Name: 배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 배우세요 대규모 병렬 리포터 분석(MPRA)을 사용하여 수천 개의 DNA 서열에서 유전자 조절 활성을 동시에 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 배양된 포유동물 세포에서 고속 처리 분석을 가능하게 합니다.

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이 작품은 상을 수 R01HG006785에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 인간 게놈 연구소에 의해 지원되었다.

1 시퀀스 설계 및 합성 <ol><li> 시퀀스의 설계 및 합성에 MPRA 시작은 규제 활동을 분석합니다. pMPRA 벡터 시리즈와의 호환성을 위해 다음과 같은 템플릿을 사용하여 각 시퀀스를 설계 : 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var에 -GGTACCTCTAGA- 태그 -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 var에 정량 할 수있는 순서를 나타내며, 태그는 하나 이상의 식별 태그를 의미한다 &#39;. </li><li> 이 가변 영역 (VAR 및 태그) 사이 리포터 유전자 단편의 방향을 용이하게 결찰를 KpnI (GGTACC)과를 XbaI (TCTAGA) 제한 부위의 쌍에 의해 분리된다. 또한, 두 가지 SfiI (GGCCNNNNNGGCC) 사이트는 pMPRA 백본으로 방향 결찰 할 수 있도록 PCR에 의해 추가됩니다. 변수 영역이 제한 부위의 사본을 추가로 포함 할 수 없습니다. 필요한 경우, 이들 제한 효소 중 하나 이상을 대체 할 수있다만큼 대체품으로서 1) 주변 DNA 분자의 말단에 효율적인 절단을 허용하고, 2) 벡터 시퀀스의 다른 곳에서 절단되지 않는다. 자세한 내용에 대한 설명을 참조하십시오. </li><li> 상용 공급 업체에서 표 1에 필요한 프라이머를 얻습니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [인덱스] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> 표 1 프라이머 서열. [색인] 다중화 시퀀싱에 사용될 6-8 NT 인덱스 시퀀스를 나타낸다. 다른 인덱스 적어도 8 TagSeq-P2 프라이머를 얻습니다. 모든프라이머의 HPLC 또는 PAGE로 정제해야한다. <ol start="4"><li> 올리고 뉴클레오티드 라이브러리는 상업적 공급 업체 또는 코어 설비로부터 얻어진, 또는 제조자에 의해 설명 된 바와 같이 프로그램 가능한 마이크로 어레이 계 올리고 뉴클레오티드 합성기를 사용하여 생성 될 수있다. 100 ㎕의 TE 0.1 버퍼에 OLS 제품을 재현 탁. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔을 변성 10 % TBE-우레아에 올리고 뉴클레오티드 라이브러리를 실행. 품질 (그림 2A)를 평가하는 ssDNA의 민감한 형광 얼룩 차선 얼룩 당 약 1 pmol의를 넣습니다. </li><li> 전체 길이의 올리고 뉴클레오티드에 대응 이산 밴드 시각화 할 수있는 경우 (도 2a, 레인 1과 2), 대응 아크릴 아미드 겔 슬라이스를 절제하고 진탕하면서 실온에서 밤새 100 ㎕의 TE 0.1로 올리고 뉴클레오티드를 용출. 그렇지 않으면, 원시 OLS 서스펜션을 사용하여 진행합니다. </li><li> PCR 증폭 9 에멀젼을 이용한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 SfiI 꼬리를 추가 </<html> &gt; SUP. </li><li> 표 2에 설명 된대로 50 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 설정합니다. 다음 4 ℃에서 5 분 동안 300 ㎕의 Micellula DNA 에멀젼에서 오일과 계면 활성제 혼합물의 정제 키트와 소용돌이와 결합. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 1X 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> Herculase II 퓨전 DNA 중합 효소 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 5 배 Herculase II 반응 버퍼 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 의 dNTP (10 mM의 각) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA (20 ㎎ / ㎖) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> 프라이머 MPRA_SfiI_F (25 μM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 프라이머 MPRA_SfiI_R (25 μM) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> OLS 템플릿 (1-10 attomol) </td><td> 변화 </td></tr><tr><td> 핵산 분해 효소가없는 물 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; 표 2 에멀젼 PCR 반응 믹스 (수상). <ol start="9"><li> 생성물의 외관없이 증폭 생성물의 최대 수율을 제공 농도를 사용하여 (섹션 1.12 참조). </li><li> PCR 튜브에 생성 된 에멀젼을 분배하고 95 ° C에서 (2 분 PCR의 20주기를 수행, 20 × 95 ° C에서 20 초, 55 ° C, 72 ° C에서 30 초에서 20 초], 95시 3 분 ° C). </li><li> 풀 텍싱 간단히 1 ㎖의 이소 부탄올을 첨가하여 각각의 350 μL 에멀젼 PCR 반응을 중단 한 후 DNA 정제 컬럼을 사용하여 증폭 산물을 정제하고. </li><li> 유물없는 증폭 (그림 2B)를 확인하기 위해 2 % 또는 4 % 아가로 오스 겔에 나누어를 실행합니다. </li></ol><img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> 올리고 뉴클레오티드 합성 라이브러리의 그림 2 준비.) </strong이&gt; 세 가지 다른 원료 올리고 뉴클레오티드 합성 라이브러리 (OLS)은 10 % TBE-우레아 폴리 아크릴 아마이드 젤을 변성에서 실행됩니다. 전체 길이 올리고 뉴클레오티드 (*)에 해당하는 밴드 시각화 라이브러리 1에서 절제과 2 도서관 3 페이지 정화 방해 오염 물질을 포함 할 수 있습니다. 