Name: 세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 배우세요 HEK293 세포에서 INO80 염색질 리모델링 복합체를 정화하는 방법을. 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 야생형 및 돌연변이 복합체를 분석하고 서브유닛 구성을 연구할 수 있습니다.

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저자의 연구실에서의 연구는 National Institute of General Medical Sciences(GM41628)의 보조금과 Greater Kansas City Community Foundation의 Helen Nelson Medical Research Fund에서 Stowers Institute for Medical Research의 보조금으로 지원됩니다.

1 세대와 전체 길이 또는 FLAG의 돌연변이 버전 표현 HEK293 안정 세포주의 문화 에피토프를 - 태그 Ino80 또는 기타 INO80 복잡한 서브 유닛 <ol><li> 전체 길이 또는 돌연변이 인간 Ino80 ATPase의 또는의 프레임, N 단자 FLAG 에피토프 태그 포유 동물 발현 벡터 pcDNA5 / FRT로 다른 INO80 서브 유닛을 코딩하는 cDNA 클론. </li><li> 진행하기 전에 DNA 시퀀싱에 의해 삽입 된 cDNA의 서열을 확인한다. </li><li> 형질 감염을 수행하려면, DMEM (둘 베코 변형 이글 중간), 5 %의 글루타민을 함유하는 배지에서 10cm 조직 배양 접시에 HEK293 세포에서 FLP을 성장에, 10 % FBS (소 태아 혈청). </li><li> 세포 ~ 70 % 컨 플루 도달하면, 전체 부피에서, 각각의 조직 배양 접시에 FuGENE6 형질 감염 시약 40 μL, 적절한 pcDNA5 / FRT 발현 플라스미드 0.5 μg 및 FLP 재조합 효소를 암호화 pOG44, 9.5 μg의 혼합물을 추가 800 μL의. </li><li> 48 시간 후,를 Trypsinize와의PLIT 1시 반 (10)에 접시 형상의 비율로 세포를, 5 % 글루타민, 10 % FBS DMEM으로 그들을 성장하고, 3, 100 μg / ㎖ 하이 그로 마이신 B - 4 주. (- 5 일 일반적으로 매 3) 노란색으로 시작 때마다 배지를 변경합니다. </li><li> FLAG-태그 된 단백질의 최고 레벨을 표현하는 포지티브 클론을 확인하기 위해, 개별적인 하이 그로 마이신 B 내성 콜로니를 선택하고, 24 웰 플레이트의 한 웰에 전송할. <ol><li> 세포를 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 ~ 1 ml의 PBS 및 펠릿의 각 웰에서 80 % 컨 플루 수확 셀에 도달하면. </li><li> 상등액을 제거한 후, SDS-PAGE 샘플 완충액 60 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> SDS 페이지와 FLAG의 발현을 모니터링하는 서양 모래 바닥에 재현 탁 세포 펠렛의 주제 절반 미끼 단백질을 태그; 향후 분석을 위해 나머지 절반을 저장합니다. </li></ol></li><li> 더 FLAG-태그 된 인간 Ino80 단백질은 세포 용 해물에서 검출되지 않으면, 초기 클론 세포를 확장 백성들이 란15cm 조직 배양 접시에 24 웰 플레이트의 한 우물에서 세포를 도금 더 만큼은. <ol><li> 15cm 요리, 50 ML 원뿔 튜브에 얼음 차가운 PBS에 합류 세포 근처에 resuspend 및 전송에서 세포를 수확합니다. </li><li> 추가 PBS를 첨가하여 50 ㎖의 최종 부피로 준비한다. </li><li> 펠릿을 5 분 동안 1,000 XG에 세포 및 상등액을 최대한 제거한다. </li><li> Lys450 완충액 1 ㎖에서 세포 펠릿 (20 mM의 HEPES-NaOH를 pH를 7.9, 450 mM의 염화나트륨을 재현 탁, 0.5 % 트리톤-100, 10 mM의 KCl을 4 mM의 MgCl2를, 0.2 mM의 EDTA, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT, 200 μM의 PMSF, 1 : 1000 프로테아제 억제제 칵테일). 참고 : 여기와 다른 곳에서 항상 즉시 실험을 시작하기 전에 버퍼에 DTT, PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. </li><li> 면역 침전 방지 FLAG 아가로 오스 겔의 20 μl를 사용하여 결과 전체 세포 용 해물에서 단백질을 FLAG는 - 태그 및 서부 블로 팅에 의해 FLAG 용출액을 분석 할 수 있습니다. [immun의 자세한 내용은oprecipitation 절차, 단계 5 참조] </li></ol></li><li> 원하는 클론 세포 라인 (12)의 냉동 주식을 준비하고 사용할 때까지 액체 질소에 보관합니다. </li></ol> 롤러 병에 2 성장 HEK293 세포주 INO80 단지의 대규모 준비를 위해, 배양 세포를 10 - 20 롤러 병; 각 롤러 병에서 전형적인 수율은 포장 세포의 ~ 1 ML입니다. <ol><li> 각 롤러 병으로, 하이 그로 마이신 B를하지 않고 200 ㎖의 DMEM 5 % 글루타민, 10 %의 혈청을 추가 </li><li> 각 롤러 병에 단일 근 합류 15cm 접시에서 세포를 모두 전송 </li><li> 장소 롤러 37 ° C 롤러 병 인큐베이터에 병은 0.2 rpm으로 회전합니다. </li><li> 세포 ~ 70 %의 포화 상태에 도달하면, 부어 및 매체를 폐기합니다. </li><li> 각 병에 ~ 얼음 50 ㎖의 차가운 PBS를 추가합니다. 