Name: 가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐트 표면에서 혈관 유전자 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 학습하세요 쥐의 총경동맥에 유전자 방출 스텐트를 이식하고 생체 발광 이미징으로 형질전환 발현을 평가하는 방법을. 이 기술은 혈관 유전자 치료 및 스텐트 설계 최적화에 활용됩니다.

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저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

<ol><li>Boeckle, S., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+targeted+gene+delivery%3A+chemical+modification+of+viral+vectors+and+synthesis+of+artificial+virus+vector+systems%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems.</a> AAPS J. 8, E731-E742 (2006).</li>
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</ol>

이 논문에 제시된 프로토콜 개발 및 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금(IF 0735110N 및 MC 10SDG4020003), 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 보조금 HL 72108(RJL) 및 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 T32 007915(SPF)의 지원을 받았습니다. 혈관성형술 카테터는 NuMED(Hopkinton, NY)에서 친절하게 기증했습니다. 저자는 수잔 컨스 씨의 비서 지원에 감사를 표합니다.

<html> 제시된 프로토콜은 스테인레스 스틸 표면 무 코팅하는 아데노 바이러스 벡터를 통해 달성 가역적 부착 기판 매개 된 유전자 전달에 대한 동작 방법을 설명한다. 혈관 재 협착의 스텐트 기반 유전자 치료의 특정 목적을 위해 개발 된 반면,이 기술은 생체 재료, 바이오 메디컬 임플란트 및 유전자 치료 등의 분야에서의 더 넓은 응용을 갖는다. 제시된 연구는 유일하게 원형 금속 기판으로 스테인레스 스틸을 사용하고 있지만, PABT는 비교 친화력 코발트 / 크롬과 니티놀과 같은 다른 금속 합금을 결합 (게시되지 않습니다). 금속과 PABT의 indiscriminant 상호 작용은 크게이 기술 31에 대한 잠재적 인 생물 의학 응용 프로그램의 수를 확장합니다. 또한, HC-닿는 유전자 벡터의 사용은, 소재 표면에 티올 설치하는 다른 방법을 필요이라도 다른 종류의 생체 물질과 가능하다. 광고 유전자 벡터, 사람의 세포 유형과 조직에 강력한 전달을 달성하는 ...