이러한 경우, 아가로 오스 겔상에서 동일한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 런의 개방 및 에멀젼 PCR 증폭 PCR 증폭. B)로 직접 이동 제품. 복잡한 올리고 뉴클레오티드 라이브러리의 PCR 증폭 자주 키메라 제품과 상한 및 하한 밴드로 나타날 수 있습니다 다른 아티팩트를 생성합니다. 에멀젼 PCR은 이러한 아티팩트를 최소화 할 수 있습니다. 2 라이브러리 생성 <ol><li> , 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 2 시간, 50 ° C에서 SfiI으로 분해 벡터 pMPRA1 의해 선형화 된 플라스미드 백본을 준비한다 (이 경우, 2.5 KB 단위) 백본 밴드를 절제하고, 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제. </li><li> 다이제스트2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI와 단계 1.4에서 에멀젼 PCR 제품과는 DNA 정제 컬럼을 사용하여 정제. </li><li> , 선형화 된 벡터 백본에 프로모터 태그 라이브러리를 결찰하기 위해 소화 PCR 제품의 100 NG, 선형화 된 벡터 백본 및 T4 DNA 리가 아제의 50 NG를 포함하는 반응을 설정합니다. 20 분 리가을 비활성화하는 65 ° C에서 다음 열을 16 ° C에서 밤새 품어. </li><li> E. 변환 연결 반응으로 대장균. 라이브러리 복잡성을 유지하기 위해, 설계 라이브러리에있는 개별의 프로모터 태그 조합이보다 적어도 10 배 더 CFU를 획득하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 태그의 총 개수가 약 10 인 경우, 타겟은 전형적으로 도서관 CFU 당 6-8 병렬 변환을 수행함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 각 변환의 경우, E. electrocompetent 50 μl를 결합 얼음에 결찰 믹스의 2 μL와 대장균 세포. 800 μL의 SOC에 세포를 전기 천공에 의해 변형 복구병렬 변환에서 세포를 결합 후 1 시간 동안 37 ° C에서 흔들어, 그리고에 의해 매체. </li><li> 변환 효율을 평가하기 위해 50 ~ 100 μg / ml의 카르 베니 실린와 LB 아가 플레이트에 복구 된 세포의 alinquot에서 순차적으로 희석 플레이트 하룻밤에 37 ° C를 품어. / V, V 복구 세포와 V의 전체 볼륨 시리얼 희석 걸리는 나누어의 볼륨 - 총 CFU로 (관찰 CFU) × (희석 계수) × (V V)를 추정한다. </li><li> 동시에, 회수 된 세포의 나머지가 100 μg / ml의 카르 베니 실린이 보충 된 200 ㎖의 LB에 접종하는 데 사용. 진탕 배양기에서 하룻밤 37 ° C에서 세포를 성장하고 표준 절차에 따라 플라스미드 DNA를 분리. </li><li> 2 시간 동안 50 ° C에서 SfiI으로 절연 플라스미드 라이브러리의 분취 다이제스트와 삽입물의 존재를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 실행. </li><li> C에 의해 플라스미드 라이브러리를 선형화를 KpnI과 XbaI로를 사용하여 프로모터 변종와 태그 사이에 utting. 소화 효율을 극대화하기 위해, 일련 digestions를 수행 </li><li> 첫째, 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI에서 다이제스트 및 자기 구슬을 사용하여 정제. 둘째, 2 시간 동안 37 ° C에서 1 U 새우 알칼리 포스 파타 아제의 첨가를 XbaI으로 소화, 열은 5 분 동안 65 ° C에서 비활성화 한 다음 자석 구슬을 사용하여 정제. </li><li> 완전한 선형화를 확인하는 1 % 아가 로스 겔상에서 분취 액을 실행. 미가공 플라스미드가 보이면, 선형화 된 단편을 겔 정제한다. </li><li> 포유 동물 세포에 형질 전환에 적합한 MPRA 라이브러리를 생성하기 위해, 선형화 된 중간 라이브러리에 KpnI으로 절단 / XbaI으로 호환 끝으로 ORF를 결찰. </li><li> pMPRAdonor1에서 호환 luc2 ORF 부분을 준비하려면 1 시간 동안 37 ° C에서를 KpnI과 XbaI으로이 플라스미드를 소화하고 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. ORF 부분을 절제 (1.7 K이 경우, b) 및 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제. </li><li> 단계 2.3-2.8에서 설명한 바와 같이 선형화 된 라이브러리에 중간 ORF 단편을 복제. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단과 MPRA 라이브러리 (1-2 μg에 해당) 나누어지는 다이제스트와 1 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. 소화 라이브러리가 하나의 밴드로 실행하면 추가 밴드가 (일반적으로 중간 구조의 이월에 해당), 라이브러리는 다음과 같이 추가로 정제 할 수있다 관찰하는 경우, 섹션 3으로 진행합니다 : </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 KpnI으로 절단으로 오염 된 라이브러리의 3-5 μg을 소화하고 4 ℃에서 하룻밤 0.8 % 아가로 오스 겔에서 실행됩니다. </li><li> 올바른 라이브러리 밴드를 절제 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 DNA를 정제하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 고농도의 T4 DNA 리가 아제를 이용하여자가 결찰을 수행한다. 단계 2.8에 설명 된대로 그런 다음 변환 및 최종 라이브러리 DNA 분리를 반복합니다. </li></ol> 3 Transfection, 동요 및 RNA 분리 <ol><li> 각각의 독립적 인 형질 감염, 적절한 배양 배지에서 세포를 필요 매수 (MPRA 라이브러리의 복잡성에 의해 결정된 바와 같이, 논의 참조). 예를 들어, DMEM에서 배양 HEK293T / 17 세포를 10 % FBS 및 L-글루타민 / 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 각 라이브러리 및 실험 조건에 대한 적어도 두 개의 독립적 인 형질 감염을위한 세포를 배양. </li><li> MPRA 플라스미드와 함께 배양 된 세포를 형질. 형질 전환 방법 및 조건은 각 세포 유형에 맞게 최적화해야합니다. 