병을 잡고 수평으로 부드럽게 세포 단일 층을 풀어 소용돌이 친다. </li><li> 250 ml의 플라 스트에 재현 탁 세포로 이동IC 원뿔 병 및 얼음에 장소. </li><li> 추가 PBS와 롤러 병을 씻어 병하는 병에서 순차적으로 전환하기. 세정액이 더이상 분명 (전형적으로는 약 5 병을 린스하기 위해 사용 된 후) 없을 때, 세포 현탁액에 추가. </li><li> 를 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리에 의해 펠렛. </li><li> 부드럽게 PBS로 세포를 재현 탁 한 250ml의 원추형 병로 결합하고, 추가 처리 될 때까지 얼음 상에 유지한다. </li></ol> 또 다른 FLAG-태그 INO80 서브 유닛을 발현하는 세포에서 INO80 서브 유닛의 3은 siRNA를 매개 넉다운 하나의 서브 유닛이 부족 INO80 서브 콤플렉스를 얻으려면 사용 FLAG-immunopurification 안정적으로 shRNA를 발현 siRNA를 처리 한 세포 또는 세포로부터 INO80 단지를 정화합니다. (작은 간섭 RNA) 형질 전환 프로토콜이 여기에 설명 된 &quot;역&quot;의 siRNA는 15cm 접시에서 성장 HEK293 세포에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 세포와의 소 단일 15cm 접시입니다ULD 필요한 세포의 수에 따라 적절하게 확장 할. siRNA를 처리 한 세포에서 INO80 단지의 생화학 적으로 유용한 금액을 준비하기 위해, 하나는 40 15cm 접시에서 자란 문화까지 확장한다 패킹 된 세포 펠렛을 4 ml의 -이 약 2를 수득한다. <ol><li> 안정적으로 15cm 요리에 가까운 포화 상태에 INO80 단지의 원하는 서브 유닛을 표현하는 HEK293 세포를 성장. </li><li> 의 siRNA 재현 탁 완충액의 부피 추가 (20 mM의 KCl을, 6 mM의 HEPES pH가 7.5, 0.2 mM의 MgCl2를) 충분한 동결 건조 된 siRNA를 포함하는 siRNA를 튜브의 50 μM 원액을 제조 하였다. 솔루션을 위로 피펫 몇 번 아래로 siRNA를 완전히 용해하기 위해 실온에서 30 분 동안 nutator에 품어. </li><li> siRNA를 형질 전환 및 시약을 포함하는 형질 전환 칵테일을 준비합니다. 매우 부드러운 혼합과 혈청 중 감소 32 ㎕의 리포 펙 타민 RNAiMAX로 50 μM의 siRNA 원액의 10 μl를 혼합하고 옵티-MEM의 4 ML에 추가; 알낮은 모든 시약은 사용 전에 실온으로 평형을 유지한다. </li><li> 30 분 동안 RT에서 혼합물을 배양한다. </li><li> 안정적으로 형질에 대해 원하는 INO80 서브 유닛을 표현 FLP-에서 HEK293 세포를 준비합니다. <ol><li> 단계 3.4의 배양 동안 RT PBS로 한번 15cm 접시에 세포를 씻으십시오. </li><li> 그들은 판을 들어 올릴 시작 때까지만 PBS를 제거한 후, 1 ml의 트립신으로 세포를 취급합니다. </li><li> 즉시 세포를 트립신 부드럽게 섞어 완전 배지 (DMEM + 5 % 글루타민 + 10 % FBS) 10 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> ~ 4 ml의 완전 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 계를 사용하여 셀 재 부유 카운트. </li><li> ~ 5.4 × 106 / ㎖의 농도로 완전 배지와 세포를 희석. </li></ol></li><li> 각 15cm 접시에, 4 ml의 형질 칵테일 다음 15 ㎖의 전체 문화 매체를 추가합니다. thoro있는 중간 형질 칵테일을 보장하기 위해 부드럽게 소용돌이ughly 혼합. 마지막으로, 세포를 균일하게 분산시키는 것이 부드럽게 소용돌이 다시 세포 현탁액 중 하나 mL를 넣고. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 배양 60 시간 후, 부드럽게 매체, 얼음 차가운 PBS에 재현 탁 세포를 제거하고 핵 추출물을 준비하는 즉시 진행합니다. </li></ol> 핵 추출물 (4) 준비 이 절차 (13)의 Dignam 프로토콜에서 수정 된 세포 펠렛을 시작 크기에 따라 상하 또는 축소 될 수있다. 일반적으로, 압축 된 세포 펠렛 수율 최종 핵 추출물 1 ㎖를 1 ㎖. 