Name: 보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 배우세요 보툴리눔 신경독 억제제를 식별하기 위한 고내용 이미징 분석법을. 마우스 운동신경원을 이용한 이 표현형 스크리닝은 SNAP 25 절단을 방지하고 신경전달물질 방출을 회복시키는 분자를 찾아내어 신경독 중독 치료제 개발에 활용됩니다.

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기금은 공동 과학 기술 사무소 – 화학 생물학 방어 (JSTO-CBD), 국방 위협 감소 기관 (DTRA), 스폰서 프로젝트 번호 CCAR# CB3675 및 국립 보건원 (1 R21 AI101387-01 및 5 U01AI082051-05)에서 제공했습니다.

플레이트 20,000 차별화 된 마우스 ES 세포 (MES) / 웰 96 웰 폴리 D 라이신 코팅 된 플레이트에 5-7 일 운동 신경 터미널 차별화 미디어에서 유지한다. 본트 / A 1. 복합 관리 및 중독 CDC / NIH 가이드 라인을 준수하기 위해 BSL2 인클로저에 다음과 같은 모든 작업을 수행합니다. <ol><li> 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 100 % DMSO의 각 라이브러리 화합물의 10 mM의 재고 솔루션을 준비합니다. 원하는 검사 농도보다 10 배입니다 중간 희석 판을 준비하기 위해 10 mM의 주식을 사용합니다. 96 웰 플레이트에 10 mM의 주식을 분배 100 μM의 중간 판을 준비하고 문화 미디어를 사용하여 100 μM의에 희석. 셀 (11)에 미디어의 90 μL에 화합물의 10 μl를 분배. 10 μM의 최종 농도에서 시험 화합물 0.5 %를 초과하지 않는 DMSO의 최종 비율을 확인. </li><li> 모든 스터드를 수행바이오 안전성 수준이 조건에서 살아있는 세포 활성 독소를 활용 이거 야. 신선한 터미널 차별화 미디어의 80 μL은 12 채널 매뉴얼 피펫을 이용하여 96 웰 플레이트에서 기존 미디어를 교체합니다. 흡입을 수행하고 주위 공기에 용지없이 세포의 노출을 방지하기 위해 행함으로써 단계를 분배. </li><li> (2 회) 종래 흡인 혼합하여 12 채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 10 배 화합물 10 ㎕를 첨가하여 독소의 애플리케이션 화합물과 세포를 전처리. 각 96 웰 플레이트를 들어, 높은 신호와 낮은 신호 제어를 제공하기 위해 미디어에 희석 10 배 DMSO 6 우물의 두 열을 취급합니다. 본트의 처리없이 열은 전체 길이 SNAP-25 (높은 신호 제어)의 최고 수준을 나타낸다. 낮은 신호 제어와 같은 (어떤 화합물없이) 혼자 본트와 다른 열을 처리합니다. (BACS 항체와 SNAP-25의 검출 본트 절단의 효율성을 관찰하기 위해 그림 2의 컨트롤을 사용하여). </li><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 및 6 % CO 2의 화합물과 세포를 부화. </li><li> 인산염에 1 ㎎ / ㎖ 상용 소스에서 보툴리눔 신경 독소 A를 준비 터미널 차별화 미디어 희석하여 최종 10 배 근무하는 식염수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 멀티 채널 피펫 (그림 2)를 사용하여 치료 및 낮은 신호 컨트롤에 대해 지정된 우물에 10 배 본트 / A 주식의 10 μl를 추가하여 중독을 시작합니다. 형 미디어와 높은 제어로 지정된 우물을 취급합니다. </li><li> 20 분 이상 물에 0.825 % 차아 염소산 용액에서 침수로써의 연구 기간 동안 본트 / A와 접촉하는 모든 플라스틱 구조물 및 기타 일회용 오염을 제거. 바이오 안전성 캐비닛의 모든 절차를 수행하고 이전과 같은 MICROCHEM 솔루션으로 5 % 세제 살균제 청소기로 실험 전후에 작업 지역의 오염을 제거. </li><li> 독소 사용 incub을 나타 내기 위해 명확하게 번호판을 레이블먹었다 플레이트 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간과 6 % CO 2는 1nm / L가 본트 / A로 처리 하였다. 독소는 실험실에서 사용 중임을 동료들에게 알려 적절한 간판을 표시합니다. </li><li> 정지 본트 / 메탄올 고정하여 단백질 분해 절단. 멀티 채널 피펫 각 우물에서 독소 및 화합물을 포함하는 미디어를 제거하고 10 % 표백제 용액에 버린다. 각 웰에 직접 얼음 냉 메탄올 (100 μL)를 추가합니다. </li><li> 정착이 발생할 수 있도록, 실온 (RT)에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 고정 후, 안전하게 바이오 안전성 레벨 1 프로토콜을 폐기 시약 (중화 간주)을 처리하고 그에 따라 폐기하십시오. </li><li> 메탄올을 취소하고 세포를 씻어 면역 염색하기 전에 그들을 재수하는 PBS 100 μl를 사용합니다. 