Name: 공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: 학습하세요 공초점 및 다중광자 현미경을 이용한 5색 형광 단백질 표지 조혈 줄기세포와 전구세포의 생체 내 클론 추적 방법입니다. 고해상도 3D 영상 재구성으로 혈액 생성 과정에서 세포 계보 변화를 실시간 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐, 혈액 연구소(National Heart, Lung, Blood Institute)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 5개의 LeGO 벡터 플라스미드를 제공해 주신 Boris Fehse(독일 함부르크 에펜도르프 대학 의료 센터)에게 감사드립니다. 이 연구 전반에 걸쳐 토론, 지원 및 격려를 제공한 Christian A. Combs와 Neal S. Young(NHLBI, NIH)과 꼬리 정맥 주사에 도움을 준 Andre LaRochelle(NHLBI, NIH).

모든 마우스는 보관과 관리 및 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 사용을위한 설명서에 따라 처리하고, NHLBI 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 프로토콜에 등록되었다. 여성 B6.SJL-Ptprc (D) Pep3의 (b) / 6~12주 이전 BoyJ (B6.SJL)와 C57BL / 6 마​​우스는 각각 기증자와받는 사람으로 사용되었다. 재료, 시약, 및 장비의 목록이 표 1에 제공된다. 마우스 HSPCs의 1 레고 형질 도입 및 골수 이식 공인 된 바이오 안전성 수준이 (BSL-2) 캐비닛 (조직 문화 후드)으로 설명 절차를 수행합니다. <ol><li> 레고 벡터 인코딩 5FPS의 생산 <ol><li> 렌티 바이러스 &quot;유전자 존재론&quot;(레고) 벡터 플라스미드를 사용 레고 Cer2 (하늘색), 레고-G2 (EGFP), 레고-V2 (금성), 레고-T2를 포함하여 구조적으로 강하게 SFFV 프로모터에서 다른 FP를 인코딩 각 (tdTomato), 친절 박사 보리스 Fehse (대학 의료 센터 함부르크 - 에펜 도르프, 함부르크, 독일)에서 제공하는 레고-C2 (mCherry); Addgene 5-7에서도보실 수 있습니다 지금. </li><li> 레고 벡터, 씨앗 10cm 요리 (각 벡터 (12) 요리를 사용) 24 시간 전에 I10 미디어 (10 % FCS와 글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM)의 8 ML의 형질에 5 × 10 6 293T 세포를 생산합니다. </li><li> 약간 수정 CAPHOS 키트 추천 정보를 사용하여 인산 칼슘과 함께 세포를 형질 감염 : <ol><li> 각 플레이트 믹스 15 μg 레고 벡터, 12 μg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 μg 이전-TAT, 50의 존재 ㎕의 2.5 M 염화칼슘이 1 μg pMD2.G-VSV-G 플라스미드, 및 물을 넣어 500 ㎕의 총 부피를 수득 하였다. </li><li> 2X HeBS (HEPES 완충 식염수) 500 μL와 석출물 DNA 플라스미드 및 이전 293T 세포의 각 플레이트에 첨가하여 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 에 대한 세포를 품어37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 6 시간; 미디어를 제거하고 신선한 문화 매체 6 시간 포스트 형질을 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 일간, 매일, 각 판에서 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배양 상층 액을 수집합니다. 매일 다음 상층 액을 수집 각 플레이트에 신선한 I10 미디어를 추가 할 수 있습니다. <ol><li> 0.22 μm의 기공, 수영장을 통해 필터 및 71,900 XG, 4 ° C에서 2 시간 동안 SW28 로터에 초 원심 분리하여 상층 액을 집중한다. </li><li> StemSpan 매체의 1 mL의 상층 액을 재현 탁. -80 ° C에서 200 μL 및 저장소의 렌티 바이러스 주식을 나누어지는. </li></ol></li></ol></li><li> 렌티 바이러스 입자의 적정 NIH3T3 세포를 이용한 단위 / ml의 열 변환의 정량을 통해 수집 된 상층 액에서 레고 벡터 입자의 역가를 결정합니다. 