보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 정상적인 신경 신호 전달 중 독소 기능을 억제하는 작은 분자를 식별하기 위해 IES 보툴리눔이 기질 SNAP 25의 절단을 매개하는 표현형 선별 분석을 개발하는 것입니다. 활동 전위는 SNAP 25가 시냅스 소포를 운동 뉴런 말단의 원형질막에 결합하여 신경 전달 물질의 방출을 초래합니다. 그러나 보툴리눔 신경독이 존재하면 세포내이입에 흡수되어 시냅스 부톤에서 방출되어 SNAP 25를 절단하여 신경전달물질의 방출을 방해하여 마비를 유발합니다.

이 분석법은 보툴리눔 독소 활성을 억제할 수 있는 분자를 식별하여 보툴리눔 독소가 있는 상태에서 SNAP 25 절단을 방지하여 신경근 접합부에서 신경전달물질 방출을 복원할 수 있습니다. 마우스 운동 뉴런으로 수행된 고함량 이미징 분석은 SNAP 25의 보존을 입증하는 데 사용되어 보툴리눔 신경독의 메탈로 프로테아제 활성을 억제할 수 있는 작은 분자를 식별합니다. A. 이 기술 또는 cell-free 생화학 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 스크리닝 화합물 및 독소로 처리된 운동 뉴런을 포함하는 단일 웰에서 여러 표현형 종말점을 동시에 캡처할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 세포 기반 활성 및 세포 독성의 정량화와 같은 라이브러리 스크리닝 중에 발생하는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 보툴리눔 중독 치료로 확장되는데, 이는 금속 단백질 분해 효소 활성을 직접 차단하거나 독소 흡수 처리 또는 기타 메커니즘을 차단하여 간접적으로 작용하는 억제제를 식별할 수 있기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 SNAP 25 검출에 필요한 면역염색 조건의 최적화가 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 면역염색 단계는 주위의 모터가 다소 섬세하기 때문에 완벽하기 어렵기 때문입니다. 스탠딩 및 세척 단계는 다운스트림 분석에 필요한 고품질 이미지를 개발하기 위한 핵심입니다. 살아있는 세포와 활성 독소를 활용하는 모든 연구는 생물 안전 레벨 2 조건에서 수행되며, 마이크로 켐 용액과 같은 5% 세제 소독제 세척제로 이러한 실험 전후에 작업 영역의 오염을 제거합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 배아 줄기세포를 운동 뉴런으로 분화한 후 12채널 수동 피펫을 사용하여 기존 배지를 교체합니다. 80마이크로리터의 새로운 말단 분화 매체가 있는 96개의 웰 플레이트에서 흡입 및 분주 단계를 행별로 수행하여 셀이 주변 공기에 노출되는 것을 최소화합니다. 다음으로, 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 10 x 테스트 화합물 10마이크로리터를 추가한 다음 x를 혼합하기 위해 두 번 흡인합니다.

6개의 웰로 구성된 2개의 열을 매체에 희석된 10 X-D-M-S-O로 처리하여 높은 신호 및 낮은 신호 제어 역할을 합니다. 섭씨 7도에서 30분 동안 화합물로 세포를 배양하고 이산화탄소를 6%로 배양합니다. 다음으로, 다채널 피펫을 사용하여 최종 10 X 작업 스톡을 생성하기 위해 PBS에서 보툴리눔 신경독소 A를 희석하고, 10 x 보툴리눔 신경독소 스톡의 10마이크로리터를 처리를 위해 지정된 웰과 낮은 신호 제어 웰에 추가합니다.

고위험군으로 지정된 우물을 매체만으로 처리하고, 보툴리눔 신경독소와 접촉하는 모든 플라스틱 마모 및 기타 일회용품의 오염을 제거합니다. A: 0.825%차아염소산염 용액에 최소 20분 동안 물에 담그십시오. 독소 사용을 나타내기 위해 플레이트에 명확하게 라벨을 붙이고 배양 후 섭씨 37도에서 6%의 이산화탄소에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 독소와 화합물이 포함된 매체를 제거하고 10% 표백제 용액에 넣어 폐기합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 각 웰에 직접 첨가하여 보툴리눔 신경독을 막습니다. 단백질 분해 분열.

다음으로, 고정이 일어날 수 있도록 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 고정 후, 폐기된 중화 시약은 생물 안전성 레벨 1 프로토콜에 따라 처리하고 그에 따라 폐기합니다. 메탄올을 버린 후 100마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척하여 면역 염색 전에 재수화합니다.

클래스 2 생물 안전성 작업대에서 수행되는 면역 염색은 필요에 따라 사람의 개입 없이 시약에 접근할 수 있도록 배치된 자동화된 워크스테이션을 사용하여 수행됩니다. 고정 셀이 포함된 플레이트를 PLATE 매거진에 로드하고 액체 취급 작업에 필요한 경우 데크로 옮깁니다. 워크스테이션은 250마이크로리터 팁이 장착된 96 피펫 헤드를 사용하여 웰에서 10마이크로리터까지 PBS를 흡입합니다.

워크스테이션은 PBS에서 1%horse 혈청과 0.1%tween 20을 포함하는 100마이크로리터의 차단 버퍼를 모든 마이크로 플레이트에 분배합니다. 그런 다음 플레이트를 플레이트 매거진에 다시 넣어 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 차단 완충액을 제거하고 BS 항체 밀리리터당 4마이크로그램 50마이크로리터와 블로킹 버퍼인 베타 3 튜불린 밀리리터당 0.5마이크로그램을 모든 플레이트에 분배합니다.