각 형질 샘플 들어, 정합 제어로서 플라스미드 DNA의 분취 액 (50-100 NG)를 유지한다. </li><li> 예를 들어, 0.5 × 10 7 HEK293T / 성장 17 세포를 형질에 ~ 나는 30 ㎕의 리포 펙 타민 LTX 10 μL 플러스 시약을 사용하여 혈청 중 감소 된 1 ml의 옵티-MEM에서 10 μg 플라스미드 DNA와 10cm 배양 접시에 50 %의 합류. 5시간 후 형질 전환 혼합물을 제거하고 허용세포는 24 ~ 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 선택적으로, 설계 라이브러리의 상황에 또는 신호에 의존하는 조절 서열을 활성화하는 데 필요한 교란을 수행합니다. </li><li> 세포를 수확과 제조업체의 지침을 사용하여 표준 올리고 (DT) 셀룰로오스 열 또는 구슬을 사용하여 폴리 (A) + mRNA를을 격리 할 것. </li><li> 열 또는 구슬의 최대 결합 용량이 수확 한 세포에서 mRNA의 예상 총 금액을 초과 할 수 있는지 확인합니다. 예를 들어, 3.3에서 기대 수익률은 약 0.5 내지 2.5 μg의 mRNA이다. </li></ol> 4 태그-SEQ <ol><li> 형질 세포 용 해물에서 벡터 DNA의 이월을 제거하기 위해 2.4 ㎕의 터보 DNase의 불 활성화 시약을 1 시간 동안 37 ° C에서 1 μL 터보 DNase의 (2 U) 및 2.3 ㎕의 10 배 터보 DNase의 버퍼 각 20 μL mRNA의 샘플을 처리 추가 RT 후 5 분간 혼합과 90 초간 원심 분리기에 10,000그램 및 위해 신선한 용액 튜브에 옮긴다. </li><li> 확인<html> 아가로 오스 겔상에서의 제품을 각각의 mRNA 시료 60-100 ng의 섹션 4.6에 설명 된 바와 같이 PCR을 수행하고 실행하여 순도. (luc2와 pMPRA1를 사용하는 경우 0.25 킬로바이트) 특정 증폭 산물을 볼 수있는 경우, 열은 치료의 mRNA를 정제 한 후 DNase를 처리를 반복합니다. </li><li> , 태그-SEQ 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 cDNA에 기자의 mRNA를 변환 PCR에 의해 시퀀싱 어댑터를 추가합니다. </li><li> 표 3에 설명 된대로의 mRNA / RT 프라이머 혼합물을 설정합니다. 다음 얼음에 놓고 5 분 동안 65 ° C에서 품어. 표 4에 설명 된대로 병행하여, cDNA 합성 반응을 설정합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 1X 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> mRNA의 샘플 (400-700 NG 전체) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 올리고 0dT (50 μM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 의 dNTP (10 mM의 각) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>cDNA 합성을위한 ove_content &quot;&gt; 표 3 RNA / 역전사 프라이머 믹스. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 1X 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 10 배 첨자 III RT 버퍼 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> MgCl2를 (25 밀리미터) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0.1 M) </td><td> 이 </td></tr><tr><td> RNaseOut (40 U / μL) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 첨자 III (200 U / μL) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 4의 cDNA 합성 반응 믹스. <ol start="5"><li> 조심스럽게 mRNA의 / RT 프라이머 cDNA 합성 믹스와 혼합 결합한다. 50 분, 5 분, 85 ° C, 50 ° C에서 부화 한 후 얼음에 배치합니다. 마지막으로, 20 분 동안 37 ° C에서 2 U 리보 뉴 클레아 제의 H와 부화. </li><li> 4-6 μL와 표 5에 설명 된대로 PCR 반응을 설정cDNA의 반응 혼합물 또는 템플릿으로 50 ng의 리포터 플라스미드. 그런 다음 PCR 증폭 (2 분 95 ° C, 26 X [30 초 동안 95 ° C, 30 초 30 초 동안 55 ° C, 72 ° C], 3 분 동안 72 ° C)를 수행합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 1X 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 배 PfuUltra II HotStart PCR 마스터 믹스 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 프라이머 TagSeq_P1 (25 μM) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 프라이머 TagSeq_P2 (25 μM) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 템플릿 (mRNA를 cDNA를 혼합 또는 플라스미드 DNA) </td><td> 변화 </td></tr><tr><td> 핵산 분해 효소가없는 물 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> 표 5 태그-SEQ PCR 반응 혼합물. <ol start="7"><li> 2 % 아가 로스 젤 PCR 제품을 실행 태그-SEQ 라이브러리 증폭 산물에 해당하는 소비세 밴드 (0.25 킬로바이트 사용하는 경우luc2와 pMPRA1) 및 이들의 겔 정화 스핀 열을 정화. </li><li> 수영장, 변성 및 Illumina의 시퀀싱 기기와 직접 정제 된 태그-SEQ 증폭 산물을 시퀀싱. </li><li> 필터 저품질는 시퀀스 태그 내에 30 개 미만의 점수 또는 b) 정확하게 설계된 태그가 일치하지 않는 Phred 품질로 하나 이상의 위치를​​ 포함) 모두를 제거하여 판독한다. 나머지 각 태그는 각 도서관에 나타나는 횟수를 계산합니다. TPM에 (백만 시퀀싱 태그 당 태그) 태그 카운트를 정규화 한 후 시퀀싱 라이브러리의 각 쌍에 대한 플라스미드 유래 태그 카운트 위에 유래의 mRNA 태그 카운트의 비율을 계산한다. 서로 다른 여러 태그를 각 시퀀스 변종에 연결 한 경우, 다운 스트림 분석을 위해 자신의 평균 비율을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
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<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

