Name: ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 ATP 의존 염색질 리모델링 효소의 생화학적 활성을 EMSA와 TLC 기법으로 분석하는 방법을. 뉴클레오솜 슬라이딩, 결합 활성 및 ATP 가수분해를 정량화하여 유전자 조절 메커니즘을 연구합니다.

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저자 연구실에서의 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, GM41628)의 지원과 그레이터 캔자스시티 커뮤니티 재단(Greater Kansas City Community Foundation)의 헬렌 넬슨 의학 연구 기금(Helen Nelson Medical Research Fund)의 스타워스 의학 연구소(Stowers Institute for Medical Research)의 지원으로 이루어집니다.

1 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석 실험 뉴 클레오 리모델링 활동 ATP-의존성을 측정하기 위해, INO80를 immunopurified 또는 INO80의 서브 콤플렉스는 ATP와 216 bp의, 32 P-표지 된 DNA 단편의 일 단부에 위치하는 단일 뉴 클레오를 포함 mononucleosomal 기판과 함께 배양된다. 반응 생성물은 다음 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 전기 영동한다. <ol><li> 32 P-표지 된 &#39;, 601&#39;DNA 단편을 생성하기에서 증폭을 pGEM-3Z-601 4 올리고 뉴클레오티드로서 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG 및 5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG을 사용하여 최종 위치 (601) 뉴 클레오 솜 위치 서열을 포함하는 216 염기쌍의 DNA 단편, 순방향 및 역방향 프라이머. <ol><li> 표 1에 기재된 바와 같이 100 ㎕의 PCR 반응을 설정한다. </li><li> 다음 프로그램을 사용하여 서열 증폭기에서 PCR 반응을 수행하여 1 분을 96 ° C, followe에서94 ° C, 57 ° C, 30주기 동안 72 ° C에서 60 초에서 30 초에서 45 초만큼 D; 72 ° C에서 7 분으로 끝나는. </li><li> PCR 반응이 완료되면, 클레아없는 스핀 컬럼을 통해 회 반응 생성물을 통과하여 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거한다. </li><li> PCR 반응은 원하는 ~ 216 염기쌍의 DNA 단편을 생성 된 것을 확인하는 1.2 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 PCR 산물의 5 μL를 실행. </li><li> 정제 된 PCR 생성물 20 배량의 5 μL 희석하고 UV 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 평균 수율은 ~ 40 NG / μL이다. </li><li> 섬광 계수기에서 정제 된 PCR 생성물의 1 μL의 방사능을 측정한다. 노출 당 비용 (CPM) / NG를 계산하여 라벨 효율을 추정한다. 성공적인 라벨링 반응물을 601 DNA 단편 ~ 15,000 CPM / NG을 수득 할 것으로 예상된다. </li></ol></li><li> 용액을 희석 방법 5를 사용하여 표시 601 DNA에 헬라 세포 뉴 클레오을 전송합니다. <ol><li> 2 pmol의 혼합32 P-표지 된 601 DNA 단편 헬라 뉴 클레오 6 μg 1.0 M의 NaCl, 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF 및 1 ㎜를 포함하는 완충액 50 μL에 (같이 제조 5 참조) DTT와 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 순차적 0.8 M, 0.6 M로 혼합물을 희석하고, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)을, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF의 각각 12.5 μL, 20.8 μL, 41.6 μL, 희석 0.4 M의 NaCl, 및 1 mM의 DTT, 각 희석 한 후 30 ° C에서 30 분 배양과 함께. </li><li> 또한 30 분 동안 배양하여 다음 0.1 % Nonidet P-40, 20 % 글리세롤, 및 200 μg / ㎖ BSA를 함유하는 동일한 완충액 250 μL을 125 μL 첨가함으로써, 0.1 M의 NaCl로 한 다음 0.2 M 및로 혼합물을 희석 마지막이 희석 사이에 30 ° C에서. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 mononucleosome 기판을 저장합니다. </li></ol></li><li> 10 μL의 총 부피에 ATP에 의존하는 뉴 클레오 슬라이딩 반응을 수행합니다. 