플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 1차 항체를 제거하고 100마이크로리터의 PBST로 3회 세척합니다. 밀리리터당 2마이크로그램을 준비하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다른 플루오로 4로 라벨링된 2차 항체의 희석액을 준비합니다. 혼합물 50마이크로리터를 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후 2차 항체를 흡인하고 100마이크로리터의 PBST로 3회 세척합니다.

다음으로, 32 마이크로몰 후크를 포함하는 100마이크로리터의 PBS에서 핵 검출을 위해 DNA를 염색하기 위해 염료를 주입합니다. 마지막으로 광표백으로부터 플루오로 4층을 보호하기 위해 가벼운 불투과성 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트는 심각한 신호 손실 없이 몇 주 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

이미지 획득 시스템에서 플레이트 유형을 grinder u로 지정합니다. 레이아웃을 96으로 지웁니다. 필드 수를 16으로, 대물렌즈를 20 x water로 형식을 지정합니다.

그런 다음 405나노미터의 핵 여기를 위한 채널을 선택합니다. 640 나노미터의 세포질 여기를 위해 채널 4를 선택합니다. 561나노미터의 항원 특이적 항체 채널 여기를 위해 채널 2를 선택하고 채널 3을 선택합니다.

다음으로 각 레이저의 여기 파워를 설정합니다. 이 실험은 640나노미터에서 1:1 여기(1:1 excitation)를 설정하는 두 가지 노출과 405 나노미터 및 561 나노미터에서 2-2 여기(excitation)를 설정합니다. Benning을 빈 2로 선택합니다.

최대 강도로 노출 최적화를 위해 SNAP 25 채널로 높은 제어 웰을 사용하고 최소 강도를 위해 낮은 제어 웰을 사용합니다. 각 채널의 강도가 채도 레벨의 약 절반 또는 약 2000에서 2, 500 상대 단위가 되도록 노출을 조정합니다. 다음으로, 델타 보정 스크립트를 사용하여 셀 마스크 채널에서 최적의 Z 평면을 식별합니다.

이미지 분석 소프트웨어에서 신경돌기 알고리즘을 선택하여 신경돌기를 분할합니다. beta three tubulin channel의 마이너스 3 픽셀 확장을 마스크로 사용하여 2차 물체인 신경돌기를 기반으로 신경돌기 영역을 식별합니다. 신경돌기 영역과 베타 3 튜불린 채널에 대한 신호 채널의 강도를 계산합니다.

신경돌기 길이, SNAP 25 베타 3의 평균 강도, 튜불린 핵 수 및 신경돌기 세그먼트 수와 같은 내보내기를 위해 원하는 매개변수를 선택합니다. 설정이 완료되었습니다. 로봇을 사용하여 플레이트 스태커에서 플레이트를 옮기고 High Content Imager에 로드한 다음 이미지 획득을 시작합니다.

여기에 표시된 것은 제어 웰에서 계산된 분할 비율의 상자 그림 분석입니다. 분홍색은 매체만 있고 독소가 없는 우물인 높은 신호 제어를 나타냅니다. 이 우물에서는 분열이 거의 관찰되지 않습니다.

파란색은 낮은 신호 제어, 즉 독소만 있고 샘플 화합물이 없는 우물을 나타냅니다. 이 우물은 상당한 분열을 기록했습니다. 제어 값의 이러한 히스토그램 분포는 두 제어 모집단 사이의 거리를 보여줍니다.

스크리닝 프로세스의 목표는 표본 모집단 내에서 positive control 모집단에 더 가까운 값을 가진 화합물을 찾는 것입니다. 보툴리눔 신경독 A를 함유한 192개의 복합 처리된 샘플의 분포는 여기에 녹색으로 표시되어 있습니다. 이 우물의 대부분은 상당한 분열을 보였습니다.

그러나 대조군과 비교했을 때 유의미한 분열이 없는 통계적으로 유의한 몇 가지 이상치가 있었습니다. 제어 값은 이 히스토그램 분포에서 분홍색과 파란색 막대로 다시 표시됩니다. 녹색 막대는 표본 값과 대조 값의 겹침을 보여주었습니다.

hits로 간주되는 표본 값은 표본 모집단의 중앙값에서 3 표준 편차보다 낮은 분열 비율 값을 가진 이상치에서 선택되었습니다. 이 4개의 히트는 높은 신호 제어와 유사한 값을 가지며 SNAP 25 절단을 차단하는 synanon에 대한 억제제로 알려진 보툴리눔 신경독소인 동일한 화합물을 나타냅니다. 이 억제제는 보툴리눔 신경독소 A에 대한 강력한 SNAP 25 보호를 입증했으며, 독소와 이 억제제는 모두 독소가 없는 웰과 유사하게 작용하고 독소가 있는 웰과 유사하지 않게 작용했지만, 억제제가 없었습니다.

이 기술은 적절하게 수행되면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 에세이의 통계적 성과를 계산하고 각 개별 선별 플레이트에 대해 합격 불합격 결정을 가능하게 하기 위해 여러 컨트롤을 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 생화학적 단백질 분해 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 Bot의 직접 또는 간접 억제제로서의 스크리닝 히트 평가와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 면역 염색을 통한 SNAP 25의 정량화를 1차 종점으로 사용하는 표현형 스크리닝 분석을 자동화하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다. 보툴리눔 신경독소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 말아야 하며, 개인 보호 장비를 사용하고 보틴에 대한 적절한 오염 제거 및 폐기 절차를 시행하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이 절차를 수행하는 동안 항상 신경독을 복용해야 합니다.