ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

다음 절차의 목적은 TP 의존성 염색질 리모델링 복합체의 다양한 생화학적 활성을 측정하는 것입니다. 이는 전기영동 이동성 이동 분석 또는 emsa를 사용하여 DNA 분자의 한쪽 끝에서 DNA의 더 중앙 위치까지 위치 뉴클레오솜의 TP 의존적 슬라이딩을 측정함으로써 달성됩니다. 유사한 EMSA 기반 방법을 사용하여 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 평가하기 위해 리모델링 복합 결합 단핵 영역의 형성을 모니터링할 수 있습니다.

또한 박층 크로마토그래피를 사용하여 TP 의존성 염색질 리모델링 복합체의 APA 활성을 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 방법은 O 80 복합체에서 인간의 TP 의존성 염색질 리모델링을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는 NO 80 염색질 리모델링 복합체를 연구하는 생화학 분석을 시연합니다.

TP 의존성 뉴클레오솜 리모델링 분석을 수행하기 위해 다른 염색질 리모델링 복합체를 연구하기 위해서도 유사한 방법을 적용할 수 있습니다. 먼저 표에 설명된 대로 100마이크로리터 PCR 반응을 설정한 후 뉴클레오솜 기질을 준비합니다. thermal cycler에서 PCR 반응을 수행한 다음 반응 생성물을 nuclease free spin column에 두 번 통과시켜 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거합니다.

다음으로, 50 마이크로리터의 완충액에 6 마이크로그램의 hilar 뉴클레오솜과 P32 표지된 2개의 올레 DNA 단편을 혼합하고, 혼합물을 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 0.8 몰, 0.6 몰 및 0.4 몰 염화나트륨으로 순차적으로 희석하여 12.5 마이크로 리터, 20.8 마이크로 리터 및 41.6 마이크로 리터의 트리스 HCL 완충 용액을 각각 첨가 후 섭씨 30 도에서 30 분 동안 배양하고, 125에서 마지막 배양 후 250 마이크로 리터의 트리스 하이드로 클로라이드 완충액을 첨가한다. 또한 비 부채 P 40 글리세롤 및 PSA를 2 회, 30 분, 섭씨 30도 희석하여 각각 0.2 몰 및 0.1 몰 염화나트륨

그런 다음 단일 뉴클레오솜 기질을 섭씨 4도에서 최대 3개월 동안 보관한 후 분석을 설정하기 전에 천연 폴리아크릴아미드 겔을 캐스팅합니다. 그런 다음 수행 할 각 반응에 대해 사전 냉각 된 실리콘화에서 4.75 마이크로 리터의 부피를 제공하기에 충분한 적절한 양의 EB 100 버퍼와 oh 80에서 약 20 나노 몰을 결합하십시오. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브는 즉시 남아있는 NO 80 함유 분획, imp 분말 드라이 아이스를 다시 동결합니다.

다음으로, 5.25마이크로리터의 갓 준비한 마스터 칵테일을 각 반응 튜브에 분배하고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 30도의 열 블록에서 반응을 배양합니다. 배양이 끝나면 1.5 마이크로 리터의 새로 준비된 제거 혼합물을 각 튜브에 추가하여 반응을 종료 한 다음 각 반응 튜브를 혼합합니다.

글쎄, 그것들을 스핀다운하고 섭씨 30도에서 30분 더 배양하십시오. 한편, 섭씨 4도에서 30분 동안 100볼트의 수직 전기영동 장치에서 천연 폴리 아크릴아미드 겔을 사전 실행하고, 0.5 XTBE를 하부 챔버 내부에 자기 교반 막대가 있는 실행 버퍼로 사용하여 혼합물을 제거하여 배양 종료 시 일정한 완충기 순환을 유지하고 각 반응과 함께 2.5마이크로리터의 로딩 다이를 혼합합니다. 그리고 잠시 회전한 후 로딩 팁을 사용하여 샘플을 젤에 로드합니다.

버퍼 순환과 함께 섭씨 4도에서 4.5시간 동안 200볼트에서 젤을 실행합니다. 그런 다음 젤을 두 장의 여과지 스택으로 옮기고 투명한 플라스틱 랩을 사용하여 젤이 위에 있는 종이 필터를 떨어뜨려 신호를 감지합니다. 원하는 시간 동안 겔을 섭씨 4도의 보관 포스포 스크린에 노출시킨 다음 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 스크린을 스캔하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 DNA 및 뉴클레오솜 의존성 APA 분석을 수행합니다.