치료 적 양상과 같은 유전자 치료의 효과는 유전자 치료 벡터의 1,2 나쁨 타겟팅 용량에 의해 방해된다. 목표 위치에 유전자 발현의 하위 치료 수준에서 적절한 타겟팅 결과 부족하고, 벡터 및 부호화 치료 제품 4 모두에 대하여 면역 반응을 마운팅 할 책임을 포함한 비 - 표적 기관 03 행 벡터의 넓은 보급에 이르게 5. 하나의 가능성은 전달의 성행위를 상쇄하고 타겟팅 혈액과 림프를 통해 자신의 무료 보급을 배제 형태로 원하는 위치에 유전자 벡터를 소개하는 홍보하는 것을 의미한다. 전형적으로, 이러한 노력들은 물리적 번째 포획하여 주사 부위에서 일시적으로 유지하는 유전자 벡터 수있는 피브린, 콜라겐이나 히알루 론산 하이드로 젤 매트릭스 6-10과 혼합 바이러스 성 또는 비 바이러스 벡터 중 구성된 국소 주사 전달 시스템에 의존고분자 네트워크의 그들. 지역화 된 유전자 치료를위한 또 다른 일반적으로 인정 패러다임 주입 보철 장치 (11, 12)의 표면에 유전자 벡터의 고정화를 이용한다. 영구 이식 의료 (혈관, 기관지, 비뇨기과 및 위장 스텐트, 심장 박동기, 인공 관절, 수술 및 부인과 메시, 등.) 환자 13 수천만에서 연간 사용됩니다. 일반적으로 효과가 있지만,이 장치는 부적절 현재의 의료 관행 14-17에 의해 제어되는 합병증하는 경향이 있습니다. 이식 보철 장치는 현지화 된 유전자 치료 치료를위한 프록시 플랫폼 역할을 할 수있는 특별한 기회를 제공하고 있습니다. 약동학 관점 파묻혀의 동력학을 임플란트 / 조직 인터페이스 유전자 벡터의 높은 지방 농도 모두를 달성하고 둔화 유전자 벡터 결과 비교적 낮은 입력 용량 의료 임플란트 표면에서 유도화이 위치에서 R 제거. 대상 세포 인구에 의해 연장 된 거주지의 결과 및 향상된 흡수으로, 벡터 고정화는 유전자 벡터의 확산을 최소화 할 수 있습니다. 따라서, 비 표적 조직의 부주의 접종이 감소된다. (또한 기판 매개 유전자 전달 또는 고상 유전자 전달 되나) 이식 생체 재료에 유전자 벡터의 표면 테 더링 사용 세포 배양 및 동물 실험에서 구현되었습니다 모두 특정 (항원 - 항체 18-20, 아비딘 - 비오틴 21, 22) 그리고 23 ~ 26 (요금, 반 데르 발스) 상호 작용 비특이적. 표면이 지나치게 강한 결합이 표적 세포로 내재화 벡터 배제 이후 주입 장치의 표면에 벡터의 공유 결합은 이전에 비 기능적으로 간주되어왔다. 최근이 제한 TET로서 사용 자발적 가수 분해성 가교제의 사용을 통해 극복 될 수 있다는 것을 입증했다아데노 바이러스 벡터의 27,28 스텐트 및 캡시드 단백질의 변성 금속 표면 사이 그녀. 또한, 벡터 방출률 및 생체 외 및 생체 내에서 유전자 발현의 시간 경과 (28)의 가수 분해 반응 속도를 나타내는 다른 가수 분해성 가교제를 이용하여 변조 될 수있다. 본 논문은 활성화 된 금속 표면에 아데노 바이러스 벡터의 가역적 공유 결합에 대한 상세한 프로토콜을 제공하고 스텐트 혈관 성형술의 쥐 경동맥 모델에서 배양 평활근 및 내피 세포 및 생체 내에서 시험 관내에서 이어지는 전달 사건을 연구하는데 유용한 실험 구성 소개 .