MPRA는 유전자 조절 요소의 서열-활성 관계를 분석하기 위한 유연하고 강력한 도구입니다. MPRA 실험의 성공 여부는 적어도 세 가지 요인에 달려 있습니다: 1) 서열 라이브러리의 신중한 설계, 2) 증폭 및 클로닝 중 아티팩트 최소화, 3) 높은 형질감염 효율. 
리포터 구조에서 가변 영역의 가능한 길이는 주로 사용된 합성 또는 복제 기술에 의해 결정됩니다. 표준 OLS는 일반적으로 약 200nt로 제한되지만 이 프로토콜은 최소 1,000nt의 인서트와 호환됩니다. 반복성이 높거나 강력한 2차 구조를 포함하는 가변 영역은 PCR 및 복제 편향으로 인해 과소 대표될 수 있습니다. 각 가변 영역을 식별하는 태그의 길이는 10-20nt여야 하며 태그 모음은 임의의 쌍 사이에 적어도 2개의 뉴클레오티드 차이가 있도록 이상적으로 설계되어야 합니다. 알려진 microRNA의 시드 서열 또는 mRNA 안정성에 영향을 미칠 수 있는 기타 인자를 포함하는 태그도 가능하면 피해야 합니다.
MPRA 실험 설계의 핵심 매개변수는 라이브러리에 포함될 개별 리포터 구조의 총 수입니다(설계 복잡성, CD로 표시됨). 실제로 CD는 형질감염될 수 있는 배양 세포의 수에 의해 제한됩니다. 일반적으로 형질감염된 세포의 총 수는 CD보다 최소 50-100배 많아야 합니다. 예를 들어, 50%의 형질감염 효율로 2천만 개의 세포를 형질감염할 수 있는 경우 C-D는 ~200,000을 넘지 않아야 합니다. CD는 고유한 조절 서열 변이체의 수에 서열당 고유한 태그의 수를 곱한 것과 같습니다. 각 조절 서열에 더 많은 고유한 태그가 연결될수록 해당 서열의 활성을 더 정확하게 추정할 수 있지만(서로 다른 태그의 측정값을 평균화할 수 있기 때문에) 한 실험에서 분석할 수 있는 별개의 변이체는 더 적습니다. 최적의 선택은 실험 설계에 따라 다릅니다. 집계된 측정값에 수학적 모델이 장착되는 간단한 "프로모터 배싱" 실험에서는 일반적으로 변형당 단일 태그로 충분합니다. 조절 활동의 변화를 일으키는 단일 뉴클레오티드 다형성에 대한 스크리닝에서, 각 대립유전자 쌍을 비교하려면 별도의 가설 검정이 필요하기 때문에 통계적으로 강력한 결과를 얻기 위해 대립유전자당 20개 이상의 태그를 사용해야 할 수도 있습니다.
분석할 서열이 전사 시작 부위를 포함할 것으로 예상되지 않는 경우, 동일한 단편에 상수 프로모터를 추가할 수도 있습니다. 예를 들어, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353)는 업스트림 가변 영역이 상당한 인핸서 활성을 가질 것으로 예상될 때 유용한 최소 TATA-box 프로모터를 포함하는 반면, pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354)는 가변 영역이 소음기 활성 또는 기타 음성 조절 요소를 포함할 것으로 예상될 때 유용한 변형된 강력한 SV40 바이러스 프로모터를 포함한다. 
원시 OLS 제품에는 잘린 올리고뉴클레오티드가 상당 부분 포함되어 있는 경우가 많습니다. 이는 특히 서열 사이에 상당한 상동성이 있는 경우 설계된 서열의 정확한 PCR 증폭을 방해할 수 있습니다. PAGE 정제를 사용하여 잘린 합성 산물을 제거하고 에멀젼 PCR을 사용하여 증폭 아티팩트를 최소화하는 것은 높은 라이브러리 품질을 보장하는 효과적인 기술입니다. 두 단계 중 하나가 실용적이지 않은 경우 각 증폭 단계에서 사용되는 PCR 주기 수를 최소화하는 것이 필수적입니다. 액체 배양에서 클론화된 라이브러리의 선택 및 확장은 일반적으로 설계 복잡성을 유지하기에 충분하지만, 재조합이 발생하기 쉬운 벡터를 사용하거나 상당한 표현 편향이 관찰되는 경우 회수된 세포를 대신 큰 LB 한천 플레이트에 직접 도금하고 개별 콜로니로 확장한 다음 DNA 분리를 위해 긁어낼 수 있습니다. 일반적으로 OLS에서 1:100-500의 비율로 발견되는 합성 오류의 잠재적 영향을 고려하는 것도 중요합니다. 이러한 오류를 식별하고 수정하기 위해 형질감염 전에 리포터 구조물의 전체 길이 시퀀싱이 권장됩니다.
형질감염된 배양의 모든 세포에 리포터 구조물을 도입할 필요는 없지만 형질감염 효율이 ~50% 미만이면 신호 대 잡음비가 낮아질 수 있습니다. 새로운 세포 유형에서 MPRA 실험을 수행하기 전에 형질감염 조건을 최적화하는 것이 좋습니다. 형질감염이 어려운 세포 유형으로 작업할 때 형질감염된 세포를 미리 선택하여 MPRA 신호를 증폭할 수 있습니다. pMPRA 벡터 시리즈에는 RNA 분리 전에 형질감염된 세포를 물리적으로 농축하는 데 사용할 수 있는 잘린 세포 표면 마커를 구성적으로 발현하는 변이체(예: Addgene ID 49350 및 49351)가 포함되어 있습니다.