정말이에요INO80 뉴 클레오 리모델링 활성을위한 최적의 NaCl 농도이기 때문에 ction의 구성 요소. 표 2에 나와있는 것은 ~ 50 mM의 염화나트륨 (미발표 결과), 고려에 함유 된 염화나트륨의 양을 가지고, 50 mm의 각 반응에서의 NaCl의 총 농도를 조정 뉴 클레오 효소의 준비. <ol><li> 분석을 설정하기 시작하기 전에 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤 (18 X 16cm)를 캐스팅. 5 %의 아크릴 아미드를 함유 한 겔을 제조 (아크릴 아미드 : 37.5 비스 아크릴 아미드 : 1), 0.5의 TBE (45 mM 트리스 보레이트, 1 mM의 EDTA), 0.01 %과 황산 암모늄 (APS), 및 0.001 % N, N, N&#39;, N&#39;의 -tetramethylethylenediamine (TEMED는). 표 3에 나와있는 재료를 혼합 겔을 실온에서 적어도 2 시간 동안 중합하도록 허용합니다. </li><li> 각각의 반응을 수행하는 한편, 프리 실리콘이 냉장 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 ~ 20 nM의 INO80 또는 INO80의 subcomplex에 결합 (EB100 버퍼의 양 (같이 제조 3 참조) <str옹&gt; 충분한 표 4) 4.75 μL의 부피를 수득 하였다. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에 남아 INO80 - 함유 분획을 다시 동결. </li><li> &#39;X&#39;의 요소에 의해 확장, 나머지 재료와 함께 마스터 칵테일을 설정합니다 (여기서 반응의 X = 총 세). 단일 10 μL 반응에 필요한 각 성분의 양은 표 5에 열거한다; 레시피가 수행되는 반응의 수에 따라 확장 할 것이다. Pipetman와 튜브를 눌러 또는 피펫 팅 의해 아래로 잘 섞어 벤치 탑의 microcentrifuge에 몇 초 동안 튜브를 회전. </li><li> 단계 1.3.2에서 설정 반응 관 각각에 마스터 칵테일 5.25 μl를 분배. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 30 ° C 열 블록 또는 물을 욕조에 반응 튜브를 전송하여 반응을 시작하고 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 한편, 경쟁 DNA를 포함하는 칵테일 &#39;믹스를 제거하는&#39;준비와 뉴 클레오는 X (반응 + 4 X = 총)의 요인에 의해 확장. 단일 반응 혼합물을 1.5 ㎕의 제거를 준비하기 위해 필요한 각 성분의 양을 표 6에 열거한다; 레시피가 수행되는 분석의 수에 따라 확장 할 것이다. </li><li> 제거 믹스의 1.5 μl를 첨가하여 반응을 종료합니다. 잘 믹스 스핀 다운, 그리고 추가로 30 분 동안 30 ° C에서 배양. </li><li> 한편, 일정한 버퍼 순환을 유지하기 위해 하부 챔버 내부의 자기 교반 막대 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여, 4 ° C에서 30 분 동안 100 V에서 수직 전기 영동 장치의 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔을 미리 실행합니다. </li><li> 샘플을로드 배 TBE, 30 % 글리세롤, 0.25 % 브로 모 페놀 블루, 0.25 % 크실렌 Cyanol FF를 포함 로딩 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 간단히 샘플을 회전, 잘 혼합, 및로드 정보를 사용하여 겔에로드합니다. </li><li> 버퍼 순환 4 ° C에서 4.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행합니다.</li><li> 신호를 검출하기 위해, 여과지의 두 시트의 스택 겔 옮긴다. 투명한 플라스틱 포장을 사용하여 상단에있는 겔 필터 종이 랩, 다음 원하는 시간 동안 4 ° C에서 저장 형광체 화면에 노출. </li><li> 동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 검색하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol></li></ol> 2 Mononucleosome 결합 분석 mononucleosomes위한 소정 INO80 복합체의 결합 친화도 분석법을 위해, 단계 120에서 생성 mononucleosomal 기판을 이용한 전기 영동 이동성 시프트 분석법 (EMSA)을 수행. <ol><li> 반응은 뉴 클레오 리모델링 분석에 대해 설명하지만 반응에서 ATP 및 제거 믹스를 생략으로 분​​석을 바인딩 믹스 설정; 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다. </li><li> 각 반응 혼합물에 로딩 염료의 2.5 μl를 추가하고, 3.5 %의 아크릴 아마이드 (아크릴 아미드가 포함 된 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔에 적용 : 세 비스7.5 : 1), 1 % 글리세롤, 0.5 배의 TBE, 0.01 %의 APS 및 0.001 % TEMED. </li><li> 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여 버퍼 순환 4 ° C에서 2.