<table><tbody><tr><td>316 스테인레스 스틸 메쉬 디스크</td><td>Electon 현미경 과학</td><td>E200-SS</td><td></td></tr><tr><td>일반 304 등급 스테인레스 스틸 스텐트</td><td>레이저</td><td>사용자 정의 주문</td><td></td></tr><tr><td>AdeGFP</td><td>펜실베니아 대학교 벡터 코어</td><td>AD-5-PV0504</td><td></td></tr><tr><td>AdLuc</td><td>펜실베니아 대학교 벡터 코어</td><td>AD-5-PV1028</td><td></td></tr><tr><td>AdEMPTY</td><td>University of Pennsylvania Vector Core</td><td>A858</td><td></td></tr><tr><td>Cy3(NHS)2</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23000</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>UV 96-well plates</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometry 96-well plates</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 96-웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>20290</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-LC-SPDP</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>21650</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>분광 플루오미터</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>1575R</td><td></td></tr><tr><td>수평 공기 흐름 오븐</td><td>Shel Lab</td><td>1350 FM</td><td></td></tr><tr><td>Centra-CL2 원심분리기&nbsp;</td><td>International Equipment Company</td><td>426</td><td></td></tr><tr><td>디지털 소용돌이 믹서기</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE300 형광 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>DC 500 CCD 카메라</td><td>Leica</td><td>DC-500</td><td></td></tr><tr><td>7500 Real-Time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>사용할 수</td><td></td>없음</tr><tr><td>IVIS Spectrum 생물 발광 스테이션</td><td>Perkins-Elmer</td><td>사용할 수</td><td></td>없음</tr><tr><td>EDTA 디칼륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V (BSA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 펜치</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>A10 세포주&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1476</td><td></td></tr><tr><td>소 대동맥 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>BW-6002</td><td></td></tr><tr><td>루시페린, 칼륨 염</td><td>금 생명 공학</td><td>LUCK-1GE</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘 없음 PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>쌍둥이 자리 바이오 제품</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>Gibco</td><td>11540-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>Corning cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 마이크로 키트</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green PCR 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cephazolin&nbsp;</td><td>Apotex는</td><td>사용할 수</td><td></td>없습니다</tr><tr><td>Loxicom (Meloxicam)</td><td>Norbrook</td>은 <td>사용할 수</td><td></td>없습니다</tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals는</td><td>사용할 수</td><td></td>없습니다</tr><tr><td>Ketavet(케타민)</td><td>VEDCO</td><td>는 사용할 수</td><td></td>없습니다</tr><tr><td>Anased (Xylazine)&nbsp;</td><td>Lloid</td><td>사용 불가</td><td></td></tr><tr><td>Forane (Isoflurane)&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>는 사용할 수</td><td></td>없음</tr><tr><td>곡선 Moria 홍채 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>곡선 극세 Graefe 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 봉합사 (5-0)</td><td>Ethicon</td><td>J385</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 실 (4/0 실크)&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Michel 봉합사 클립</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>상처 확장기 (Lancaster eye specula)KLS</td> <td>Martin</td><td>34-149-07</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Michel 봉합사 클립 애플리케이터</td><td>Fine Science Tools</td><td>112028-12</td><td></td></tr><tr><td>Insyte Autoguard 24 G IV 카테터</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>2F Fogarty 카테터</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>120602F</td><td></td></tr><tr><td>테프론 튜빙</td><td>Vention</td><td>041100BST</td><td></td></tr><tr><td>PTA 카테터</td><td>NuMed</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>거즈 패드</td><td>Kendall Healthcare</td><td>9024</td><td></td></tr><tr><td>Cotton 애플리케이터</td><td>Solon Manufacturing</td><td>WOD1003</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Baxter</td><td>281321</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기 (Luer-Lok)</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기 (Luer-Lok)</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>클리퍼스 #40 블레이드</td><td>Oster&nbsp;</td><td>78005-314</td><td></td></tr><tr><td>Transpore 수술 테이프</td><td>3M</td><td>MM 15271</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 수의사 연고</td><td>Pharmaderm</td><td>을 사용할 수</td><td></td> 없습니다</tr></tbody></table>.

가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐​​트 표면에서 혈관 유전자 전송

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

스텐트 재 협착 널리 관상 동맥 및 말초 동맥의 매우 좁은 부분을 통해 다시 설정 혈액의 흐름에 사용되는 스텐트 기반 재 시술 절차의 주요 합병증을 선물한다. 대안 전략을 제시 할 수있다 방지 재 협착 활성 유전자의 조정 릴리스 할 수있는 혈관 내 스텐트는 현재 약물 방출 스텐트를 사용합니다. 일반적으로 벡터의 물리적 포획을 위해 사용되는 폴리머 코팅과 관련된 과도한 염증 반응을 피하면서 임상 변환을 달성하기 위하여, 유전자 스텐트는 스텐트 고정화 유전자 벡터 방출 및 혈관의 부위 - 특이 적 전달의 예측 동력학을 나타낸다한다. 이 논문은 비스포스포네이트 (PABT)이 가수 분해 가교제 (HC)를 통해 스테인리스 표면을 개질 된 폴리 알릴 아민하는 아데노 바이러스 입자의 가역적 인 결합을 기반으로 스텐트에 아데노 바이러스 유전자 벡터의 무 코팅 테 더링에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 의 가족5 내지 오십일 레인 징의 쇄상 에스테르 가수 분해의 평균 t와 2 관능 성 (아민 - 및 티올 - 반응성) HC는 스텐트 벡터를 연결하기 위해 사용되었다. 벡터 고정화 절차는 일반적으로 9 시간 이내에 수행하고 여러 단계로 구성된다 : PABT (4 시간)의 수용액에 금속 샘플 1) 배양; 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (20 분 간격)으로 설치 PABT 티올 기, 2) 탈; 피리 딜 디티 (PDT) 그룹 (2 시간)과 폴리에틸렌 이민 유도체와 샘플을 반응시켜 금속 표면의 반응성 티올 용량 3) 확장; 디티 오 트레이 톨 (10 분)에 PDT와 티올 기의 4) 변환; HC (1 시간)와 아데노 바이러스의 5) 수정; 크기 배제 칼럼 크로마토 그래피 (15 분) 및 티올 철강 표면 (1 시간)에 티올 반응성 아데노 바이러스 입자의 7)에 의해 수정 고정화 아데노 바이러스 입자의 6)의 정제. 이 기술은 스텐트를 넘어 폭 넓은 잠재적 인 응용 성을 가지고주입 된 이물질 인터페이싱 세포 기질 - 매개 유전자 전달을 통해 자신의 생체 적합성을 향상시키기 위해 판막 장치의 표면 공학을 촉진시켜.