모든 버퍼는 차가운 얼음해야하고, 적당한 차가운 방을 사용할 수없는 경우 모든 단계는 추운 방에서 또는 얼음에서 수행해야합니다. <ol><li> 핵의 분리 : <ol><li> 조심스럽게 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 (15 또는 50 ml)을 적절하게 크기에 세포를 원뿔 튜브와 스핀 졸업 전송할 수 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 포장 세포 화소의 양을 측정할 수 있습니다. 포장 된 세포의 1 ㎖를 2 ~ 3 × 10 8 HEK293 세포에 해당합니다. </li><li> 5 포장 셀 버퍼의 볼륨 (1,000 프로테아제 억제제 칵테일 10 mM의 HEPES, pH가 7.9, 1.5 mM의 MgCl2를, 10 mM의 KCl을 갓 1 mM의 DTT, 200 μM의 PMSF를 첨가하고, 1)를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅하여 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 정확히 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 펠렛은 세포 상층 액을 제거합니다. </li><li> 세포 펠렛의 크기는 버퍼 A.에서 배양시 2 배까지 증가해야 </li><li> 버퍼의 충전이 셀 볼륨에서 세포를 재현 탁하고, 적절한 크기의 다운스 균질 조직에 세포 현탁액을 전송. 패킹 세포 미만 2ml를 시작하면, 7 ㎖의 균질화를 사용; 2 - 4 ml의 포장 세포, 15 ㎖의 균질화를 사용; 및 포장 세포의 10 이상 ML를 들어, 40 ㎖의 균질화를 사용합니다. </li><li> 다운스 균질 유엔의 LOOSE 유리와 유 봉, 세포 현탁액을 균질화세포의 90 % 참깨 1 % 트리 판 블루로 염색 긍정적. </li><li> JA-17 또는 이와 유사한 회에서 4 ° C에서 20 분 동안 25,000 XG에 45 ㎖의 고속 원심 분리기 튜브와 스핀에 현탁액을 전송 (자재 / 장비의 표 참조). </li><li> 핵 펠렛에서 세포질 단백질이나 분별 동안 핵 밖으로 누출 단백질을 포함하는 상층 액을 제거합니다. </li></ol></li><li> 소금 핵을 추출 : <ol><li> 추가 버퍼 C (를 20mM HEPES, 산도 7.9, 25 % 글리세롤, 1.5 mM의 MgCl2를, 0.2 mM의 EDTA, 갓 추가 한 mM의 DTT, 200 μM의 PMSF, 1 : 1000 프로테아제 억제제 칵테일) 핵 펠렛에; 포장 세포 부피 (~ 1 × 109 세포를) 시작하는 매 3 ㎖의 2.5 ml의 버퍼 C를 사용합니다. </li><li> 유리로드 또는 피펫을 사용하여, 관의 벽에서 핵을 제거하고 펠릿을 적절한 크기의 다운스 균질 혼합물 전체에 옮긴다. </li><li> 번째 균질화하여 핵을 재현 탁LOOSE 유 두 스트로크 전자 혼합물. </li><li> 냉장 비커에 재현 탁 핵 부분을 전송합니다. 서스펜션 깊은 적어도 0.5 cm로 비커를 채울 것 같은 것을 비커를 선택합니다. </li><li> 부드럽게 얼음에 피펫 또는 유리 막대로 현탁액을 교반하면서 염색질 또는 다른 불용성 구조에서 핵 단백질을 추출하려면, 서서히 5 M NaCl을 적가하여 0.42 M 염화나트륨으로 서스펜션의 소금 농도를 증가; 5 M NaCl을 모두 첨가 한 후, 용액은 매우 점성 또는 겔형이 될 것이다. M의 NaCl은 다음 식에 따라 0.42 M 염화나트륨의 최종 농도로 용액을 가지고 필요한 5의 체적을 계산한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> 조심스럽게 유형 45 티 O를위한 유형 70.1 티 로터에 10 ㎖의 폴리 카보네이트 튜브에 점성 현탁액을 전송 (또는 동급) 또는 70 ㎖의 폴리 카보네이트 병비슷한 로터 (자재 / 장비의 표 참조) r에. 70 ㎖의 병을 사용하는 경우 10 ㎖의 튜브를 사용하거나 캡 어셈블리 경우 파라 필름으로 단단히 밀봉합니다. </li><li> 천천히 nutator를 사용하여 30 분 동안 4 ° C에서 밀봉 된 튜브 바위. </li><li> 4 ° C에서 120,000 XG에 45 형 티 또는 30 분 동안 70.1 티 로터에 샘플을 스핀. </li><li> 하나의 플라스틱 튜브 나 병에 뜨는을 전송합니다. 이 상층 액은 핵 추출물, 그리고 펠렛 염색질 및 기타 핵 파편이 포함되어 있습니다. </li><li> 편리 크기 분취에 핵 추출물을 나누 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 인간 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 5 면역 정화 <ol><li> 냉동 핵 추출물을 해동, 동결 물까지 손 사이의 벤치 탑 또는 롤 튜브 추출물을 포함하는 장소 튜브 슬러리된다. 추출물 완전히 t 될 때까지 얼음 또는 차가운 방에 튜브를 배치hawed. </li><li> 동결 - 해동 사이클 동안 형성 할 수있는 어떤 침전물을 제거하는 유형 70.1 티 로터 또는 동급에서 4 ° C에서 20 분 동안 100,000 XG에서 해동 핵 10 ㎖의 폴리 카보네이트 초 원심 분리기 튜브에 압축 스핀을 전송합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 뜨는을 전송합니다. 