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Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

대규모 병렬 리포터 분석 실험은 (MPRA)는 DNA 서열 1 (7)을 수천 수백 수천의 전사 규제 활동의 다중 측정을 할 수 있습니다. 자신의 가장 일반적인 실시 예에서, 다중화는 오픈 리딩 프레임의 하류 서열 식별 태그가 포함되어 합성 리포터 유전자를 관심있는 각각의 시퀀스를 연결함으로써 달성된다 (ORF를,도 1). 형질 감염, RNA 분리 및 리포터 유전자 전 사체의 3 &#39;말단의 깊이 순서화에 따라, 결합 된 서열의 상대적인 활동은 식별 태그의 상대적인 풍부로부터 추론 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> MPRA의 그림 1 개요. MPRA 기자의 라이브러리는 합성으로 추정 조절 서열을 결합하여 구성되어 구축서열 식별 태그 뒤에 (예로서 루시페라아제 또는 GFP) &quot;불활성&quot;ORF로 구성 리포터 유전자. 도서관은 배양 된 세포의 인구에 대거 형질 전환하고, 전사 리포터 mRNA를 연속적으로 회수한다. 깊은 순서는 기자의 mRNA와 형질 전환 된 플라스미드 중 각 태그의 발생 수를 계산하는 데 사용됩니다. 플라스미드 카운트 대응하는 조절 서열의 활성을 추정하는 데 사용될 수있는 동안의 mRNA의 비를 계산. 멜린 니코의 허가를 적응, 등 2. MPRA은 관심 궤적 걸쳐 신규 조절 요소에 대해 개별 유전자 조절 요소는 1) 광범위한 돌연변이 유발, 2) 주사를 포함하여, 실험 다양한 설계에 적용 할 수 있으며, 3) 추정의 세트 천연 유전 적 변이의 효과를 테스트 프로모터, 인핸서 또는 소음기, 합성 규제 요소 사) 반 합리적인 엔지니어링. 리시퀀스 변종 braries은 퇴화 올리고 1,4, 조합 결찰 8 게놈 DNA 5의 조각화 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 프로그램 마이크로 어레이 2,3,6,7-에 합성 (OLS), 조립 등 다양한 방법을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 프로모터의 라이브러리의 구조를 설명 변종 OLS와 pMPRA1 및 pMPRAdonor1 벡터 (각각 Addgene ID를 49349 및 49352; http://www.addgene.org)를 사용하여, 배양 된 포유류 세포 및 후속 정량에이 라이브러리의 일시 발현을 관련 태그의 깊은 시퀀싱 (태그-SEQ)에 의해 프로모터 활동. 이 프로토콜의 이전 버전 (2013) 연구 23, 800-811 멜린 니코 등. 자연 생명 공학 30, 271-277 (2012)과 Kheradpour 등. 게놈에보고 된 연구에 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>올리고뉴클레오티드 라이브러리 합성</td><td>Agilent, CustomArray 또는 기타 OLS 공급업체</td><td>사용자 정의</td><td>OLS 구성 방법을 사용하는 경우</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRA 플라스미드 백본</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 ORF 공여체 플라스미드</td></tr><tr><td>TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td><td>Generic</td><td>n/a</td><td>OLS buffer</td></tr><tr><td>Novex TBE-Urea Gels, 10%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX</td><td>OLS 제품의 PAGE 정제</td></tr><tr><td>Novex TBA-Urea 샘플 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>OLS 제품의 PAGE 정제</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGE OLS 제품의 정제</td></tr><tr><td>Micellula DNA Emulsion & 정제 키트</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>에멀젼에 의한 라이브러리 증폭</td></tr><tr><td>PCR Herculase II Fusion DNA 중합효소</td> 에멀젼용 <td>애질런트</td><td>600675</td><td>중합효소 PCR</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0123S</td><td>pMPRA 벡터를 사용한 라이브러리 클로닝</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142S</td><td>pMPRA 벡터를 사용한 라이브러리 클로닝</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>pMPRA 벡터를 사용한 라이브러리 클로닝</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제(2,000,000 단위/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>pMPRA 벡터를 사용한 라이브러리 클로닝</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td>pMPRA 벡터를 사용한 라이브러리 클로닝</td></tr><tr><td>LB 한천 및 카르베니클린을 사용한 액체 배지</td><td>일반</td><td>n/a</td><td>성장 배지 클로닝</td></tr><tr><td>E-Gel EX 겔 1%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>라이브러리 검증 및 정제</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gel, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>라이브러리 검증 및 정제</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>라이브러리 및 백본 정제</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>라이브러리 DNA 분리</td></tr><tr><td>세포 배양 배지</td><td>n/a</td> 해당 <td>없음</td><td>실험별</td></tr><tr><td>형질주입 시약</td><td>해당</td><td>없음</td><td>해당 없음 실험별</td></tr><tr><td>MicroPoly(A)Purist Kit</td><td>Life</td><td>Technologies AM1919</td><td>mRNA 분리</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>플라스미드 DNA 제거</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Life Technologies</td><td>18080-051</td><td>cDNA 합성</td></tr><tr><td>PfuUltra II 핫스타트 PCR 마스터 믹스</td><td>Agilent</td><td>600850</td><td>Tag-Seq PCR 프라이머용 중합효소</td></tr><tr><td>(텍스트 참조)</td><td>IDT</td><td>맞춤형</td><td>PAGE 정제 Tag-Seq 프라이머</td></tr></tbody></table>

