세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

이 절차의 목적은 oh 80 Chromatin 리모델링 복합체에서 다중 소단위체의 야생형 및 돌연변이체 버전을 생성하고 정제하는 것입니다. 이는 먼저 O 80 단백질에 태그가 지정된 플래그 에피토프를 발현하는 세포에서 핵을 분리하여 수행됩니다.두 번째 단계에서는 핵 추출물을 준비한 다음 O 80 염색질 리모델링 복합체의 야생형 또는 돌연변이 인간을 Anti-Flag aros 크로마토그래피로 정제합니다. 궁극적으로, 정제된 NO 80 복합체의 소단위 조성은 웨스턴 블롯 또는 은 염색에 의해 분석될 수 있습니다.

이 방법은 MultiPro 염색질 리모델링 복합체의 소단위가 전체 활동에 어떻게 기여하는지에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 NO 80 염색질 리모델링 복합체의 야생형 및 돌연변이 버전을 연구하기 위해 특별히 고안되었지만 다른 다중 소단위 핵 복합체를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 중재자처럼.

절차의 가장 중요한 단계는 핵 추출 단계입니다. 소금 추출 단계에서 사람들은 소금을 너무 빨리 또는 너무 격렬하게 첨가하는 경향이 있기 때문에 사람들은 일반적으로 문제에 부딪히게 됩니다.배양 후 롤러 병에서 HEC 2 9 3 셀을 적절한 크기의 눈금이 매겨진 원뿔형 튜브로 옮기고 G 1000배와 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시킵니다. supinate를 제거한 후, 패킹된 cell pellet의 부피를 측정한 다음, 부드러운 피펫팅으로 pellet를 5팩 용량의 buffer A에 다시 현탁시키고 정확히 10분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다.

세포를 다시 회전시킨 후 세포 펠릿을 두 번째로 측정하면 크기가 최대 2배까지 증가해야 합니다. 이번에는, 완충액 A의 2 팩 세포 부피에 세포를 다시 현탁시킨 다음 세포 현탁액을 적절한 크기의 다운 조직 균질기로 옮기고 세포의 90 %가 트리안 블루 원심 분리기로 긍정적으로 염색 될 때까지 느슨한 유리 유봉으로 세포 현탁액을 균질화하고, 25에서 20 분 동안 45 밀리리터 고속 원심 분리기 튜브에서 균질화 된 세포, 000 번 G 및 섭씨 4도, 고정 각도 로터에서. 그런 다음 핵 펠릿에서 세포질 단백질을 포함하는 SUP natant를 제거하여 염으로 핵을 추출합니다.

이제 2.5 밀리리터의 버퍼 C를 추가하되 시작 패킹 셀 부피 3 밀리리터마다 펠릿에 추가합니다. 그런 다음 혈청학 피펫을 사용하여 튜브 벽에서 펠릿을 제거하고 전체 혼합물을 적절한 크기의 다운 균질기로 옮깁니다. 느슨한 절굿공이를 두 번 쳐서 혼합물을 균질화하여 핵을 현탁시킨 다음 재현탁액 nu 핵 분획을 현탁액이 비커를 최소 0.5cm 깊이로 채울 수 있는 크기의 냉각된 비커로 옮깁니다.

다음으로, 다음 공식에 따라 용액을 0.42 몰 염화나트륨의 최종 농도로 가져오는 데 필요한 5몰 염화나트륨의 부피를 계산합니다. 이제 계산된 부피의 염 용액을 한 방울씩 점차적으로 첨가하면서 얼음 위에 유리 막대로 현탁액을 부드럽게 주연을 쳐서 염화나트륨이 모두 추가되고 용액이 매우 점성이 될 때까지 현탁액의 염 농도를 높입니다. 다음 주의깊게 모자 집합을 가진 유형 45 TI 회전자에 있는 70 밀리리터 폴리탄산염 관으로 점성 현탁액을 옮기고 30 분 후에, 40, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에 30 분 동안 TI 45 회전자에 있는 표본을 흔드는 돌연변이원자를 사용하기 위하여 돌연변이체를 사용하십시오, 그리고 상등액을 함유한 핵 추출물을 단일 플라스틱 용기로 당깁니다.