1000 프로테아제 억제제 칵테일 : 1 mM의 DTT, 200 μM의 PMSF, 그리고 하나의 최종 농도에 신선한 DTT, PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. </li><li> , immunopurification에 대한 항-FLAG 아가로 오스를 준비 끝이 깨끗한 메스로 절단되어있는 팁 P200 또는 유사한 피펫을 사용하여 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 안티-FLAG 아가로 오스 비즈의 50 % 슬러리 200 μl를 전송하려면 또는 면도날. </li><li> 30 초 동안 8,000 XG에서 벤치 탑의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 상층 액을 제거하고, Lys450 버퍼의 1 ㎖에 구슬을 재현 탁하여 구슬을 세척하고, 30 초 동안 8,000 XG에 구슬을 펠렛. B를 세척두 번 더 EADS. </li><li> 끝이 깨끗한 메스 또는 면도날과 같은 팁을 사용, 양도와 차단되어있는 팁 P200 또는 유사한 볼륨 조절 피펫을 사용하여 핵 추출물의 약 100 μL의 세척 방지 FLAG 아가로 오스 비즈를 재현 탁 추출물을 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 재현 탁 구슬. 구슬의 모두 15 ML 튜브로 전송 될 때까지 몇 번을 반복합니다. </li><li> 실험실 회전에 느린 회전 4 ° C에서 4 시간 동안 추출 / 비드 혼합물을 품어. OPTIONAL : DNA 오염을 제거하기 위해 25 단위 / ml의 농도로 benzonase 포함한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 FLAG 아가로 오스를 수집합니다. </li><li> 10 ml의 Lys450에서 재현 탁은 씻어 부드러운가 nutator에 락과 4 ° C에서 5 분간 배양한다. 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에 구슬을 펠렛. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 Lys450 및 전송 비즈 150 μL - (100)에서 재현 탁. 공동모든 구슬이 microcentrifuge 관에 전송 될 때까지 Lys450 150 μL - ntinue 100과 15 ML 원뿔 튜브를 세척합니다. </li><li> 마이크로 원심에서 4 ° C에서 30 초 동안 8,000 XG에 구슬을 스핀 다운. 1 ㎖의 EB100 버퍼 (10 mM의 HEPES pH가 7.9, 10 % 글리세롤, 100 mM의 염화나트륨, 1.5 mM의 MgCl2를, 0.05 %는 트리톤-100, 갓 추가 한 mM의 DTT, 200 μM의 PMSF 회 1 ml의 Lys450로 3 회 이상 세척하고 및 1 : 1000 프로테아제 억제제 칵테일). </li><li> , 결합 된 단백질을 용출 0.25 ㎎ / ㎖ 1 배 FLAG 펩타이드를 포함하는 200 μL의 EB100 버퍼를 추가합니다. nutator에 4 ° C 각각에서 30 분을 품어. </li><li> 마이크로 원심에서 4 ° C에서 30 초 동안 8,000 XG에 구슬을 펠렛. 새로운 microcentrifuge 관에 용출 INO80 복합체를 포함하는 상층 액을 전송합니다. </li><li> 용출 네 번 이상 반복 한 하나의 튜브로 모든 상층 액을 풀. </li><li> 용출 된 단백질 분획으로부터 잔여 FLAG-아가 로스 비드를 제거하려면,빈 스핀 칼럼을 통해 용출액을 전달합니다. </li><li> 용출 된 단백질 분획을 농축 ~ 10 배의 초 원심 분리 필터 장치 (50,000 분자량 컷오프)을 사용. </li><li> FLAG 펩티드를 제거하려면이 탈염 컬럼을 통해 농축 된 단백질 분획을 순차적으로 전달합니다. </li><li> 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 보관, 20 ㎕의 분취 액으로 정제, 탈염 단백질 분획을 나눈다. </li><li> 실버 스테인드 젤 또는 웨스턴 블롯에 의해 INO80 또는 INO80의 서브 콤플렉스의 서브 유닛의 구성을 분석하고 표준으로 알려진 농도의 재조합 INO80 서브 유닛의 준비를하여 반 정량적 웨스턴 블로 팅하여 농도를 추정한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