역가 실험 대상의 감염 (MOI)의 원하는 상대 다수 발생하는 데 필요한 각 벡터 상청액의 부피 계산을 허용세포. <ol><li> 플레이트 일일 적정 전에 I10 미디어 2 ㎖ 잘 (12 웰 플레이트) 당 5 × 10 4 NIH3T3 세포. </li><li> (4 ㎎ / ㎖가 1,000 배입니다) 프로타민 황산 보충 I10 미디어에서 벡터 상층 액의 5 배 희석액을 준비합니다. </li><li> 세포에서 용지를 제거하고 농축 된 바이러스의 2, 0.8, 0.32 및 0.128 μL의 등가를 포함하는 상층 액을 희석 500 μL로 교체합니다. </li><li> 물론 하나의 제어를 카운트 전달시 웰당 본 셀의 수 (아니오)을 결정한다. </li><li> 6 시간 전달 후, I10 미디어 2 ㎖를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 일간 배양한다. </li><li> 각 웰 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 수확하고, 유동 세포 계측법, 형광을 통한 세포의 비율 (% FP)을 결정한다. </li><li> 아니 역가 (벡터 입자 / ㎖) = 1 ~ 50 % %의 FP의 결과로 각 웰 (희석)에 대해 얻어진 역가 평균, 다음과 같은 역가를 계산벡터 상층 액 (ML)의 X %의 FP / 볼륨. %의 FP가 1 ~ 50 % 사이 인 경우 각 희석 얻은 역가 평균값. </li></ol></li><li> 마우스 셀 컬렉션, 정화, 형질 도입 및 이식 (개략적으로 그림 1a에 도시는 Malide 등. 사에서 적응). <ol><li> 승인 된 절차에 의해 공여 쥐를 희생. 전방 및 후방 사지에서 수확 골수 : 철저하게 관절에 최대한 가깝게 각 뼈의 끝을 가로 질러 뼈의 모든 근육, 인대 및 초과 조직을 제거하고, 밖으로 골수를 씻어 humeri, 대퇴골 및 경골을 해부 I10 매체를 함유하는 주사기 27-0 G 바늘을 사용하여 뼈. </li><li> 500 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 전체 골수 세포 펠렛 및 50 ㎖의 ACK 버퍼로 두 번 적혈구를 용해. 10 ml의 I10 미디어에 재현 탁 세포. </li><li> 수정 키트 protoco에 따라 MACS 혈통 고갈 키트와 함께 계보 음 (선형 적) 전구 세포를 정화리터 : <ol><li> 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 30 μL 대신 10 μL / 10 7 세포를 사용하여; I2 미디어 (2 % FCS로 보충 IMDM) 대신 버퍼로 세척 단계를 완료합니다. </li><li> 비오틴 항체 칵테일 배양 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈 배양 사이에 하나 세척 단계를 삽입; 그리고 I10 대신 버퍼 열 평형. </li></ol></li><li> 10ng의 / ㎖ 뮤린 IL-3, 100 NG / ㎖ 뮤린 IL-11, 100 NG / ㎖ 인간 FLT-3 보충 StemSpan 매체에서 5 × 105 세포 / ml의 초기 농도에서 48 시간 동안 배양 선형 적 세포 리간드, 및 50 NG / ㎖ 뮤린 줄기 세포 인자. </li><li> StemSpan의 존재하에 4 × 105 세포를 12 웰 플레이트 각각 FP 50 % 발현 효율을 달성하기 위해 RetroNectin 코팅 및 감염 다중도 6-7의 (MOI)에서, 레고 상청액에 각각 형질 도입, 환승 1 미디어 및 사이토 카인은 위에서 설명한 4 μg / ml의 프로타민 황산. </li><li> 세포를 형질각 레고 벡터 개별적으로 단계 1.3.5에서 설명하고 전달 다음 세포를 혼합으로 (믹스라고) 또는 동시에 모두 5 레고 벡터 상층 액과 세포를 공동 - 형질 도입 (공동라고). 