ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

다음 절차의 목적은 TP 의존성 염색질 리모델링 복합체의 다양한 생화학적 활성을 측정하는 것입니다. 이는 전기영동 이동도 변화 분석법(electrophoretic mobility shift assay 또는 emsa)을 사용하여, DNA 분자의 한쪽 끝에 위치한 뉴클레오솜이 DNA의 더 중앙 부분으로 TP 의존적으로 슬라이딩하는 것을 측정함으로써 달성됩니다. 유사한 EMSA 기반 방법을 사용하여 리모델링 복합체가 결합된 단일 뉴클레오솜 존의 형성을 모니터링함으로써 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 평가할 수 있습니다.

또한, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 사용하여 TP 의존적 염색질 리모델링 복합체의 APA 활성을 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 방법들은 인간의 O 80 복합체 내 TP 의존적 염색질 리모델링을 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 본 영상에서는 NO 80 염색질 리모델링 복합체를 연구하는 생화학적 분석법을 시연하겠습니다.

유사한 방법을 다른 염색질 리모델링 복합체를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. TP 의존적 뉴클레오솜 리모델링 분석을 수행하려면, 먼저 표에 설명된 대로 100 µL PCR 반응을 설정하여 뉴클레오솜 기질을 준비하십시오. 써멀 사이클러에서 PCR 반응을 수행한 후, 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 반응 생성물을 뉴클레아제 프리 스핀 컬럼에 두 번 통과시키십시오.

다음으로, 50 µL의 완충액에 P 32로 표지된 6 0 1 DNA 단편 2 nmol과 6 µg의 hilar 뉴클레오솜을 섞고, 혼합물을 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, EDTA, PMSF 및 DTT가 첨가된 tris HCl 완충액을 각각 12.5 µL, 20.8 µL, 41.6 µL씩 순차적으로 첨가하여 혼합물을 0.8 M, 0.6 M, 0.4 M NaCl 농도로 희석하며, 매 첨가 후 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 마지막 배양 후, non indebt P 40 글리세롤과 PSA가 추가로 첨가된 tris hydrochloride 완충액 125 µL와 250 µL를 넣어 0.2 M 및 0.1 M NaCl 농도로 각각 두 번 더 희석하며, 매 단계마다 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.

그 후, 네이티브 폴리아크릴아마이드 겔을 제작하여 분석을 준비하기 전까지 모노 뉴클레오솜 기질을 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오. 다음으로, 수행할 각 반응에 대해, 사전 냉각된 실리콘 처리된 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 20 nM의 NO 80과 4.75 µL의 부피가 되기에 충분한 양의 EB 100 버퍼를 혼합하십시오. 남은 NO 80 함유 분획은 분쇄된 드라이아이스를 사용하여 즉시 다시 냉동 보관하십시오.

다음으로, 갓 준비한 마스터 칵테일 5.25 µL를 각 반응 튜브에 분주하고, 피펫팅을 통해 충분히 혼합합니다. 그런 다음 30 °C 가열 블록에서 반응물을 배양합니다. 배양이 끝나면 각 튜브에 갓 준비한 제거 믹스(removing mix) 1.5 µL를 첨가하여 반응을 중단시킨 후, 각 반응 튜브를 혼합합니다.

원심분리한 후 30 °C에서 30분 동안 추가로 배양합니다. 그동안 수직 전기영동 장치에서 0.5 X TBE를 전기영동 완충액으로 사용하고, 하단 챔버 내에 마그네틱 바를 넣어 완충액이 지속적으로 순환되도록 하여 4 °C에서 100 V로 30분 동안 native polyacrylamide 겔을 사전 작동시킵니다. 배양이 끝나면 혼합물을 꺼내어 각 반응액에 2.5 µL의 로딩 다이(loading dye)를 넣고 섞습니다. 짧게 원심분리한 후, 로딩 팁을 사용하여 샘플을 겔에 로딩합니다.

완충액을 순환시키며 4 °C에서 200 V로 4.5시간 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 그 후 겔을 두 장의 필터 페이퍼 위에 옮기고, 신호를 검출하기 위해 투명 플라스틱 랩을 사용하여 겔이 놓인 필터 페이퍼를 떨어뜨립니다. 겔을 4 °C에서 원하는 시간 동안 보관용 인광 스크린에 노출시킨 다음, 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 스크린을 스캔하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석함으로써 DNA 및 뉴클레오솜 의존적 APA 분석을 수행합니다.

