둡니다. 이미지가 12비트로 캡처된 경우, 12비트를 선택하십시오.

모든 설정이 적절하게 완료되면, 전체 이미지 세트에 대해 계산이 수행되므로 'compute'를 클릭하여 계산을 시작합니다. 계산이 완료되면 개별 분할 결과가 소프트웨어에 즉시 표시되며, 결과 테이블에는 분석된 모든 구체에 대한 폴더 파일 볼륨, 길이, 너비 및 유효성 토글(valid toggle)이 표시됩니다. 유효성 토글은 품질 관리를 위한 것입니다.

사용자가 결과 테이블의 임의의 셀을 클릭하면, 검토를 위해 원본 이미지와 품질 관리 이미지가 오른쪽에 표시되며, 키보드의 아래쪽 화살표를 사용하여 모든 이미지를 순차적으로 조사하십시오. 의심스러운 스페로이드 경계가 발견되면, 원본 이미지에서 'manual initialize'를 클릭하여 이를 정교화하십시오. 타원 도구를 드래그하여 스페로이드를 더 정확하게 덮으십시오.

결과 표에서 측정값이 그에 맞게 업데이트됩니다. 수동 초기화로 원하는 스테로이드의 최적 경계를 찾는 데 실패한 경우, hand draw 버튼을 사용하여 원본 이미지를 표시하고 스테로이드의 경계를 직접 추적하십시오. 이미지에 유효한 스테로이드가 포함되어 있지 않은 경우, 해당 이미지의 valid 토글 체크를 해제하십시오.

품질 관리가 완료되면, 결과 포맷(format results) 상자를 클릭하여 결과를 저장하십시오. 내보내는 파일 이름은 고급 옵션(advanced to option) 창에서 설정할 수 있습니다. 리스트 출력 파일은 모든 측정값이 포함될 수 있는 탭 구분 표 형식입니다.

출력 파일 형식은 탭으로 구분된 테이블이며, 쉽고 시각적인 다운스트림 데이터 분석을 위해 부피 값을 원래의 플레이트 형식으로 정리합니다. Sphe sizer는 다양한 불리한 이미지 조건에서도 이미지 상의 구체 경계를 견고하게 검출할 수 있습니다. 때때로 이러한 OID가 부적절하게 검출되는 경우가 있으며, 이때는 사용자가 해당 스테로이드의 위치와 크기를 수동으로 적절하게 정의할 수 있는 수동 초기화 도구를 통해 해결할 수 있습니다.

극단적인 경우, 자동 방식이나 수동 초기화 도구로는 방해 요소가 많고 노이즈가 심한 배경으로부터 스테로이드를 정확하게 분할하지 못할 수 있습니다. 이러한 경우, 프로그램은 사용자가 스테로이드 경계를 직접 그려 정확한 종단 및 부피 측정값을 생성할 수 있도록 지원합니다. 소프트웨어의 효율성은 동일한 288장의 이미지 세트를 대상으로 수동 분석과 싱글 코어 및 멀티 코어 컴퓨터를 이용한 분석을 비교함으로써 검증되었습니다.

소프트웨어의 재현성을 입증하기 위해 스테로이드 측정기(steroid sizer)를 사용한 이미지 분석 결과, 이미지당 분석 속도가 수동 측정보다 18배 이상 빠른 것으로 나타났습니다. 24개의 스테로이드 세트를 각 방법으로 3회씩 분석하였습니다. 녹색으로 표시된 스테로이드 측정기는 수동 분석보다 측정값의 표준 편차가 더 작게 나타났습니다.

스테로이드 사이즈 측정 도구의 도움으로 가능해진 실험에서, HSP 90 억제제 및 cladribine 처리 시 스테로이드의 종양 성장을 관찰하였습니다. 결과에 따르면 병용 요법이 in vivo에서 항종양 효과를 나타낼 수 있음이 확인되었습니다. 본 연구는 3D 종양 스테로이드의 크기를 정확하게 측정하기 위한 신속하고 유연하며 효과적인 프로그램을 제시합니다.

ster size 프로그램은 사용법이 간단하며 사용자 입력이 최소한으로 필요합니다. 이 절차를 수행할 때 스테로이드가 벽면 가장자리에 닿지 않고 시야 중심에서 촬영되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 모든 이미지는 동일한 대물렌즈 하에서 캡처해야 하며, 모든 파일은 프로토콜에 명시된 대로 정확하게 이름이 지정되고 배열되어야 합니다.