24 시간 후 세포를 제거 사이토 카인없이 StemSpan 미디어로 한번 씻어 이식 사이토 카인없이 StemSpan 미디어에서 그들을 재현 탁, 또는 공 초점 현미경 전에 추가 96 시간 동안 신선한 사이토 카인과 미디어, 문화로 전송 및 유동 세포 계측법. <ol><li> 1에 해당하는 마우스 당 셀 용량으로, 100 μL의 볼륨, 11 Gy의 단일 용량 사전 조사받는 사람 (6-18 시간 전에 이식을)받는 사람에 꼬리 정맥 주입을 통해 선형 적 HSPCs를 형질 주입하여 골수 이식을 수행 -2 × 105 선형 적 세포 본래 형질 도입을 위해 도금. 각 실험에서, 형질 도입 된 BM 도너 셀의 동일 인구 동물의 전체 코호트를 이식. </li><li> 유전자 변형 H의 체외 특성화하는 SPC는 배양 StemSpan에 추가 4-5일위한 사이토 카인은 세포로 보충하고 전달 효율을 유동 세포 계측법에 의해 분석하고, 색상의 다양성을위한 현미경. <ol><li> 개별 쥐를 희생하고 다양한 시간은 이식 후 1백20일 포인트 최대에, 영상에 대한 조직 및 기관을 검색 할 수 있습니다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 털을 헤어 스프레이 보급을 피 복부 측의 피부를 절개. </li><li> 표준 절차 비장, 슬와 림프절, 폐, 심장, 피부, 지방 조직, 골격근, 신장, 간뿐만 아니라 덮개 뼈에 접근 헤드에 따라 해부 및 소비세. </li><li> 또한, 덮개 뼈를 사용하거나 라이브 동물의 피부와 림프절로 시간 2,8,9 또는 이미지 피상적 장기에 걸쳐 반복적으로 실시간 이미징을위한 뼈 창을 설정합니다. </li></ol></li><li> 50 ~ 100에서 35mm 숫자 0 커버 유리 배양 접시에서 개별 기관을 배치56 단계 : 2.5에 설명 된대로 단면 고정 또는 추가 처리없이 그대로 그들을 이미징 리터 PBS를. </li><li> 체적 영상의 경우, 차가운 PBS에 사용할 때까지 장기에 보관하십시오. 시간 경과 영상의 경우, 20 mM의 HEPES를 포함하는 10 % FBS 37 ° C에서 DMEM에 장기 이미징 즉시 진행 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2 공 초점과 두 개의 광자 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 멀티 라인 아르곤, 다이오드 561 nm의 헬륨 네온 594 nm의, 그리고 헬륨 네온 633 nm의 가시 레이저를 장착 한 라이카 SP5 5 개의 채널 공 초점 및 광자 시스템을 사용하여 현미경 이미징을 수행합니다. 680에서 분산 보정과 1,080 nm의 여기에 사파이어 (티 - 사) 레이저, 조정 : 2 광자 모드, 펄스 펨토초 티타늄에 사용합니다. t와 순차적으로 또는 동시에, 1,030-1,300 nm의 것이면 출력 파장 범위를 확장하는 적색 편이 (FPS tdTomato 및 mCherry), 광 파라 메트릭 발진 (OPO) 레이저를 포함하는 실험에 사용티 - 사행 레이저 그가. </li><li> - IRAPO-L HCX 25X / 0.95 NA 물 침지 목표 (WD = 2.5 mm), HC-PLAPO-CS 20 배 / 0.70 NA 건조 목적 (WD = 0.6 mm) 또는 HC-PL-IRAPO 40 배를을 사용하여 이미지의 다양한 조직 /1.1 NA 침수 목적 (WD = 0.6 mm). </li><li> 제어뿐만 아니라 단일 FP 레고 벡터로 형질 도입 된 BM 세포로부터 가시 스펙트럼의 5 nm의 대역폭에 발광 람다 스택 (xyλ)를 수집하는 공 초점 형광 스펙트럼을 구하는, BM을-이식하지. <ol><li> 라이카 LAS-AF의 v2.4.1 소프트웨어 프로세스 이미지는 모두 5 FP의의 참조 스펙트럼과 형광도의 등 (그림 2A)를 만들 수 있습니다. 개별 FP 스펙트럼 및 형광 밝기의 차를 이용하여 다음과 같이 다섯 순차 촬상 채널을 설정 세룰 리안 (79 %), 금성 (1백56퍼센트) tdTomato (283퍼센트) 및 mCherry (47 %)의 (EGFP의 백분율로서 표현) 세룰 리안 (458 / 468-482 nm의), EGFP (488 / 496-514 nm의), 비너스 (514 / 523-558 nm의), tdTomato (561 / 579-597 nm의), 그리고 mCherry (594 / 618-670 nm의) ( <str옹&gt; 그림 2B). </li><li> 각 개별 FP 형질 세포가 나머지 (그림 2C) 만 해당 채널에 표시하고 결석으로, 정확한 FP의 분리를 확인합니다. 