먼저, 각 반응당 미리 냉각된 윤활 처리된 1.5 milliliter 미세 원심분리 튜브에 10 ~ 50 nanomolar의 면역 정제된 하위 복합체와 총 부피가 2.2 microliters가 되기에 충분한 양의 eeb 100 버퍼를 혼합하고, NO 80을 포함하는 분획은 즉시 가루 형태의 드라이아이스로 다시 냉동하십시오. 그런 다음, DNA 뉴클레오솜을 포함하거나 포함하지 않는 갓 준비한 sub 칵테일 2.8 microliters를 효소가 포함된 반응 튜브에 넣고 피펫팅을 통해 위아래로 부드럽게 섞은 후, 튜브를 30 degrees Celsius 히팅 블록으로 옮기십시오. 다음으로, 연필을 사용하여 20 by 10 폴리에틸렌의 바닥 가장자리에서 최소 1.5 centimeters 떨어진 곳에 아주 연하게 선을 그으십시오.

얇은 층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트를 의미합니다. 그런 다음 배양 후 5, 15, 30, 60분 시점에 각 반응 혼합물 0.5 µL를 라인 위에 점적하고, 각 샘플을 즉시 히팅 블록으로 되돌려 보내어 단일 튜브에서 여러 시점의 샘플을 채취할 수 있도록 합니다. 마지막 샘플을 도포한 후, 헤어드라이어를 사용하여 플레이트를 건조시킨 다음 충분한 양이 들어 있는 유리 챔버로 플레이트를 옮깁니다.

TLC 플레이트의 하단 0.5 centimeters가 용액에 잠기도록 0.375 molar 인산칼륨을 넣습니다. 챔버의 덮개를 닫고 액상 전선이 TLC 플레이트 상단에 도달할 때까지 전개한 후, 즉시 플레이트를 송풍 건조하고 실온에서 보관용 포스포 스크린에 노출시킵니다. 마지막으로, 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 스크린을 스캔하여 방사성 TP 기질과 DP 생성물의 양을 측정합니다.

이 첫 번째 실험은 flag IES two flag, N-O-A-T-E 및 flag NO 80 delta N을 통해 정제된 복합체가 유사한 뉴클레오솜 슬라이딩 활성을 가지고 있음을 보여주며, 이는 NO 80 N 말단 및/또는 그 관련 하위 단위가 NO 80 복합체에 의한 뉴클레오솜 리모델링에 필수적이지 않음을 나타냅니다. 반면에, flag NO 80 delta n delta HSA를 통해 정제된 복합체는 이 분석에서 비활성 상태이며, 이는 리모델링 활성이 NO 80 APAs의 HSA 도메인 및/또는 그 관련 하위 단위에 의존함을 나타냅니다. 뉴클레오솜 슬라이딩 분석 절차를 수정하여 사용하면 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 측정할 수 있습니다.

본 실험에서, NO 80 E 서브유닛을 통해 정제된 온전한 NO 80 복합체의 양을 증가시키며 뉴클레오솜과 함께 배양한 결과, 유리 모노뉴클레오솜(free mononucleo zones)에 해당하는 밴드가 농도 의존적으로 사라지고 젤 상단 근처에서 이동하는 새로운 이동 변이종(shifted species)이 나타났습니다. 이와 대조적으로, NO 80 delta N을 통해 정제되어 NO 80 서브유닛의 일부가 결여된 더 작은 복합체와 뉴클레오솜을 배양했을 때는 이동 변이종이 더 빠르게 이동하였으며, 이는 슈퍼 시프트 밴드(super shifted band)의 상대적 이동도가 분석에 사용된 복합체의 크기에 의해 결정됨을 시사합니다. 마지막 실험에서는 두 가지 서로 다른 NO 80 서브복합체의 DNA 및 뉴클레오솜 활성화 APA 활성을 비교 분석한 결과가 제시됩니다.

더 느리게 이동하는 반점은 시작 물질인 alpha 32 P 표지 a TP에 해당하며, 더 빠르게 이동하는 종은 A DP 반응 생성물이며, 화살표는 용매가 이동한 방향을 나타냅니다. 이러한 절차를 사용할 때는 시간 길이를 달리하고 효소 농도를 다르게 하여 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 이를 통해 생성물 시간 및 용량 반응 곡선이 선형일 때 측정이 이루어지도록 보장할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 정제된 염색질 리모델링 복합체의 nucleosome 결합 및 Nucleosome sliding 활성을 분석하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 실험복과 보안경을 착용하고, 방사성 오염 여부를 모니터링하며, 방사성 폐기물을 적절하게 처리하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.