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행하고 저장 형광체 화면에 노출. </li></ol> 3 DNA- 및 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 실험 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5), 60 mM의 염화나트륨, 6.6 mM의 MgCl2를, 0.8 mM의 EDTA, 0.015 % Nonidet P-40, 2.5 % 글리세롤, 0.1 ㎎ / ㎖ BSA, 1을 포함하는 5 ㎕의 반응 혼합물에 ATPase를 세이를 수행 mM의 DTT, 0.1 mM의 PMSF, 2 mM의 ATP [α- 32 P] ATP의 2 μCi (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. INO80 단지의 각 INO80의 복잡하거나 시간 동안 원형 플라스미드 DNA 측정 (5,000 bp의, ~ 30 nm의) 폐쇄 함유 DNA- 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 하나를 측정하는 세 병렬 반응, 일 포함 EB100 버퍼를 설정 정량 할 DNA- 의존적 ATPase를, 및 뉴 클레오 의존적 ATPase를 측정하는 한 헬러 oligonucleosomes (~ 185 나노 미터)을 포함. 얼음에 모두 반응을 설정합니다. <oL&gt; <li> 각 반응의 경우, 사전 냉장 윤활 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 2.2 μL의 볼륨을 제공하기에 충분 EB100 버퍼의 양 immunopurified INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 10 ~ 50 nm의 결합. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에있는 INO80 - 함유 분획을 다시 동결. </li><li> 마스터 칵테일을 설정합니다. 단일 반응에 필요한 각 성분의 양을 표 7에 표시됩니다. X는 = INO80 준비의 수를 정량 할 3 (X + 2) 하나의 요인에 의해 확장하여 조리법을 확장 할 수 있습니다. </li><li> &#39;서브 칵테일&#39;포함 버퍼를 준비하려면 만, DNA, 또는 뉴 클레오는 3 개의 별도의 튜브에 마스터 칵테일의 2.5 (X + 2) μl를 분배. 0.3 어느 EB100의 (X + 2) μL 폐쇄 원형 플라스미드 DNA (1.5 μg / μL), 또는 헬라 oligonucleosomes (1.5 μg / μL)을 넣고 잘 섞는다. </li><li> 성에서 설정 한 효소 함유 반응 튜브에 적절한 서브 칵테일의 2.8 μl를 분배EP 3.1. 부드럽게 섞어 아래로 피펫; 거품을 도입하지 마십시오. </li><li> , 반응을 시작하는 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 전송합니다. </li><li> 적어도 1.5 cm 떨어진 하단 가장자리로부터 직선 5, 15, 30, 및 인큐베이션 60 분 후, 셀룰로스 폴리에틸렌 박층 크로마토에 각각 반응 혼합물의 0.5 ㎕를 스팟 (TLC) 플레이트 (20 × 10cm) . 바로 그래서 여러 시점이 하나의 튜브에서 취할 수 있습니다 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 반환합니다. 스포팅 후, 타격 건조기를 사용하여 TLC 판을 건조. </li><li> TLC 플레이트의 하단은 0.5 cm 용액에 침지 될 수 있도록 충분히 0.375 M 인산 칼륨 (pH를 3.5)를 함유하는 유리 챔버 TLC 플레이트를 옮긴다. </li><li> 챔버를 포함하고, 액상의 전면 TLC 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 개발한다. 즉시 철저하게 타격 건조기를 사용하여 판을 건조. </li><li> RT에서 저장 형광면에 건조 TLC 판을 노출.동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 스캔 방사성 ATP와 ADP 기판 생성물의 양을 결정한다. </li><li> 가수 분해 ATP의 양을 계산하기 위하여, 다음과 같은 수식을 사용하여 개시, 반응 혼합물 중의 ATP 존재하는 양에 의해 가수 분해 %의 ATP를 곱 pmol의의 ATP 가수 분해 = 10 pmol의의 ATP를 반응 X 개시까지 [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