또한,이 정의되어 멀티 채널 접근은 후속 컬러 클론 분석 및 추적을 가능하게하고 스펙트럼 이미징에 비해 획득 시간을 감소시키는 이점을 가지고 고유 한 5 - 채널 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 생성한다. </li></ol></li><li> , 2 광자 모드에서, 네 개의 채널이 아닌 descanned 검출기 (NDD) 등으로 수집 맞춤 이색 미러 고효율 의해 분리 형광 방출은 다음과 같다 : 465 nm에서의 다이크로 익 미러이어서 568 nm에서의 다이크로 익 미러는, 다음 SHG 또는 자기 형광 및 하늘색, tdTomato 또는 mCherry위한 EGFP 또는 비너스 40분의 525 nm의 방출 필터 및 648 나노 미터의 다이크로 익 미러와 60분의 620 nm의 방출 필터는 45분의 452 nm의 방출 필터. <ol><li> 두 광자 현미경의 난에 의해 구조 정보를 공개ntrinsic 대비 (780 nm에서 흥분) 엘라스틴, NADH에서 조직자가 형광의 위에서 설명한대로 이미징 및 초 고조파 다시 산란에서 수집 한 920 나노 미터 또는 860 nm에서 (흥분 뼈와 섬유의 콜라겐의 신호 (SHG)를 생성 방향) 10, 11. </li></ol></li><li> 3 차원 볼륨 렌더링의 경우, 골수 및 다른 조직에 걸쳐 깊이의 범위 (150 ~ 300 μM) 위에 5 μm의 간격으로 Z-축을 따라 XYZ 이미지 시리즈 (보통 1 × 1 × 4 μm의 3 복셀 사이즈)를 수집하고, 소프트웨어의 타일 기능을 이용하여 큰 영역을 자동적으로 전체 흉골 fossae 약 2.5 × 1.2 mm 2 (XY) 및 300 μM (z) (도 2D-2E) 및 영화 일을 포함 스티치 볼륨을 생성하기 위해 위에. <ol><li> 이미지는이, 팔 절단을하지 않고 두개골을 통해 직접 골수 개관. </li><li> 다음 시상면 (양분)과 함께 제 흉골횡 방향으로 절단 얼굴 3,4,12을 통해이 흉골 해자와 이미지 사이의 조인트 (Takaku에서 적응 그림 1B의 개요 등 세). </li></ol></li><li> 4D 시간 경과 영상의 경우, 50 ~ 100 μL에서 35mm 숫자 0 커버 글라스 배양 접시에 포경 갓 절제 오금 림프절, 비장, 폐, 또는 두개골 뼈 샘플을 배치 37 ° C에서 20 mM의 HEPES를 포함하는 DMEM, 10 % FBS 와 ~ (Z-스택을 복용, 공 초점 여자 (458 나노 미터, 488 나노 미터, 514 나노 미터, 561 나노 미터, 594 나노 미터) 라이카 공진 스캐너 (8,000 Hz에서 / 초)와 결합 된이 광자 티 - 사 여기 (860 나노 미터)를 사용 최대 1 시간 동안 20 초 간격으로 80 μM). <ol><li> 동시에 세 가지 컬러 2P 이미징 사용 티 - 사를 들어 860에서 조정 nm 인 동시에 OPO의 (tdTomato에 1,130 nm에서 조정 또는 1,140 nm의 mCherry) 레이저 (동영상 2). </li></ol></li><li> 3D 볼륨과 4D 시간 시퀀스의 재건 및 분석 <ol><li> Imaris 64의 소프트웨어를 사용하여이전에 3,4 바와 같이, 버전 7.6 또는 볼륨 렌더링 (3D)로 RAW 이미지의 타일 - 스택을 변환하는 다른 소프트웨어 패키지 골수 및 다른 조직과 3D 회전 영화로 내보내려면 내부 형광 세포의 데이터이다 (동영상 1) 단계별 예 : <ol><li> Imaris에서, Z-스택 이미지를 엽니 다; 선택 3D 볼륨 가시화를 표시하기 위해 &quot;능가&quot;. </li><li> 360 °의 주위에 볼륨을 설정하는 &quot;이동&quot;를 사용합니다. </li><li> 애니메이션을 만들려면 &quot;애니메이션&quot;을 선택; 선택보기, 줌, 볼륨의 회전을 추가 할 키 프레임을 사용; 영화를 미리 필요한 편집하고 원하는 영화 형식으로 파일을 저장 (예 : AVI, MOV). </li></ol></li><li> 3D 셀과 클론 주파수, 위치, 크기 및 분포의 정량적 평가, 상기 프로세스에 대한 거리 MEAS 수행 MATLAB 애플리케이션 통합 Imaris XT 모듈을 사용하여 Z-스택(거리 변환 알고리즘을 사용하여) urements과 클러스터 분석과 같은 이전 설명 3,4. Imaris의 64 소프트웨어의 볼륨 렌더링 사 차원 (4D) 영화로 시간이 지남에 따라 이미지 스택의 시퀀스를 변환 및 회귀 움직임 알고리즘을 사용하여 입체적으로 세포 운동성의 반자동 추적 지점 및 표면 분석을 사용합니다. </li><li> 다음과 같이 세포의 멀티 스펙트럼 분석을 수행 : 멀티 컬러에 새로운 채널로 Imaris XT의 채널 연산을 통해 모두 5 채널을 추가하여 표시된 지점을 추출; 모든 반점 (셀) 5 컴포넌트 채널들 각각의 평균 형광 강도를 결정. 