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

유전자 리포터 분석은 DNA 염기서열과 유전자 조절 활동 사이의 관계를 해부하기 위한 잘 정립되고 강력한 도구입니다. 그러나 이 분석의 잠재적 처리량은 단백질 형광 또는 효소 활성을 조절 활성의 대용물로 사용하여 관심 있는 각 염기서열의 활성을 개별적으로 복제하고 분석해야 하는 필요성에 의해 제한되었습니다. 최근 high-throughput DNA synthesis 및 sequencing 기술의 발전으로 인해 reporter constructs의 대규모 라이브러리의 구성 및 심문을 다중화하여 이러한 한계를 극복할 수 있게 되었습니다. 이 프로토콜은 단일 세포 배양 접시에서 수십만 개의 추정 조절 서열을 직접 비교할 수 있는 MPRA(Massively Parallel Reporter Assay)의 구현을 설명합니다.

MPRA 고해상도, 전사 조절 요소의 시퀀스 - 활성 관계를 정량적으로 절개를 용이하게한다. 성공적인 MPRA 실험은 전형적으로 형질 라이브러리 (도 3a)에서 서열의 대부분 고도로 재현 가능한 측정 값을 수득한다. 나쁨 재현성 (도 3b)이 관찰되는 경우, 이는 정량 서열 중 하나) 낮은 절대 활성, 또는 2) 낮은 형질 감염 효율 하나에, 회수 된 RNA 샘플에서 리포터의 mRNA 너무 낮은 농도를 나타낸다. 도 4는 시금 생성 대표적인 &quot;공간 정보&quot;를 보여준다 ~ 1,2 또는 센다이 바이러스에의 노출없이 HEK293 세포에서 인간 IFNB 유전자의 상류에 145 bp의 서열의 임의의 변형 37000. 발기인 TATA 박스 알려진 근위 증강 (10)는 명확하게 정보가 풍부한 REGI으로 식별 할 수 있습니다바이러스 의존적으로 기능. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> 그림 3 태그-SEQ 재현성. 고 (A)과 낮은 (B) 재현성이 독립적 인 복제 형질에서 태그-SEQ 데이터의 예를 나타내는 산포도. 후자의 플롯은 반복에의 한 높은 mRNA의 수가 많은 아웃 라이어의 태그를 보여줍니다. 이러한 유물은 일반적으로 기자의 mRNA의 농도 인해 기자의 구조 중 낮은 절대 활동, 또는 낮은 형질 전환 효율에 하나, 정량적 PCR 증폭 너무 낮았다을 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> 인간의 IFNB 전사 시작 사이트와 근위 증강의 그림 4 정보 배출량 측정. </str옹&gt; 상류 IFNB 인간 유전자의 뉴클레오티드 145 (NT) 영역의 약 37,000 랜덤 변형 (A)로 및 센다이 바이러스 (B)의 노출없이 HEK293 세포를 사용 MPRA 분석 하였다. 파란색 막대는 각 위치에서 리포터 출력 및 뉴클레오타이드 간의 상호 정보를 나타낸다. 근위 증강 및 TATA 박스는 바이러스 감염시 높은 정보 콘텐츠의 영역으로 눈에 띄는.