벡터 출시 실험 이러한 혈관 내 스텐트 같은 중재 장치를 포함하는 임플란트의 표면에 아데노 바이러스 벡터의 테 더링 부분적 벡터 &#39;물리적 타겟팅의 부족을 미연에 방지, 질병 사이트 벡터 가깝다. 그러나, 표적 조직의 형질 도입을 통해 치료 효과를 달성 할 수 있도록, 벡터는 표면 (도 2)로부터 방출되어야한다. 가수 분해성 가교제의 사용은 가교 결합제의 가수 분해에 의해 매개되는 한 벡터의 효과적인 부착 변성 polybisphosphonate하는), 티올 설치된 금속 임플란트 및 2) 서방 있도록 가정 하였다. 유도체 화 과정의 끝에서 메쉬 디스크와 연관된 광고 eGFP는 벡터의 게놈 사본 수는 eGFP는-특이 적 프라이머 (도 3)와 바이러스 DNA의 PCR에 의해 결정된다. 에 따라특정 가교 결합제는 결합...

이 연구는 스텐트의 코팅이 없는 금속 표면에 아데노바이러스 유전자 벡터의 가역적 부착을 보고하고 메쉬 디스크를 모델링합니다. 벡터 고정화에 사용되는 cross-linker의 가수분해에 따라 transduction-competent 바이러스 입자가 지속적으로 방출되면 혈관 세포와 스텐트 동맥에서 내구성 있는 부위 특이적 transgene 발현이 발생합니다.