개별 셀의 각 FP (그림 2E 그래프)의 상대 % 즉, 고유의 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 표시하는 그래프를 플롯 엑셀 소프트웨어의 값을 내 보냅니다. 티슈 드리프트에 설정된 데이터를 정정하고, 셀의 변위 속도와 시간의 경과, 트랙 길이, 경로 및 거리를 계산; 엑셀 사무실 용 수출 값그래프를 그리는 tware. 어도비 포토샵 CSS 5 소프트웨어 복합 수치를 조립합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 살아있는 조직에 메스하고 역동적 인 이미지를 달성하기 위해 직렬 공 촛점 및 2 광자 현미경 5FP 인코딩 레고 벡터와 영상으로 표시 조합에 의해 생성 된 큰 다양성을 결합, 여기에 최근 클론 세포 추적을위한 고안 강력한 방법의 세부 사항을 설명합니다. 이것은 5 &quot;뚜렷한&quot;8 비트 채널에서 촛점 스펙트럼 ID를 기록하여 마킹 FP 기반 컬러의 사용을 확장. 따라서 각 셀 내에서 세룰 리안, EGFP, 금성, tdTomato, mCherry의 상대적 비율은 클론 자손의 식별을위한 고유의 &quot;용 ColorPRINT&quot;를 만듭니다. 5FPS에 의해 여러 가지 빛깔의 라벨은 세포 또는 조밀 한 조직 샘플에서 동일한 유형의 세포의 그룹 사이에 분포, 연락처, 바둑판 식 배열과 경쟁력의 상호 작용을 연구 할 때 특히 유용 보였다 더 많은 다양성과 레이블 팔레트를 증가시킨다. 다양한 조직의 고유의 구조적 특징이 광자 여기와 결합장기, 우리는 고정 및 물리적 단면 처리를 필요로하지 않고 그 나라의 환경...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
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This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

혈액 세포, 조혈 지칭의 제조는, 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 작은 집단에 의해 유지된다. 이러한 세포는 모두 자기 갱신 및 1,2 분화의 제어에 연루, 골아 세포, 간질 세포, 지방 조직, 혈관 구조로 이루어진 복합 미세 환경 틈새 골수 (BM) 내에 상주. 그대로 BM 직접 관찰 전통적으로 액세스 할 수없는 한 바와 같이, HSPC과 미세 환경 사이의 상호 작용은 생체 내에서 주로지지 않은 남아있다. 이전에, 우리는 공 초점 형광 및 반사 현미경 3를 사용하여 그대로 BM의 3 차원 구조를 시각화하는 방법을 설립했다. 우리는 BM-EGFP에 표시된 HSPCs의 확장을 특징으로하지만, 단지 하나의 FP 사용 클론 레벨에서 재생의 분석을 배제. 아주 최근에 우리는 구조적으로 FL을 표현 렌티 바이러스 유전자 존재론 (레고)의 장점 벡터를했다uorescent 단백질 수 (fps)을 효율적으로 세포 4,5를 표시합니다. 3 또는 5 벡터와 HSPC의 공동 형질이 여러 개인 HSPC 클론의 추적을 허용, 조합 색상의 다양한 팔레트를 생성합니다. 표시됨 HSPC는 조사 된 마우스의 BM 개별 HSPC 원점 복귀 및 생착를 추적하도록 허용 새로운 이미징 기술과 결합. 레고 벡터는 뼈와 기타의 명확한 시각화를 허용, (세루 리안, eGFP는, 금성, tdTomato 및 mCherry부터) 셋 또는 다섯 다른 FP의와 HSPC을 표시하고 공 촛점 및 2 광자 현미경에 의한 BM에서 시간이 지남에 따라 자신의 생착을 수행하는 데 사용 된 매트릭스 구조, 및 그 구성 요소의 미세 HSPC 클론 관계. HSPC 레고 벡터로 형질 C57BL / 6 마​​우스 BM의 계보 음성 세포로 정제하고, myelo - 절제 congenic 마우스로 꼬리 정맥 주사로 reinfused되었다. 