먼저 면역 정제 된 서브 복합체의 10-50 나노 몰을 각 반응에 대해 하나의 사전 냉각 윤활 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 2.2 마이크로 리터의 부피를 제공하기에 충분한 양의 eeb 100 버퍼와 결합한 다음 분말 드라이 아이스에서 NO 80 함유 분획을 즉시 다시 동결합니다. 그런 다음 DNA 뉴클레오솜을 함유하거나 전혀 포함하지 않는 갓 준비한 서브 칵테일 2.8마이크로리터를 상하 피펫팅으로 반응 튜브가 포함된 효소에 부드럽게 혼합하고 튜브를 섭씨 30도의 열 블록으로 옮깁니다. 다음으로, 연필을 사용하여 20 x 10 폴리에틸렌의 하단 가장자리에서 최소 1.5cm 떨어진 곳에 매우 밝은 선을 그립니다.

박층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트를 의미합니다. 그런 다음 배양 후 5분, 15분, 30분 및 60분에 각 반응 혼합물 0.5마이크로리터를 라인에 배치하고 즉시 각 샘플을 열 블록으로 되돌려 보내 단일 튜브에서 여러 시점을 가져올 수 있습니다. 마지막 샘플을 도포한 후 헤어 드라이어를 사용하여 플레이트를 건조시킨 다음 플레이트를 충분히 함유된 유리 챔버로 옮깁니다.

0.375 몰 인산칼륨으로 TLC 플레이트의 바닥 0.5cm가 용액에 잠길 수 있습니다. 챔버를 덮고 액상의 전면이 TLC 플레이트의 상단에 도달할 때까지 반응을 개발하며, 이 시점에서 플레이트는 즉시 블로우 건조되어 실온에서 저장 포스포 스크린에 노출되어야 합니다. 마지막으로, 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 화면을 스캔하여 TP 기판과 DP 생성물의 방사성 양을 확인합니다.

이 첫 번째 실험은 복합체가 flag IES를 통해 정제됨을 보여주고, 두 개의 flag, N-O-A-T-E 및 flag NO 80 delta N은 NO 80 N 말단 및/또는 관련 소단위체가 NO 80 복합체에 의한 뉴클레오솜 리모델링에 필수적임을 나타내는 유사한 뉴클레오솜 슬라이딩 활성을 갖는다. 대조적으로, 복합체는 이 분석에서 비활성 상태인 플래그 NO 80 delta n delta HSA를 통해 정제되며, 이는 리모델링 활성이 NO 80 APA 및/또는 관련 소단위의 HSA 영역에 의존함을 나타냅니다. NUCLEOSOME sliding assay 절차의 변형을 사용하여 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 측정할 수 있습니다.

이 실험에서, NO 80 E 소단위체를 통해 정제된 온전한 NO 80 복합체의 양이 증가한 뉴클레오솜의 배양은 자유 단핵구 영역에 해당하는 밴드의 용량 의존적 소멸과 겔의 상단 부근으로 이동하는 새로운 이동된 종의 출현으로 이어졌습니다. 대조적으로, 뉴클레오솜은 NO 80 델타 N을 통해 정제되고 NO 80 subunit의 하위 집합이 없는 더 작은 복합체와 함께 배양된 반면, 이동된 종은 더 빠르게 이동했으며, 이는 슈퍼 이동 밴드의 상대적 이동성이 복합체 분석의 크기에 의해 결정됨을 시사합니다. 이 최종 실험에서는 두 개의 서로 다른 NO 80 하위 복합체의 DNA와 NUCLEOSOME 활성화 APA 활성을 비교하는 분석 결과를 보여줍니다.

더 느리게 이동하는 반점은 TP로 표시된 시작 알파 32 P에 해당하고, 더 빠르게 이동하는 종은 용매 이동 방향을 나타내는 영역을 가진 A DP 반응 산물입니다. 이러한 절차를 사용하는 동안 시간이 다양하고 다양한 농도의 효소를 포함하는 분석을 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 제품 시간과 선량 반응 곡선이 선형일 때 측정이 수행되고 있는지 확인할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 정제된 염색질 리모델링 복합체의 TPA에서 뉴클레오솜 결합 및 뉴클레오솜 슬라이딩 활성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사성 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 실험복을 입고 보안경을 착용하고, 방사능 오염을 모니터링하고, 방사성 폐기물을 적절하게 처리하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.