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

이 절차의 전반적인 목표는 실험용 쥐의 총경동맥에 유전자 방출 스텐트를 삽입하고, 시간에 따른 형질전환 유전자 발현의 범위와 위치를 결정하는 것입니다. 이를 위해 외경동맥 분지에서 동맥 절개술을 시행하여 총경동맥으로의 혈관 접근 경로를 확보합니다. 팽창된 2 French Fogarty 카테터를 총경동맥 전체에 통과시켜 내피세포를 제거하고 중막층에 손상을 입힙니다.그 후, 풍선 손상된 총경동맥의 중간 분절에 삽입된 혈관 성형술 카테터에 유전자 방출 스텐트를 장착하고 최종적으로 전개하여 동맥의 루시페라아제 발현을 확인합니다. 오닉 젤과 함께 제형화된 루시페린을 혈관 주변 부위에 도포하고 생체 발광 이미징을 수행합니다. 최종적으로, 혈관 조직 형질전환의 범위와 지속 기간 측면에서 서로 다른 유전자 방출 스텐트 제형을 비교할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.유전자 치료를 통해 즉각적인 재협착 및 스텐트 혈전증을 예방하는 것의 장점은 바이알 벡터와 스텐트 삽입 동맥으로부터 외인성 유전자 발현을 모니터링하는 가장 직접적인 방법이라는 점입니다. 아데노바이러스 벡터를 스텐트에 결합시키는 당사의 전략은 완전히 이해 가능하며, 쥐의 스텐트 삽입 수술 절차에 대한 텍스트 상의 세부 사항 또한 명확합니다. 시각적으로 시연될 때, 동봉된 서면 문서에 기술된 대로 루크(Luke) 누락 스텐트를 준비하여 추가하십시오.바이러스 유도 스텐트를 사용 전 4°C의 멸균 PBS에 24시간 이내로 보관하십시오. 수컷 Sprague Dawley 쥐를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기 반응과 근육 긴장도를 통해 마취 깊이를 확인하고 목과 상흉부 부위를 제모하십시오. 공막의 건조를 방지하기 위해 안과용 수의 연고를 도포하고, 항생제, 진통제 및 식염수를 투여하십시오.다음으로, 24 gauge 카테터를 사용하여 꼬리 정맥에 카테터를 삽입하고 무균적으로 헤파린을 투여합니다. 포비돈과 에탄올로 목과 상흉부 부위를 소독합니다. 그런 다음 머리가 시술자를 향하도록 동물을 仰臥位(supine)로 눕힙니다.그런 다음 메스를 사용하여 멸균 드레이프를 덮습니다. 피부와 목 근막을 따라 정중선 절개를 수행합니다. 둔성 박리법을 사용하여 왼쪽 외경동맥을 분리합니다.이 절차에서 가장 중요한 부분은 절제술을 위해 동맥을 준비하는 것입니다. 이를 위해 외경동맥을 분리하고 주변 조직을 깨끗이 제거하십시오. 접근 가능한 가장 원위부 지점에서 외경동맥을 결찰하십시오.그런 다음 내경동맥의 기시부에 4-0 실크로 슬라이딩 임시 결찰을 실시합니다. 다음으로, 스프링 가위를 사용하여 절개창을 통해 좌측 외경동맥에 2 mm의 동맥 절개를 가합니다. 총경동맥에 2 French Fogerty 카테터를 삽입합니다.카테터 팁을 식염수로 팽창시킵니다. 그다음 내피를 제거하기 위해, 팽창된 풍선을 대동맥궁에서 경동맥 분지점까지 세 번 통과시킵니다. fogerty 카테터 위로 튜브 조각을 밀어 넣어 총경동맥 내부로 삽입합니다.Fogarty 카테터 마운트와 크림프를 제거하고 1.5 millimeter 직경의 혈관성형술 카테터 풍선 위로 Luke Derivate 스텐트를 장착합니다. 테플론 튜브를 통해 스텐트를 삽입하고 총경동맥의 중간 분절까지 전진시킵니다. 이때 스텐트가 튜브나 혈관벽에 마찰되지 않도록 주의하십시오.스텐트를 배치하려면, 혈관 성형술 카테터를 디플레이터 압력계에 연결하고 12 atmospheres 압력을 30초 동안 가합니다. 혈관 성형술 카테터를 제거합니다. 그다음, 동맥 절개 부위의 근위측에서 외경동맥을 결찰하고, 내경동맥에 묶어두었던 임시 결찰사를 풉니다.4-0 Vicryl 봉합사로 연속 봉합하여 수술 부위를 층별로 봉합하고 피부를 스테이플러로 고정합니다. 동물이 다시 움직일 수 있을 때까지 회복을 위해 가온 패드 위에 둡니다. 그 후 동물을 개별 케이지로 돌려보냅니다.수술 후 12시간이 지나면 일반적으로 동물이 통증이나 불편함의 징후를 보이지 않지만, 스텐트 배치 후 1일부터 3주 사이의 시점에 따라 meloxicam 치료를 72시간까지 연장하는 것을 고려하십시오. ivus spectrum 장비용 living image version 4.2 이상의 소프트웨어를 실행하여 생물발광 이미징을 준비하십시오.이미징 하드웨어의 초기화에는 약 10분이 소요됩니다. 다음으로, PBS에 녹인 50 mg/mL Lucifer와 PBS에 녹인 25%onic F1 27을 1:4 부피비로 혼합하여 준비한 뒤 얼음 위에 보관하십시오. 