흉골 BM 조직의 큰 볼륨을 모니터링함으로써 우리는 초기에 발생하는 골 내막 생착을 시각화BM 재생. 다양한 컬러 스펙트럼이있는 셀 클러스터는 뼈 가까이에 처음 등장하고 시간이 지남에 따라 중앙에서 진행. 흥미롭게도, 이상 삼주 후 골수 오히려 혈류를 통해 HSPCs 널리 보급보다 연속적으로 골수에서 개별 HSPCs에서 유래 조혈의 확산을 제안, 거시적 클론 클러스터로 구성되었다. 작은 색상의 다양성은 다수의 벡터와 세포를 다시 채우기 장기 열 변환하는데 어려움을 시사 늦은 시점에서 있었다. 또한 HSPCs는 마우스에서 비장에 대한 책임 또한 조혈 기관을 클러스터 형성. HPSC에서 파​​생 된 각각의 세포뿐만 아니라, 흉선에서 림프절, 비장, 간, 폐, 심장, 피부, 골격 근육, 지방 조직, 신장 해결 될 수있다. 3D 이미지는 조직의 최소한의 교란과 세포의 분포를 평가하는 정 성적 및 정량적으로 평가 될 수있다. 마지막으로, 우리는 설명공진 스캔 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합하여 4D 라이브 동적 스터디의 개발 가능성. 이 방법론은 조직 재생 및 병리학의 연구에서 강력한 도구를 제공, 자신의 본래 3D 아키텍처 스펙트럼 표시 세포 인구의 비 침습적 높은 해상도, 다차원 세포 운명의 추적을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">바이러스 생산</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td>의 발현 <td>Addgene</td><td>25917</td><td>eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td>의 발<td>현 Addgene</td><td>27340</td><td>Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td>의 발현 <td>Addgene</td><td>27342</td><td>tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>의 발현Addgene</td><td>27339</td><td>mCherry</td></tr><tr><td>칼슘 인산염 형질주입 키트</td>의 발현 <td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 열 비활성화</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>펜 연쇄상 구균 글루타민</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex 주사기 구동 필터 Unite (0.22 &마이크로; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼 + 튜브</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM 혈청 무함유 배지 (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>뮤린 IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 &마이크로; g/ml는</td></tr><tr><td>Fitzgerald Industries Intl의</td> 1,000x<td>재조합 쥐 SCF</td> RDI 부서입니다.<td>RDI-2503</td><td>100 &마이크로; g/ml는 2,000x</td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-3</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 &마이크로; g/ml는 2,000x</td></tr><tr><td>FLT-3 리간드</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro입니다. g/ml는 1,000x</td></tr><tr><td>12웰 플레이트, Costar</td><td>Corning Inc.입니다.