유전자 리포터 분석은 DNA 염기서열과 유전자 조절 활동 사이의 관계를 해부하기 위한 잘 정립되고 강력한 도구입니다. 후보 조절 요소를 식별 염기서열 태그를 운반하는 리포터 유전자에 결합하면 이러한 분석의 대규모 병렬화가 가능합니다.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

이 절차의 전반적인 목표는 수천 개의 DNA 염기서열의 유전자 조절 활동을 병렬로 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 관심있는 DNA 염기서열이 3 개의 프라임 your에 하나 이상의 식별 서열 태그가있는 리포터 유전자에 연결되어있는 리포터 라이브러리를 구축함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 이 리포터 라이브러리를 세포 집단으로 형질주입하는 것입니다.마지막 단계는 심층 염기서열분석을 통해 reporter mRNAs 및 해당 reporter library에서 각 식별 서열 태그의 발생 횟수를 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 염기서열 태그 수의 컴퓨터 분석을 통해 DNA 염기서열과 유전자 조절 요소의 활동 사이의 관계를 추론하는 데 사용할 수 있습니다. 루시페라아제 또는 GFP 기반 리포터 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 배양된 세포의 단일 접시에서 수천 개의 조절 염기서열을 분석할 수 있다는 것입니다.이 방법은 프로모터 또는 인핸서 내의 어떤 뉴클레오티드가 필수 기반 활성을 기반으로 하는지와 같은 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 특정 세포 상태에서의 활성에 대한 추정 조절 요소의 대규모 라이브러리를 스크리닝하는 것과 같은 다양한 다른 실험 설계에 사용할 수 있습니다. 리포터 라이브러리 구축 절차를 시연하는 것은 생명공학 연구소의 선임 연구원인 Peter Rugo가 시연할 것이며, 리포터 라이브러리 TRANSFECT 및 RNA 회수는 내 그룹의 선임 연구원인 Lee Wang이 될 것이며, 대규모 병렬 리포터 분석은 이후 NPRA라고 하며 규제 활동을 위해 분석할 염기서열의 설계 및 합성으로 시작합니다.그리고 태그는 하나 이상의 식별 태그를 나타냅니다. KPN one과 XBA one 제한 사이트가 그 사이에 있습니다. 합성된 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 100마이크로리터의 TE 0.1 완충액에 재현탁합니다.10%TBE 요소 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 실행합니다. 각 레인에 약 1개의 ole을 로드하고 단일 가닥 DNA에 민감한 형광 염색으로 겔을 분석합니다. 전장 올리고뉴클레오티드에 해당하는 신중한 금지가 있는 경우, 이를 잘라내고 올리고를 100마이크로리터의 TE 0.1로 하룻밤 동안 실온에서 용리하고 겔 정제 또는 원시 올리고뉴클레오티드 라이브러리를 사용하여 진탕합니다.에멀젼 PCR을 설정하여 라이브러리를 증폭하고 SI one tails를 추가합니다. 표 2에 설명된 대로 50마이크로리터 반응을 설정합니다. 그런 다음 50마이크로리터 반응 혼합물을 my DNA 에멀젼 및 정제 키트의 오일 및 계면활성제 혼합물 300마이크로리터와 섭씨 4도의 와류 혼합물에서 5분 동안 결합하여 에멀젼으로 만듭니다.그런 다음 에멀젼을 PCR 튜브 또는 플레이트에 50 마이크로 리터 반응으로 분배하고 PCR 후 PCR의 20 사이클을 수행합니다. 350마이크로리터 에멀젼을 다시 함께 당깁니다. 그런 다음 1 밀리리터의 이소 부탄올과 와류를 혼합물에 첨가하십시오.DNA 정제 컬럼을 사용하여 증폭 산물을 간단히 정제하고 2% 또는 4% 아그로스 겔에서 Eloqua를 실행하여 품질을 평가합니다. 복잡한 오일 라이브러리의 혈청 증폭은 표현 편향, RIC Applicon 및 기타 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 추가 품질 관리에 사용되는 PCR 주기의 수를 최소화하는 것이 중요합니다.To prepare the linearized plasmid backbone을 준비하기 위해 다음 단계로 진행하기 전에 전체 염기서열분석 라이브러리를 수행하는 것이 좋습니다. 첫 번째 소화 P: 1 벡터, SFI가 있는 1 벡터, 섭씨 50도에서 2시간 동안. 그런 다음 소화된 산물을 1% gel에 실행하고 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 2.5 KILOBASE 골격 밴드에서 DNA를 수집합니다.다음으로, 같은 방법으로 에멀젼 PCR 산물을 분해하고 DNA 정제 컬럼으로 산물을 수집합니다. 이제 100 나노그램의 분해된 PCR과 50 나노그램의 선형화된 플라스미드로 접합 반응을 설정합니다. T 4 리가아제를 사용하고 다음날 섭씨 16도에서 밤새 반응을 실행합니다.결찰 반응을 섭씨 65도에서 20분 동안 가열하여 비활성화합니다. 그런 다음 결찰 반응 생성물의 2마이크로리터 분취량을 전기 역량 이퀄리의 50마이크로리터 분취량으로 변환합니다. 섭씨 37도에서 800마이크로리터의 SOC 배지에서 1시간 동안 흔들면서 세포를 회수합니다.그런 다음 모든 병렬 변환을 풀링하고 밀리리터당 50-100 마이크로그램의 탄소 페니실린으로 LB 한천에 연속 희석액을 도금하여 평가합니다. 