, 그리고 리모델링 및 / 또는 ATPase의 효소 오염에 우리가 분석에서 관찰하는 뉴 클레오 리모델링 및 ATPase의 활동 INO80 복합체의 촉매 활성에 따라 보장하기 위해, 우리는 정기적으로 분석 뉴 클레오 리모델링 및 INO80 단지의 촉매 비활성 버전의 ATPase의 활동은 정제 야생형 INO80 동일한 절차를 사용하여 평행. INO80 착체 또는 서브 콤플렉스의 다른 제제의 액티비티를 비교하는 실험의 해석을 복잡하게 할 수 ATP 및 / 또는 ATP 독립적 리모델링 활동 오염의 존재를 테스트하는 뉴 클레오 리모델링 활성을 시금 때 ATP 결여 된 음성 대조군 반응물을 또한 수행한다. 촉매 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 비활성 버전은 더 뉴 클레오 리모델링 또는 ATPase의 활동을 전시 없습니다. 또한, 뉴 클레오 DNA- 또는 독립적 ATPase의 활성의 검출에 enzym ATPase를 (들)를 오염의 존재를 표시전자 분율. 활성은 여전히​​ 촉매 비활성 Ino80의 존재하에 검출 된 경우 또는 실질...

SNF2 가족 염색질 리모델링 단지는 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛 1, 2를 포함한다. 단일 서브 유니트 효소와 같은 일부 SNF2 형상 ATPases 기능, 다른 큰 멀티 소단위 복합체 촉매 서브 유닛으로서 기능하는 동안. 리모델링 복합체가 그들의 활동에 기여 염색질의 서브 유니트 각각은 리모델링 과정을 해부 생화학 분석을 수행 할 수있는 능력을 필요로하는 분자 메커니즘을 해명. 인간 INO80 착물 및 기타 염색질 개조 효소에 의해 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링은 그 DNA- 및 / 또는 뉴 클레오 의존적 ATPase를 활성화 한 후, 뉴 클레오로 리모델링 효소의 결합을 시작하는 다단계 과정으로 구상 될 수있다 뉴 클레오 솜 DNA, 그리고 뉴 클레오 1,2의 최종 위치 조정에 리모델링 효소의 전위. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 프로세스 (R)의 분자 세부 사항을 이해반응의 각 단계에 크로 마틴 리모델링 복합체의 개별 서브 유닛의 기여의 리모델링의 각 단계에 대한 반응 및 정의의 절개를 equires. 이런 분석은 in vitro에서 정의 된 분자의 기판을 사용하여 뉴 클레오 리모델링 및 기타 활동을 분석 할 수있는 능력을 필요로한다. 이전 조브 프로토콜에서, 우리는 정의 서브 유닛 조성 3 INO80 크로 마틴 리모델링 복합체 및 서브 콤플렉스를 생성하는 데 사용되는 절차를 설명했다. 여기서 우리는, DNA- 및 뉴 클레오-ATPase의 활성화, 이러한 복합체와 관련된 뉴 클레오 리모델링 활동을 결합 뉴 클레오의 정량 분석​​을 가능하게 세 가지 생화학 적 분석을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR 반응 완충액;</td><td>Roche 응용 과학&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq DNA 중합효소</td><td>Roche Applied Science&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>NucAway 뉴클레아제가 없는 스핀 컬럼&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>초순수 ATP&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼 알부민&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비스 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>초음파 연어 정액 DNA&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% 과황산암모늄 (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>벤조나제&nbsp;</td><td>노바젠</td><td>고양이. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR 열 순환기 PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer 수직 전기영동 유닛</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>윤활 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>저장 인광 스크린&nbsp;</td><td>분자 역학</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM 여과지</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>태풍 인광이미저&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant 소프트웨어</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC 유리판, PEI-셀룰로오스 F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>엔드 윈도우 또는 팬케이크 GM (Geiger-Mueller) 프로브가있는 범용 측량 미터</td><td>Biodex</td><td>모델 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