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td>는 <td>50 &마이크로에서 재현탁; g/ml</td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>시그마</td><td>P-4020</td><td>4 &마이크로; g/ml는 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4">Confocal 및 Two-photon Microscopy</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.입니다.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시 P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시 P35G-0-14-C</td><td>MatTek</td><td>Corporation P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스 #1 붕규산 커버 유리; 4-웰</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS 5채널 공초점 및 다광자 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph 레이저 범위 680-1,080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO 레이저 범위 1,030-1,350 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA 수침 대물렌즈(WD=2.5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA 건식 대물렌즈 (WD=0.6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA 침수 대물렌즈 (WD=0.6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어 버전 7.6</td><td>비트플레인</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

우리는 개발과 쥐의 골수 이식 실험 모델을 이용하여 생체 내 조혈에서 공부하는 높은 공간 및 시간 해상도와 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 클론 추적을위한 방법론을 표시하는 형광을 확인. 형광 단백질 (fps)를 코딩하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 표시하는 유전자 조합이 고급 현미경 영상을 통해 세포 운명 매핑 할 수있었습니다. 다섯 가지 FP의 인코딩 벡터 : 세룰 리안, EGFP, 금성, tdTomato 및 mCherry 컬러 표시 세포의 다양한 팔레트를 만드는 동시에 HSPCs를 형질 도입하는 데 사용되었다. 공 초점 / 두 광자 하이브리드 현미경을 사용하여 영상의 동시 고해상도 고유 표시 세포의 평가와 조직 구조 구성 요소와 함께 자신의 자손을 할 수 있습니다. 체적은 스펙트럼 적 부호화 HSPC 유래 세포는 비 침습적 골수 손상을 포함하는 다양한 조직에서 검출 될 수있는 것으로 나타났다 (큰 영역 위에 BM 분석), 이식 다음 시간의 광범위한 기간 동안. 4D 비디오 속도 광자 공 촛점 시간 경과 영상을 결합 라이브 연구는 정량적 인 방법으로 동적 세포 및 클론 추적의 가능성을 보여줍니다.

전체 마운트 3D 공 초점 흉골 골수 시간 코스 / 2 광자 현미경 복원은 놀라운 특성을 가진 패턴으로 생착 및 이식 공동 5FPS의 확장을 밝혀 : 클론 명확하게 윤곽이 균일하게 넓은 초기 색상 팔레트 및 진행 표시 등장 시간이 지남에 따라 우선적으로 주로 하나의 색의 셀을 포함한다. 공 초점 현미경 설치 및 흉골 골수에서 영상 5FPS 마크 HSPC의 대표적인 예는 그림 2와 영화 1과 2에 나타내었다. 손상 조직의 항목 마운트 3D 촛점 / 2 광자 현미경 복원 색상의 운명 살아있는 조직에 장시간 기간의 BM-유도 된 세포를 표시하는 추적 가능성을 보여준다. 이식 다음과 같은 조혈 및 비 조혈 기관에서 골수 유래 세포의 대표적인 예는 인터넷에 나와 있습니다<html> gure 3. <img al...