그런 다음 핵 추출물 용액을 편리한 크기의 분취 표본으로 나누고 액체 질소에 얼린 다음 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 면역 정제를 위해 Anti-Flag aros를 준비하려면 먼저 팁 컷오프가 있는 200마이크로리터 피펫을 사용하여 50% Anti-Flag aros 비드 슬러리를 통해 200마이크로리터를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 이송합니다. 실험실 회전기에서 느린 회전으로 섭씨 4도의 시간 전에 갓 해동된 핵 추출물 10밀리리터가 들어 있는 원뿔형 튜브로 미리 세척된 비드를 옮긴 다음 1000회 G 및 섭씨 4도의 5분 동안 원심분리로 깃발을 수집합니다.

다음으로, 비드 추출물 P를 10ml의 이, 4개의 50 버퍼로 섭씨 4도에서 5분 동안 돌연변이원을 부드럽게 흔들어 세척합니다. 그런 다음 비드 추출물 혼합물을 회전시킨 후 다시 한 번 재사용합니다. 펠릿을 100-150 마이크로 리터의 신선한 이가 4 50에 매달아 놓고 비드를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

모든 비드가 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨질 때까지 100-150마이크로리터의 Lysol 50 쿼트로 15리터 원뿔형 튜브를 계속 헹굽니다. 마이크로 원심 분리기에서 비드를 회전시킨 후 1ml의 lys four 50으로 3회, EB 100.Buffer 1ml로 한 번 세척합니다. 그런 다음 결합된 단백질을 용리시키기 위해 플래그 펩타이드가 포함된 EB 100 완충액 200마이크로리터를 추가하고 너트에서 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다.

30분 후, 얻은 마이크로 원심분리기에 비드를 펠릿화한 다음 OAC C 복합체에 용리된 SUP natant를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. elucian을 4회 더 반복한 후 당겨진 용리액을 빈 스핀 컬럼에 통과시켜 단백질 분획에서 잔류 플래그 에어로 비드를 제거합니다. 마지막으로, 50, 000의 분자량 커트오프를 가진 원심 매우 여과 장치를 대략 10 겹 암시한 단백질 조각을 집중하기 위하여 사용하십시오.

이 그림에서 설명되는 바와 같이, 방금 시연된 바와 같이 표시된 플래그 태그 소단위체를 사용하여 제조된 NO 80 복합체의 순도는 은 염색 SDS 폴리 아크릴아미드 겔을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 제어 레인에 나타나는 모든 단백질은 플래그 에어로에 비특이적으로 결합하는 오염 물질입니다. 이 레이블은 테스트된 NO 80 소단위에 해당하는 금지를 나타내며 이는 분자량 마커의 이동성을 나타냅니다.

야생형 NO 80의 위치는 검은색 사각형으로 표시되고 NO 80 돌연변이의 위치는 열린 원으로 표시됩니다. 검은색 선으로 분리된 레인은 별도의 겔입니다. 복합체의 조성은 다양한 NO 80 subunit에 대한 항체를 사용하여 Western blott에 의해 평가할 수 있습니다.

예를 들어. 다음은 엔드 터미널 도메인 모듈, Helicase 센터 관련 모듈 및 SNF 2 모듈의 하위 단위가 평가되었습니다. 이 기술을 숙달하면 세포 채취부터 시작하여 복합체 정제까지 하루 안에 완료할 수 있습니다.

이 기술을 통해 연구자들은 포유류 세포의 기능을 연구하기 위해 포유류 세포에 대한 다중 소단위 복합체와 하위 복합체를 정제할 수 있습니다. 이 동영상을 시청하면 인간 세포 또는 다른 운동량 세포주에서 염색질 리모델링 및 기타 다중 소단위 단백질 복합체를 정제하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.