atp에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

SNF2 계열의 구성원은 종종 ATP 의존성 뉴클레오솜 리모델링을 촉매하여 뉴클레오솜 역학 및 DNA 접근성을 조절하는 다중 소단위 염색질 리모델링 복합체의 구성 요소로 기능합니다. 다단계 ATP 의존성 염색질 리모델링 반응에 대한 이러한 복합체의 개별 소단위의 기여를 생화학적으로 해부하려면 반응 생성물의 생산을 모니터링하고 반응 중간체의 형성을 측정하는 분석을 사용해야 합니다. 이 JOVE 프로토콜은 다양한 서브유닛 조합을 포함하는 염색질 리모델링 복합체 또는 서브 컴플렉스의 생화학적 활성을 측정할 수 있는 분석을 설명합니다. 염색질 리모델링은 전기영동 이동성 이동 분석법(EMSA) 기반 방법을 사용하여 DNA 분자에서 뉴클레오솜의 움직임을 모니터링하는 ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩 분석을 사용하여 측정됩니다. 뉴클레오솜 결합 활성은 유사한 EMSA 기반 방법을 사용하여 리모델링 복합체 결합 단뉴클레오솜의 형성을 모니터링하여 측정하고, DNA 또는 뉴클레오솜 의존성 ATPase 활성은 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 DNA 또는 뉴클레오솜이 존재할 때 ATP가 ADP 및 인산염으로 전환되는 속도를 측정합니다. 이러한 분석을 사용하여 전체 복합체의 활동을 하나 이상의 소단위가 없는 활동과 비교하여 염색질 리모델링 복합체의 소단위의 기능을 조사할 수 있습니다. 인간 INO80 염색질 리모델링 복합체가 예로 사용됩니다. 그러나, 여기에 기술된 방법은 다른 염색질 리모델링 복합체의 연구에 적용될 수 있다.

수치는 뉴 클레오 슬라이딩 (그림 1) 및 바인딩 (그림 2) 분석 및 DNA- 또는 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 (그림 3)을 포함 INO80 활동을 특성화하는 데 사용되는 생화학 적 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 그림 1의 실험은 그대로 INO80 단지의 능력 FLAG-Ies2 또는 FLAG-INO80E을 통해 정제 INO80은 216 BP, 방사성 동위 원소 표지 된 DNA 단편 조립 mononucleosomes의 리모델링을 촉진하기 위해 FLAG-Ino80ΔN 또는 Ino80ΔNΔHSA 중 하나를 통해 정제 서브 콤플렉스의 비교합니다. DNA 단편의 뉴 클레오 솜의 위치는 전기 이동성에 영향을 미칩니다 측면에 위치 뉴 클레오 빨리 더 중앙에 위치 뉴 클레오보다 젤에서 실행합니다. INO80 염색질 리모델링 복합체가 우선적으로 DNA <s...