고등 진핵생물의 다중 소단위 포유류 염색질 리모델링 복합체의 구조적 및 기능적 연구는 돌연변이 서브유닛을 포함하거나 특정 서브유닛이 전혀 결여된 생화학적으로 유용한 양의 복합체를 준비하는 데 어려움을 겪었습니다. 여러 가지 기술적 장애물이 있습니다. 첫째, 포유류 세포의 유전자 조작은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸렸습니다. 재조합 기술을 사용하여 게놈을 쉽게 편집하고 표적으로 삼을 수 있는 효모 세포와 달리 포유류 게놈은 구조적으로 더 복잡하고 재조합 개입에 덜 민감합니다. 따라서 배양된 세포 또는 동물에서 포유류 유전자의 결실 또는 변형은 더 많은 시간이 소요되고 더 전문적인 전문 지식이 필요합니다. 결과적으로, 구조적 돌연변이를 운반하거나 서브유닛(들)의 하위 집합이 부족한 돌연변이 포유류 복합체의 생성은 속도를 제한했습니다. 둘째, 이종 단백질 발현 시스템을 사용하는 생화학적 재구성 접근법은 정의된 다중 단백질 어셈블리를 생성하는 데 자주 사용됩니다. 그러나 이러한 접근법은 서브유닛이 적절한 화학량론으로 동시에 발현되거...

진화 적으로 보존 SNF2 가족 염색질 리모델링 복합체는 염색질 조직 및 DNA 접근성 하나의 주요 레귤레이터이다. 이러한 개조 착체는 항상 어떤 경우에는 다양한 액세서리 단백질과 조립 및 다중 서브 유니트 매크로 분자 어셈블리를 형성하고, 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛을 포함한다. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 과정의 상세 분자를 연구하기 위해,이 착물의 활동 서브 유닛 및 / 또는 도메인 구조의 주어진 서브 세트의 기여를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 분석은 특히 단백질 소단위 또는 도메인 구조 부족 고순도 착체 돌연변이를 생성하는 능력을 요구한다. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 단지의 이전 구조 기능 연구가 널리 (참고 문헌 1-4, 예를 들어, 참조)으로 인해 효모 게놈의 우수한 조작성에 효모 모델 시스템에 초점을 맞추고있다. 보존을 감안할 때orthologous 리모델링 단지 중 서브 유닛의 구성과 기능, 구조와 효모 리모델링 단지의 기능에 대한 연구는 더 높은 진핵 생물에서 그들의 대응에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 상당한 종 특이 리모델링 단지 사이에 차이가 이득이나 보존 서브 유닛의 보존 영역 내에서 종 특이 서브 유닛, 이득 또는 보존 서브 유닛의 종 - 특정 도메인의 손실 및 시퀀스 다양성의 손실 결과로 존재한다. 이러한 차이는 원칙적으로 높은 진핵 세포가 새로운 분자 세포 환경에 적응하기위한 필요에 의해 구동 될 수있다. 이뿐만 아니라 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 또한 ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 과정의 기본 메커니즘을 조명하고 있지만, 때문에 따라서, 높은 진핵 리모델링 단지의 서브 유닛은 뉴 클레오 리모델링 과정에 기여하는 방법을 이해하는 것은 가치가있는 크로 마틴 구조에 의해 HIG의 유전자 발현그녀의 진핵 세포가 조절된다. 지금까지 단 생화학 적 정의 염색질 리모델링 건물 및 서브 콤플렉스를 얻기에 어려움으로 인해 일부 멀티 서브 유닛 포유 동물의 크로 마틴 리모델링 복합체의 구조 및 기능 연구를,이 제한되고있다. 우리는 부분적으로 면역 정제 안정적으로 N-말단에 FLAG 에피토프가 야생형 또는 Ino80 5-7의 돌연변이 버전 태그 발현 인간 세포에서 손상 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스를 제조하는데 사용되는 후술하는 절차에 이러한 어려움을 회피했다 (도 1) . 인간 세포에서 그대로 INO80 착물을 얻기 위해 중재하는 FLP 재조합 안정적 INO80 착체 8-10의 서브 유닛을 코딩 FLAG 에피토프 태그 된 cDNA를 발현하는 형질 전환 된 HEK293 세포주를 생성하는 데 사용된다. INO80 소단위의 과발현 다소 독성이있을 수 있기 때문에 분리 및 선택적 CO하에 클론 세포주를 유지하는 데 필요nditions 대규모 세포 배양의 확장에 필요한 많은 통로 중에 안정한 유전자의 발현을 확인한다. 서브 유닛의 서브 세트 만 포함 작은 INO80의 서브 콤플렉스를 얻으려면, 우리는 성공적으로이 방법을 사용했다 (그림 2A, B). 첫째, 우리는 안정적으로 특정 서브 유닛 (5)의 상호 작용에 필요한 도메인이 결여 Ino80 버전의 돌연변이를 발현하는 HEK293 FLP 인 세포주를 생성. 또한, siRNA를 매개 최저는 적절한 FLAG-태그 INO80 서브 유닛 (게시되지 않은 데이터)를 발현하는 세포에서 원하는 서브 유닛을 소모하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 인간 INO80 착체를 정화, FLAG 아가 로스 기반 크로마토 11함으로써 효과적으로 정제 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스를 함유하는 최종 분획에 세포질 단백질 오염의 존재를 감소시키는, 핵 추출물에서 INO80 - 함유 분획을 풍부하게하기 위해 사용된다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (stablized glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td>에서 멸균</tr><tr><td>pcDNA5/FRT 벡터</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 세포</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>calf serum</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA 풀</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA 재현탁 완충액</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (트립신)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG 펩타이드</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바이오 스핀 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터 장치(50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba 탈염 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 항체, 마우스</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 항체, 토끼</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">J6</td></tr><tr><td>원심분리기의 JS-4.2 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10ml 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70ml 폴리카보네이트 병</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Type 70.1 Ti 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>BD Diagnostics</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col 튜브/바이알 회전기</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR 열 순환기 PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>롤러 병 인큐베이터</td><td>Bellco 생명공학</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>윤활 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>코스타</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

세대와 인간의 ino80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 크로 마틴 리모델링 복합체가 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링을 촉매에 의해 뉴 클레오 역학과 DNA의 접근성을 조절한다. 인간의 INO80 단지는 Ino80, 촉매 서브 유닛과 단지의 조립을위한 발판으로 두 역할을하는 SNF2 같은 ATPase를 포함하여 14 단백질 서브 유닛으로 구성되어 있습니다. 다른 서브 유닛의 기능과 그들이 INO80 단지의 크로 마틴 리모델링 활동에 기여하는 메커니즘은 가난으로 인해 인간의 세포 또는 이종 발현 시스템에 INO80 서브 어셈블리를 생성하는 도전에 부분적으로 이해 상태로 유지됩니다. 이 조브 프로토콜은 서브 유닛 또는 서브 유닛의 일부를 부족한 사람 INO80 염색질 리모델링 서브 콤플렉스의 정화를 할 수있는 절차를 설명합니다. N-말단에 FLAG 에피토프는 Ino80 cDNA를 안정적으로 인간 배아 신장 (HEK) FLP - 중재 재조합을 사용하여 293 세포주에 도입 태그. INO80 단지의 서브 유닛의 일부는 b에있는 경우에즉 하나는 해당 서브 유닛의 조립에 필요한 플랫폼이없는 대신 Ino80 돌연변이 단백질을 발현, 삭제. 경우 개별 서브 유닛이 고갈 될 안정적 FLAG을 표현 HEK 293 세포주에이 서브 유닛을 대상으로 한 transfects s​​iRNA를가 Ino80 ATPase의 태그가. 핵 추출물을 준비하고, FLAG의 면역은 Ino80 유도체를 포함하는 단백질 분획을 풍부하게하기 위해 수행된다. 정제 INO80의 서브 콤플렉스의 조성물은 이러한 면역 블로, 실버 염색 및 질량 분석 등의 방법을 사용하여 분석 할 수있다. 이 프로토콜에 따라 생성 및 INO80 INO80 서브 콤플렉스 더욱 정돈 첨부 된 프로토콜에서 설명되는 다양한 생화학 적 분석을 이용하여 분석 될 수있다. 여기에 설명 된 방법은 모든 포유 동물의 멀티 서브 유닛 염색질 리모델링의 구조 및 기능적 특성에 대한 연구 및 수정 단지에 적용 할 수 있습니다.