해당 용액은 점성이 있어야 합니다.isof fluorine로 쥐를 마취하고 마취 깊이를 확인한 후, 무균적으로 수술용 스테이플을 제거합니다. 수술 부위를 준비하고 수술 상처를 다시 엽니다. meloxicam 3 mg/kg을 피하 투여하고, 둔성 박리를 통해 왼쪽 총경동맥에 다시 접근하여 미주신경 및 인접 결합 조직으로부터 이를 분리합니다.피펫을 사용하여 냉각된 luciferian onic 혼합물 200 µL를 노출된 총경동맥 부위에 직접 도포합니다. 37 °C의 조직과 접촉하면 용액이 젤 형태로 변해야 합니다. 다음으로, 동물을 ivus spectrum 장치의 이미징 챔버 내에 앙와위로 배치하고, isof fluorine 마취를 유지하기 위해 안면 마스크를 씌웁니다.그런 다음 소프트웨어의 획득 제어 패널 창의 시야 드롭다운 메뉴에서 물체와 카메라 사이의 거리가 6.6 centimeter인 위치 B를 선택하고, binning을 선택한 후 binning 인자를 medium으로 설정하십시오. 이어서 피사체 높이 상자에 2.5 centimeters를 입력하고 노출 시간 상자에 시간 단위로 minutes를 선택한 뒤 수치 2를 입력하십시오.쥐의 목과 상흉부가 챔버 바닥에 투영된 정사각형 영역 안에 완전히 들어오도록 동물의 위치를 조정합니다. 루시퍼린(Luciferin) 젤을 도포하고 3분 후에 화면의 획득(acquire) 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 획득 시간은 예상되는 신호 강도에 따라 1분에서 6분까지 달라질 수 있습니다.이미지를 획득한 후, 주사기를 사용하여 식염수로 겔을 씻어내고 멸균 거즈와 면봉으로 동맥 주변 공간을 닦아냅니다. Vicryl 봉합사로 상처를 봉합하고 피부를 스테이플러로 고정합니다. 그 다음 동물이 회복될 때까지 기다린 후 케이지로 돌려보냅니다.이전과 동일하게, 일정 시간이 경과한 후 이미징 절차를 반복합니다. 이는 전신 투여를 위해 스텐트에 고정된 아데노바이러스 벡터에 의해 유도된 동맥 발현의 시간 경과를 연구하기 위함입니다. 동물을 마취하고 준비시킨 후, PBS에 Lucifer 50 mg/mL 용액을 조제합니다.이전과 마찬가지로 24 gauge 카테터로 꼬리 정맥에 카테터를 삽입하고, 꼬리와 카테터 사이에 수술용 테이프를 붙여 고정합니다. 그런 다음 테이프의 가장자리를 위로 접어 꼬리에 여러 번 감습니다. 주사 1분 후, 카테터를 통해 용액 1 mL를 10초에 걸쳐 주입합니다.이미지 획득을 시작합니다. 이전과 마찬가지로, 10초보다 빠른 주입 속도는 발작 활동 및 호흡 정지를 유발할 수 있음에 유의하여 서로 다른 가수분해 가교제의 사용과 관련된 잠재적 영향을 조사하십시오. 동맥 전도 시, 동물에게 Luke eluding 스텐트를 삽입하였으며 스텐트 배치 후 1일 및 8일째에 이미징을 수행하였습니다.스텐트 삽입 하루 후의 결과를 보면, 빠르게 가수분해되는 가교제로 제조된 add, Luke 스텐트로 처리한 동물이 일반적으로 가장 높은 발광 신호를 나타냈습니다. 중간 속도로 가수분해되는 가교제로 처리한 쥐가 그다음으로 높은 발광 신호를 보였으며, 느리게 가수분해되는 가교제로 제조된 스텐트가 그 뒤를 이었습니다. 가수분해되지 않은 가교제로 tethered add Luke를 사용하여 준비한 스텐트를 삽입한 쥐 그룹에서는 인지할 수 있는 신호가 관찰되지 않았습니다. 이는 혈관 조직의 효과적인 형질전환을 위해 스텐트로부터 벡터가 방해 없이 방출되는 것이 중요하다는 점을 강조합니다.8일 차에 RHC로 제조된 스텐트의 루시퍼레이스(luciferase) 발현 평균 강도는 수 배 감소했습니다. 1일 차와 8일 차의 강도를 로그 스케일로 각각 도식화했을 때, 중간 속도로 가수분해되는 가교제로 제조된 스텐트에서는 1.4배 증가가 관찰되었고, 느리게 가수분해되는 가교제로 제조된 스텐트에서는 1.8배 증가가 관찰되었습니다. 이러한 결과는 스텐트 표면으로부터의 벡터 방출 속도가 더 느린 유전자 용출 스텐트가 더 지속적인 혈관 형질전환을 유도한다는 가설과 일치합니다.이 영상을 시청하고 나면, 후경동맥에 add Luke alluding 스텐트를 삽입하는 방법과 스텐트 배치 후 뒤따르는 루시퍼라제(luciferase)의 혈관 발현을 이미지화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 스텐트 배치 수술은 20~25분이 소요되며, 이미징 절차는 10~15분이 소요될 수 있습니다. 우리는 동일한 기술을 사용하여 동맥 폐쇄 정도를 결정함으로써 유전자 치료 제형 및 비유전자 약물의 항혈전 효과를 연구합니다.스텐트 삽입 2주 후.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