여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

다음 절차의 목적은 TP 의존성 염색질 리모델링 복합체의 다양한 생화학적 활성을 측정하는 것입니다. 이는 전기영동 이동도 변화 분석법(electrophoretic mobility shift assay 또는 emsa)을 사용하여, DNA 분자의 한쪽 끝에 위치한 뉴클레오솜이 DNA의 더 중앙 부분으로 TP 의존적으로 슬라이딩하는 것을 측정함으로써 달성됩니다. 유사한 EMSA 기반 방법을 사용하여 리모델링 복합체가 결합된 단일 뉴클레오솜 존의 형성을 모니터링함으로써 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 평가할 수 있습니다.또한, 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)를 사용하여 TP 의존적 염색질 리모델링 복합체의 APA 활성을 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 방법들은 인간의 O 80 복합체 내 TP 의존적 염색질 리모델링을 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 본 영상에서는 NO 80 염색질 리모델링 복합체를 연구하는 생화학적 분석법을 시연하겠습니다.유사한 방법을 다른 염색질 리모델링 복합체를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. TP 의존적 뉴클레오솜 리모델링 분석을 수행하려면, 먼저 표에 설명된 대로 100 µL PCR 반응을 설정하여 뉴클레오솜 기질을 준비하십시오. 써멀 사이클러에서 PCR 반응을 수행한 후, 결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 반응 생성물을 뉴클레아제 프리 스핀 컬럼에 두 번 통과시키십시오.다음으로, 50 µL의 완충액에 P 32로 표지된 6 0 1 DNA 단편 2 nmol과 6 µg의 hilar 뉴클레오솜을 섞고, 혼합물을 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, EDTA, PMSF 및 DTT가 첨가된 tris HCl 완충액을 각각 12.5 µL, 20.8 µL, 41.6 µL씩 순차적으로 첨가하여 혼합물을 0.8 M, 0.6 M, 0.4 M NaCl 농도로 희석하며, 매 첨가 후 30 °C에서 30분 동안 배양합니다. 마지막 배양 후, non indebt P 40 글리세롤과 PSA가 추가로 첨가된 tris hydrochloride 완충액 125 µL와 250 µL를 넣어 0.2 M 및 0.1 M NaCl 농도로 각각 두 번 더 희석하며, 매 단계마다 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 후, 네이티브 폴리아크릴아마이드 겔을 제작하여 분석을 준비하기 전까지 모노 뉴클레오솜 기질을 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오. 다음으로, 수행할 각 반응에 대해, 사전 냉각된 실리콘 처리된 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 20 nM의 NO 80과 4.75 µL의 부피가 되기에 충분한 양의 EB 100 버퍼를 혼합하십시오. 남은 NO 80 함유 분획은 분쇄된 드라이아이스를 사용하여 즉시 다시 냉동 보관하십시오.다음으로, 갓 준비한 마스터 칵테일 5.25 µL를 각 반응 튜브에 분주하고, 피펫팅을 통해 충분히 혼합합니다. 그런 다음 30 °C 가열 블록에서 반응물을 배양합니다. 배양이 끝나면 각 튜브에 갓 준비한 제거 믹스(removing mix) 1.5 µL를 첨가하여 반응을 중단시킨 후, 각 반응 튜브를 혼합합니다.원심분리한 후 30 °C에서 30분 동안 추가로 배양합니다. 그동안 수직 전기영동 장치에서 0.5 X TBE를 전기영동 완충액으로 사용하고, 하단 챔버 내에 마그네틱 바를 넣어 완충액이 지속적으로 순환되도록 하여 4 °C에서 100 V로 30분 동안 native polyacrylamide 겔을 사전 작동시킵니다. 배양이 끝나면 혼합물을 꺼내어 각 반응액에 2.5 µL의 로딩 다이(loading dye)를 넣고 섞습니다. 짧게 원심분리한 후, 로딩 팁을 사용하여 샘플을 겔에 로딩합니다.완충액을 순환시키며 4 °C에서 200 V로 4.5시간 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 그 후 겔을 두 장의 필터 페이퍼 위에 옮기고, 신호를 검출하기 위해 투명 플라스틱 랩을 사용하여 겔이 놓인 필터 페이퍼를 떨어뜨립니다. 겔을 4 °C에서 원하는 시간 동안 보관용 인광 스크린에 노출시킨 다음, 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 스크린을 스캔하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석함으로써 DNA 및 뉴클레오솜 의존적 APA 분석을 수행합니다.