그림 1은 인간 INO80 ATP 의존성 염색질 리모델링 복합체를 생성, 정제 및 특성화하는 데 사용된 절차를 요약한 흐름도입니다.
그림 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 이러한 절차를 통해 야생형 INO80과 다양한 서브유닛이 결여된 INO80 서브컴플렉스를 모두 생성할 수 있으며, 이를 통해 결손된 서브유닛들이 INO80의 효소 활성에 기여하는 바를 후속 생화학적으로 분석할 수 있습니다. 그림 2는 INO80 컴플렉스의 구조를 정의하고 INO80 서브컴플렉스를 생성하기 위해 사용한 두 가지 전략을 설명합니다. 그림 2A에 표시된 첫 번째 전략에서는 야생형 서브유닛(Ies2 또는 INO80E)의 FLAG 태그 버전을 통해 온전한 INO80 컴플렉스를 정제합니다. 서브컴플렉스는 서로 다른 서브유닛 세트가 조립되는 개별 도메인이 결여...

이 프로토콜은 human INO80 염색질 리모델링 복합체의 야생형 및 돌연변이 버전을 생성하고 정제하는 절차를 설명합니다. INO80 subunit의 에피토프 태그 버전은 HEK293 세포에서 안정적으로 발현되며, 특정 subunit 세트가 없는 완전 복합체 및 복합체는 면역친화성 크로마토그래피로 정제됩니다.

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

본 절차의 목적은 NO80 염색질 리모델링 복합체의 다중 서브유닛의 야생형 및 돌연변이 버전을 생성하고 정제하는 것입니다. 이는 먼저 Flag 에피토프 태그가 부착된 NO80 단백질을 발현하는 세포에서 핵을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 핵 추출물을 준비한 후, Anti-Flag 친화성 크로마토그래피를 통해 야생형 또는 돌연변이 인간 NO80 염색질 리모델링 복합체를 정제합니다. 최종적으로, 정제된 NO80 복합체의 서브유닛 구성은 웨스턴 블롯 또는 실버 염색으로 분석할 수 있습니다.이 방법은 MultiPro 염색질 리모델링 복합체의 하위 단위들이 전체 활성에 어떻게 기여하는지에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 특히 NO 80 염색질 리모델링 복합체의 야생형 및 돌연변이 버전을 연구하기 위해 설계되었지만, mediator와 같은 다른 다중 하위 단위 핵 복합체를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.본 절차에서 가장 중요한 단계는 핵 추출 단계입니다. 일반적으로 염 추출 단계에서 염을 너무 빠르게 또는 너무 격렬하게 첨가하여 문제가 발생하는 경우가 많습니다. 롤러 병에서 배양한 후, HEC 2 9 3 세포를 적절한 크기의 눈금付き 원추형 튜브로 옮기고 1000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 팩킹된 세포 펠렛의 부피를 측정하고, 완만한 피펫팅을 통해 펠렛을 세포 부피의 5배에 해당하는 버퍼 A에 재현탁시킨 뒤 정확히 10분 동안 얼음 위에서 배양합니다.세포를 다시 원심 분리한 후, 세포 펠릿의 크기를 두 번째로 측정합니다. 크기가 최대 2배까지 증가했을 것입니다. 이번에는 세포를 버퍼 A의 2배 세포 부피로 재현탁한 다음, 적절한 크기의 조직 균질기로 세포 현탁액을 옮기고 유리 페스틀을 이용해 세포의 90%가 트라이판 블루(trypan blue)로 양성 염색될 때까지 세포 현탁액을 균질화합니다. 균질화된 세포를 45 mL 고속 원심 분리 튜브에 넣고 고정각 로터를 사용하여 4°C에서 25,000 ×g로 20분간 원심 분리합니다. 그 후, 핵 펠릿에서 세포질 단백질을 포함하는 상층액을 제거하여 염으로 핵을 추출합니다.이제 시작 시의 세포 팩 볼륨 3 milliliters당 2.5 milliliters의 buffer C를 펠렛에 추가합니다. 그다음 세롤로지컬 피펫을 사용하여 튜브 벽에서 펠렛을 떼어내고, 전체 혼합물을 적절한 크기의 다운 균질기로 옮깁니다. 느슨한 페스틀로 두 번 스트로크하여 혼합물을 균질화함으로써 핵을 재부유시킨 후, 재부유된 핵 분획을 현탁액이 최소 0.5 centimeters 깊이로 채워질 수 있는 크기의 냉각된 비커로 옮깁니다.다음으로, 아래의 공식에 따라 용액의 최종 농도를 0.42 M sodium chloride로 만들기 위해 필요한 5 M sodium chloride의 부피를 계산합니다. 이제 계산된 부피의 염 용액을 한 방울씩 천천히 첨가하면서, 유리 막대로 현탁액을 부드럽게 저어 얼음 위에서 염 농도를 높입니다. 모든 sodium chloride가 첨가되어 용액이 매우 끈적해질 때까지 이 과정을 반복합니다. 