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양하고 다음날 총 CFU를 추정합니다. 형질전환 직후, 형질전환된 세포의 나머지 부분을 사용하여 100마이크로그램/밀리리터의 탄산이 보충된 200밀리리터의 LB를 접종합니다.하룻밤 동안 섭씨 37도에서 세포를 성장시키고 다음날 흔들면서 표준 절차에 따라 혈장 DNA를 분리하여 삽입물의 존재를 확인합니다. SFI one으로 분리된 라이브러리의 부분 표본을 분해하고 1%aros gel에서 산물을 소진합니다.KPN one 및 XBA one을 사용하여 연속 분해로 plasmid 라이브러리를 선형화하고 섭씨 37도에서 KPN one으로 첫 번째 분해를 한 시간 동안 수행하고 마그네틱 비드를 사용하여 산물을 정제합니다. 둘째, XBA 1과 새우 알칼리성 포스파타아제 한 단위가 함유된 제품을 섭씨 37도에서 2시간 동안 소화합니다.섭씨 65도에서 5분 동안 반응을 비활성화한 다음 마그네틱 비드를 사용하여 생성물을 정제합니다. 1%gel에서 부분 표본을 실행하고 절단되지 않은 플라스미드가 보이는 경우 지금 선형화된 단편을 겔 정제하여 포유류 세포로의 transfection에 적합한 NPRA 라이브러리를 생성합니다. 먼저 P-M-P-R-A 기증자에서 판독 프레임 조각을 열 수 있는 호환 가능한 행운을 준비합니다.이 플라스미드를 KPN 1과 XBA 1로 섭씨 37도에서 한 시간 동안 소화합니다. 그런 다음 1%AGROS 젤에 제품을 추출합니다. 이 경우 열린 판독 프레임 조각을 1.7kbase에서 절제하고 겔 정제 스핀 컬럼을 사용하여 정제합니다.그런 다음 이전 ligation에 대해 설명한 대로 Linearized open reading frame을 Linearized intermediate library에 접합합니다. 앞서 설명한 대로 ligation 산물을 대장균 세포로 형질전환하고 최종 NPRA plasmid library를 분리합니다. 조심하지 않으면 이월하십시오.조정된 플라스미드 및 서브플레이트된 산물은 최종 플라스미드 풀에서 올바른 구조체의 비율을 크게 줄일 수 있습니다. 다음 단계를 진행하기 전에 올바른 밴드를 분리하고 배경을 확인하십시오. 수표 다이제스트로 NPRA 라이브러리의 1 또는 2 마이크로 그램의 Eloqua를 KPN 1로 요약합니다.이것을 1% 젤에 넣고 단일 밴드로 실행되면 계속 진행하십시오. 그렇지 않은 경우, 배양된 세포를 transfection하기 위한 오염을 처리하는 방법에 대해 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. NPRA와 함께.플라스미드 조건은 각 세포 유형에 맞게 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 10cm 배양 접시에서 약 50% 합류로 성장한 500만 개의 HK 2 93 T 17 세포는 30마이크로리터의 lipo LTX 및 10마이크로리터의 플러스 시약을 사용하여 10마이크로그램의 플라스미드 DNA로 형질주입될 수 있습니다. 이 경우, 약 5시간 후에 transfection mixture를 제거하고 1일 또는 2일 후 세포가 회복되도록 한 다음 세포를 수확하고 키트를 사용하여 poly positive mRNA를 분리합니다.그런 다음 태그를 만들고 시퀀싱 라이브러리를 찾아 결과를 분석합니다. NPRA는 전사 조절 요소의 서열 활성 관계에 대한 고해상도 정량적 해부를 용이하게 합니다. 성공적인 NPRA 실험은 일반적으로 Transfected 라이브러리에 있는 대부분의 염기서열에 대해 재현성이 높은 측정값을 산출합니다.재현성이 좋지 않은 경우, 회수된 RNA의 리포터 mRNA 농도가 너무 낮을 수 있습니다. 이는 분석 염기서열 간의 절대 활성이 낮거나 transfection 효율이 낮기 때문에 발생할 수 있습니다. 이러한 성공적인 n PRAs에서는, 인간 인터페론 beta 유전자의 1 45의 기본적인 쌍 순서의 37, 000의 변이체는 sendi 바이러스에 노출 유무에 관계없이 분석되었다.프로모터 Tata box와 알려진 근위 인핸서(proximal enhancer)는 바이러스 의존적 방식으로 정보가 풍부한 영역으로 명확하게 식별될 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다. EMCE 및 단백질 DNA 친화성 캡처와 같은 다른 방법은 활성 DNA 염기서열 내에서 중요한 뉴클레오티드에 결합하는 전사 인자와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 수천 개의 DNA 염기서열의 유전자 조절 활동을 병렬로 분석하기 위해 리포터 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포...

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.

엔지니어링 된 HEK 세포를 사용하여 MRGPRX2를 활성화하는 펩티드 스크리닝

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

배우세요 대규모 병렬 리포터 분석(MPRA)을 사용하여 수천 개의 DNA 서열에서 유전자 조절 활성을 동시에 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 배양된 포유동물 세포에서 고속 처리 분석을 가능하게 합니다.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

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