허혈성 심장 마비의 치료를위한 유전자 전달의 방법은 심근 경색의 돼지 모델을 사용하여 설명합니다. 우리 간단하고 재현성 방법은 우리가 쉽게 매우 간단하고 재현성 방법으로 다양한 유전자 전송의 효능을 평가할 수 있습니다.

잠복기 모델에서 허혈성 심장 마비에 대한 유전자 전송

우리는 생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 혈관 신생을위한 치료 인자를 과발현 프로그래밍 줄기 세포의 제조 방법을 설명한다. 설명 과정은 체외에서 지방 유래 줄기 세포를 형질 전환하고, 쥐의 뒷다리 허혈 모델에서 혈관 신생을 촉진하기 위해 프로그램 된 줄기 세포의 효능을 검증 고분자 합성 (가) 있습니다.

생분해 성 고분자 나노 입자를 사용하여 치료 혈관 신생에 대한 프로그래밍 줄기 세포

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

이 메서드는 transgene 토끼 경 동맥의 내 피에 소개 하는. 소개는 transgene의 transgene 제품 정상적인 동맥 또는 질병 모델에서의 생물학적 역할의 평가 허용 한다. 방법은은 DNA 규제 시퀀스의 활동을 측정 하기 위한도 유용 합니다.

Vivo에서 토끼 일반적인 경 동맥 내 피에 유전자 이동

이 방법은 토끼에 개재 정 맥 이식의 배치, 이식, 변환 및 내구성 transgene 식의 성과 설명합니다. 이로써 transgenes 이식할된 혈관에 단백질 제품의 생리 및 병 적인 역할 및 정 맥 이식 질병에 대 한 유전자 치료의 테스트의 조사.

일반적인 경 동맥 중재 이식 정 맥 경에서에서 튼튼한 Transgene 식의 토끼 모델

이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.

돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.

차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

이 프로토콜은 AAV8 전달 small hairpin RNA의 intrasplenic injection이 어떻게 문맥 주사와 동일한 유전자 knockdown 효율을 간에서 달성하는지 설명하며, 이는 수술 전후 및 수술 후 사망률과 합병증이 훨씬 낮은 더 간단한 절차를 나타냅니다.

아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)로 전달되는 작은 헤어핀 RNA의 비장내 주입을 통한 간의 효율적인 유전자 녹다운

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

학습하세요 쥐의 총경동맥에 유전자 방출 스텐트를 이식하고 생체 발광 이미징으로 형질전환 발현을 평가하는 방법을. 이 기술은 혈관 유전자 치료 및 스텐트 설계 최적화에 활용됩니다.

가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐​​트 표면에서 혈관 유전자 전송

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가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐트 표면에서 혈관 유전자 전송