그 다음, 끈적해진 현탁액을 캡 어셈블리가 장착된 Type 45 TI 로터의 70 mL 폴리카보네이트 튜브에 조심스럽게 옮기고, 뮤테이터(mutator)를 사용하여 4 °C에서 밀봉된 튜브를 천천히 흔들어 줍니다. 30분 후, TI 45 로터에서 40,000 ×g, 4 °C 조건으로 30분 동안 초원심분리하고, 상층액이 포함된 핵 추출물을 하나의 플라스틱 용기에 모읍니다.그 후 핵 추출액 용액을 적당한 크기로 소분하여 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤 -80 °C에서 보관하십시오. 면역 정제를 위한 Anti-Flag aros를 준비하려면, 팁 끝을 자른 200 µL 피펫을 사용하여 50% Anti-Flag aros 비드 슬러리 200 µL를 1.5 mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세척된 비드를 갓 해동한 핵 추출액 10 mL가 들어 있는 원추형 튜브로 옮긴 후, 실험실 로테이터(rotator)를 이용하여 4 °C에서 저속 회전시키며 4시간 동안 반응시키고, 이어서 4 °C에서 1000 ×g로 5분간 원심분리하여 flag aros를 수집합니다.다음으로, 비드 추출물 P를 10 mL의 lysis 450 buffer로 4 °C에서 5분 동안 mutator로 부드럽게 흔들어 세척합니다. 그 후 비드 추출물 혼합물을 원심 분리하여 가라앉힌 다음, 상층액을 제거합니다. 펠렛을 100~150 µL의 신선한 lysis 450 buffer에 현탁하고, 비드를 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.모든 비드가 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨질 때까지 15 mL 원추형 튜브를 100~150 µL의 Lysol 50으로 계속 헹굽니다. 마이크로 원심분리기로 비드를 가라앉힌 후, 1 mL의 Lysol 50으로 3회, 1 mL의 EB 100 Buffer로 1회 세척합니다. 그런 다음 결합된 단백질을 용출하기 위해 flag peptide가 포함된 200 µL의 EB 100 buffer를 첨가하고, 샘플을 4 °C의 너트에 보관하며 배양합니다.30분 후, 마이크로 원심분리기를 사용하여 비드를 펠렛화하고, 용출된 OAC C complex가 포함된 상층액을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 용출 과정을 4회 더 반복한 후, 수집된 용출액을 빈 스핀 컬럼에 통과시켜 단백질 분획에서 남아 있는 flag aero beads를 제거합니다. 마지막으로, 50,000 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)의 원심분리 초여과 장치를 사용하여 용출된 단백질 분획을 약 10배 농축합니다.이 그림에서 보여주는 바와 같이, 앞서 입증한 대로 표시된 flag tag 서브유닛을 사용하여 준비한 NO 80 복합체의 순도는 은 염색 SDS poly acrylamide 젤을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 대조군 레인에 나타나는 모든 단백질은 flag aeros에 비특이적으로 결합하는 오염 물질입니다. 이 표식들은 테스트된 NO 80 서브유닛에 해당하는 밴드를 나타내며, 이는 분자량 마커의 이동도를 나타냅니다.야생형 NO 80의 위치는 검은색 사각형으로 표시되었으며, NO 80 돌연변이체의 위치는 빈 원으로 표시되었습니다. 검은색 선으로 구분된 레인들은 서로 다른 젤에서 얻은 결과입니다. 복합체의 조성은 다양한 NO 80 서브유닛에 대한 항체를 이용한 Western blot을 통해 평가할 수 있습니다.예를 들어, 말단 도메인 모듈, 헬리카제 중심 관련 모듈 및 SNF2 모듈의 서브유닛을 평가하였습니다. 이 기술을 숙달하면 세포 수확부터 복합체 정제까지 하루 안에 완료할 수 있습니다.이 기술을 통해 연구자들은 포유류 세포의 다중 서브유닛 복합체 및 서브 복합체를 정제하여 그 기능을 연구할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 인간 세포 또는 다른 포유류 세포주로부터 염색질 리모델링 및 기타 다중 서브유닛 단백질 복합체를 정제하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

배우세요 HEK293 세포에서 INO80 염색질 리모델링 복합체를 정화하는 방법을. 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 야생형 및 돌연변이 복합체를 분석하고 서브유닛 구성을 연구할 수 있습니다.

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

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