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

본 절차의 전반적인 목표는 새로운 공초점 및 이광자 현미경 전략을 사용하여 골수를 포함한 생체 조직 내에서 형광 표지된 조혈 클론을 추적하는 것입니다. 이를 위해 생쥐의 조혈 전구세포 및 줄기세포를 분리하고, 다섯 가지 형광 단백질인 Ian, EGFP, Venus, TD tomato 및 m cherry를 인코딩하는 렌티바이러스 유전자 온톨로지 또는 Lego 벡터로 공동 형질전환시킵니다. 형질전환된 세포를 골수 제거 수용 생쥐에 이식하고, 최대 120일의 기간이 지난 후 수용 생쥐로부터 골수와 장기를 적출하여 공초점 및 이광자 현미경 관찰을 통합적으로 수행합니다.결과 영상은 3D로 재구성되어 시간이 경과함에 따라 형광 표지된 이식 클론과 세포의 위치를 추적합니다. 이를 통해 조혈 과정 중의 클론 진화와 다른 장기로 이동한 골수 유래 세포의 운명을 연구할 수 있습니다. 조직의 물리적 절편 제작에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 공초점 현미경을 이용한 광학 절편화의 고해상도 이미징 이점과 2광자 현미경을 통한 구조적 성분의 시각화 이점을 결합했다는 점입니다.이 방법은 조기 생착 시 골수 재생 과정 중 혈액 생성의 공간적 및 시간적 클론 분석, 그리고 시간이 경과함에 따라 확장되는 클론의 지리적 유지와 같은 혈액학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 손상되지 않은 대량의 고밀도 조직을 검사할 수 있습니다. 예를 들어, 흉골강 내의 색상 표지 클론을 시각화하기 위해 약 3000장의 이미지를 컴퓨터로 재구성했습니다. 이 방법은 정상 및 교란된 혈액 생성의 클론 구조에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 장기 재생, 면역 반응 또는 종양 전이 패턴 연구에도 적용될 수 있습니다.이 절차에서는 다섯 가지 형광 단백질인 Ian EGFP, Venus, TD tomato, M Cherry를 인코딩하는 렌티바이러스 유전자 온톨로지(lentiviral gene ontology) 또는 Lego 벡터를 사용합니다. 각 형광 단백질은 강력한 구성적 SFFV(spleen focus forming virus) 프로모터로부터 발현됩니다. 형광 단백질을 인코딩하는 Lego 벡터를 제작하고 바이러스 입자의 타이터(titer)를 측정한 후, 희생된 공여 마우스의 상지 및 하지에서 상완골, 대퇴골 및 경골을 박리하여 골수를 채취합니다.메스를 사용하여 뼈에서 모든 근육 인대와 과잉 조직을 완전히 제거합니다. 다음으로 각 뼈의 끝부분을 관

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

출처: Gómez-Villafuertes, R., et. al., 세포 생물학 및 여러 신경 집단의 계통 진행을 모니터링하기 위한 실시간 이미징 후 단일 세포 추적.J. Vis. Exp. (2017) 비디오는 분열 및 분화를 포함한 세포 행동을 연구하기 위해 실시간으로 성체 신경 줄기 세포를 준비, 이미징 및 추적하는 과정을 보여줍니다.

 성체 신경 줄기 세포의 신경 계통을 모니터링하기 위한 라이브 이미징 및 단일 세포 추적

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

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Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

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학습하세요 공초점 및 다중광자 현미경을 이용한 5색 형광 단백질 표지 조혈 줄기세포와 전구세포의 생체 내 클론 추적 방법입니다. 고해상도 3D 영상 재구성으로 혈액 생성 과정에서 세포 계보 변화를 실시간 관찰할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

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