먼저, 각 반응당 미리 냉각된 윤활 처리된 1.5 milliliter 미세 원심분리 튜브에 10 ~ 50 nanomolar의 면역 정제된 하위 복합체와 총 부피가 2.2 microliters가 되기에 충분한 양의 eeb 100 버퍼를 혼합하고, NO 80을 포함하는 분획은 즉시 가루 형태의 드라이아이스로 다시 냉동하십시오. 그런 다음, DNA 뉴클레오솜을 포함하거나 포함하지 않는 갓 준비한 sub 칵테일 2.8 microliters를 효소가 포함된 반응 튜브에 넣고 피펫팅을 통해 위아래로 부드럽게 섞은 후, 튜브를 30 degrees Celsius 히팅 블록으로 옮기십시오. 다음으로, 연필을 사용하여 20 by 10 폴리에틸렌의 바닥 가장자리에서 최소 1.5 centimeters 떨어진 곳에 아주 연하게 선을 그으십시오.얇은 층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트를 의미합니다. 그런 다음 배양 후 5, 15, 30, 60분 시점에 각 반응 혼합물 0.5 µL를 라인 위에 점적하고, 각 샘플을 즉시 히팅 블록으로 되돌려 보내어 단일 튜브에서 여러 시점의 샘플을 채취할 수 있도록 합니다. 마지막 샘플을 도포한 후, 헤어드라이어를 사용하여 플레이트를 건조시킨 다음 충분한 양이 들어 있는 유리 챔버로 플레이트를 옮깁니다.TLC 플레이트의 하단 0.5 centimeters가 용액에 잠기도록 0.375 molar 인산칼륨을 넣습니다. 챔버의 덮개를 닫고 액상 전선이 TLC 플레이트 상단에 도달할 때까지 전개한 후, 즉시 플레이트를 송풍 건조하고 실온에서 보관용 포스포 스크린에 노출시킵니다. 마지막으로, 동위원소 이미징 스캐너 시스템으로 스크린을 스캔하여 방사성 TP 기질과 DP 생성물의 양을 측정합니다.이 첫 번째 실험은 flag IES two flag, N-O-A-T-E 및 flag NO 80 delta N을 통해 정제된 복합체가 유사한 뉴클레오솜 슬라이딩 활성을 가지고 있음을 보여주며, 이는 NO 80 N 말단 및/또는 그 관련 하위 단위가 NO 80 복합체에 의한 뉴클레오솜 리모델링에 필수적이지 않음을 나타냅니다. 반면에, flag NO 80 delta n delta HSA를 통해 정제된 복합체는 이 분석에서 비활성 상태이며, 이는 리모델링 활성이 NO 80 APAs의 HSA 도메인 및/또는 그 관련 하위 단위에 의존함을 나타냅니다. 뉴클레오솜 슬라이딩 분석 절차를 수정하여 사용하면 염색질 리모델링 복합체의 뉴클레오솜 결합 활성을 측정할 수 있습니다.본 실험에서, NO 80 E 서브유닛을 통해 정제된 온전한 NO 80 복합체의 양을 증가시키며 뉴클레오솜과 함께 배양한 결과, 유리 모노뉴클레오솜(free mononucleo zones)에 해당하는 밴드가 농도 의존적으로 사라지고 젤 상단 근처에서 이동하는 새로운 이동 변이종(shifted species)이 나타났습니다. 이와 대조적으로, NO 80 delta N을 통해 정제되어 NO 80 서브유닛의 일부가 결여된 더 작은 복합체와 뉴클레오솜을 배양했을 때는 이동 변이종이 더 빠르게 이동하였으며, 이는 슈퍼 시프트 밴드(super shifted band)의 상대적 이동도가 분석에 사용된 복합체의 크기에 의해 결정됨을 시사합니다. 마지막 실험에서는 두 가지 서로 다른 NO 80 서브복합체의 DNA 및 뉴클레오솜 활성화 APA 활성을 비교 분석한 결과가 제시됩니다.더 느리게 이동하는 반점은 시작 물질인 alpha 32 P 표지 a TP에 해당하며, 더 빠르게 이동하는 종은 A DP 반응 생성물이며, 화살표는 용매가 이동한 방향을 나타냅니다. 이러한 절차를 사용할 때는 시간 길이를 달리하고 효소 농도를 다르게 하여 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 이를 통해 생성물 시간 및 용량 반응 곡선이 선형일 때 측정이 이루어지도록 보장할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 정제된 염색질 리모델링 복합체의 nucleosome 결합 및 Nucleosome sliding 활성을 분석하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 실험복과 보안경을 착용하고, 방사성 오염 여부를 모니터링하며, 방사성 폐기물을 적절하게 처리하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

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염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

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DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

배우세요 ATP 의존 염색질 리모델링 효소의 생화학적 활성을 EMSA와 TLC 기법으로 분석하는 방법을. 뉴클레오솜 슬라이딩, 결합 활성 및 ATP 가수분해를 정량화하여 유전자 조절 메커니즘을 연구합니다.

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

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