두 개의 추가 PBS 세척을 수행합니다. </li><li> 최종 세척 한 후, 분석 할 때까지 4 ° C에서 마이크로 접착 필름 및 저장소와 우물, 인감 플레이트에 PBS를 둡니다. 4 ° C의 FO에서 보관 판며칠 r에. </li></ol> 2. 면역 염색 면역 염색 과정은 상당한 intraplate과 interplate 변화의 잠재적 인 도입으로 이어질 수 반복 시약 분배 / 대기음주기와 폭 넓은 플레이트 세척을 포함하는 노동 집약적, 다단계 작업입니다. 반자동 방식은 실험실 요원의 시간을 절약 분석 처리량을 증가시키고, 면역 염색 변동성을 최소화하기 위해 적용된다. <ol><li> 이 프로토콜에 대한 모듈러 갑판의 다른 위치 (재료 및 장비를 참조)로 실험 실용을 이동 로봇 그리퍼 아암 250 μL 및 집적 볼륨을 전송할 수있는 96- 웰 헤드를 갖춘 자동화 된 워크 스테이션을 사용한다. <ol><li> 모듈 형 데크 실험 실용의 다른 유형을 개최하고 한 번에 최대 11 항목에 지원할 수있는 설계되었습니다. 자동 마이크로 처리기가 유지하기 위해 이중 잡지 마이크로 플레이트 스태커를 구비하고,사이클 당 50 판까지 조작 할 수 있습니다. </li><li> 자동화 된 워크 스테이션은 불임과 안전을 제공하기 위해 실험실 자동화 장비를 위해 설계된 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 내부에 있습니다. 필요에 따라 인간의 개입없이 시약 액세스 할 수 있도록도 3에 도시 된 바와 같이 자동 면역 염색을 위해, 갑판 배치된다. </li></ol></li><li> 액체 처리 동작에 필요한 갑판 플레이트 잡지 및 전송로 고정 된 세포를 포함하는 사전로드 플레이트. 아래로 10 μL로 우물에서 PBS를 대기음 250 μL 팁 장착 (96) 피펫 헤드를 사용합니다. 투과성으로 완충액 (0.1 % 트리톤 X-100)으로 세포 내 표적에 결합하는 항체를 용이하게 세포막을 Permeabilize 하시려면. 웰을 실온 (RT)에서 15 분 배양 용 마이크로 플레이트 스태커의 제 2 저장 잡지 판을 반환하기 전에 각으로 투과성으로 완충액 (100 μL)를 분주한다. </li><li> 투과성으로 버퍼와 PE를 제거PBS (2 회)와 rform 플레이트의 세척은 이전 단계 1.13에 설명. </li><li> 마지막 세척 단계 후, PBS 완충액 및 RT에서 1 시간 인큐베이션 판 잡지에 반환하기 전에 모든 마이크로 플레이트에 PBS에 1 % 말 혈청, 0.1 % 트윈 20을 함유하는 블로킹 완충액 100 ㎕를 분배 제거. </li><li> 면역 염색에 대한 두 가지 기본 항체를 사용하여 토끼 폴리 클로 날 항 - 마우스 BACS 항체를, 전체 길이 SNAP-25와 마우스 단일 클론 항 III 튜 불린 항체의 검출 뉴런 (재료 및 장비를 참조)의 검출. 인큐베이션 60 분 후, 블로킹 완충액 제거하고 모든 플레이트에 블로킹 완충액에 4ug / ㎖ BACS 항체 및 III-tubulin의 0.5 ㎍ / ml의 50 μl를 분배. </li><li> RT는 0.05 % 트윈 (PBST)을 포함하는 PBS 100 ㎕로 3 회 차 항체를 제거하고 세척에서 1 시간 동안 품어. </li><li> 알렉사 F 태그 -III의 tubulin 및 안티 - 토끼 IgG를 시각화하는 알렉사 플 루어 647 표지 항 마우스 IgG를을 사용하여luor 568 BACS 항체를 시각화합니다. 버퍼를 차단에 2 ㎍ / ㎖의 희석 등 모두 항체를 준비하고 각 우물에 혼합물의 50 μl를 분배. 참고 : 면역 염색으로 선택 이차 항체는 높은 함량 이미 저의 검출기 내에서 서로 다른 채널을 사용하여 서로 다른 파장에서 그들의 방출되는 형광 빛을 감지 할 수 있도록 서로 다른 형광 물질로 표시되어 있습니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 품어. 이차 항체를 대기음 PBST 100 ㎕로 3 회 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 핵 탐지를위한 DNA를 얼룩 PBS 포함 훽스트 (Hoechst) 염료 (32 μM) 100 μL를 추가합니다. </li><li> photobleaching에에서 형광을 보호하기 위해 빛 투과성 필름 판을 밀봉합니다. 플레이트는 4 저장할 수 있습니다 &#160; 신호의 상당한 손실없이 주 동안 C를 °. </li></ol> 3. 영상 참고 : 높은 콘텐츠 이미징 sys 인을 사용하여 이미지 수집을 수행TEM (재료 및 장비를 참조하십시오). <ol><li> 고 함량 이미 저 정의의 사양 : <ol><li> 선택 플레이트 형, 레이아웃, 필드의 수, 목적 : 그레이 너 U 분명, 20 배의 물을 각각 96 웰 형식, 16,. </li><li> 선택 채널 : 핵 여기 EX : 채널 4와 같은 405 nm의; 세포질 EX : 채널 2와 같은 644 nm의; 항원 특이 항체 채널 EX : 561 채널 3과 나노 각 레이저의 설정 여기 전원, 2 노출로 설정 실험, 644 nm에서 하나 여기, 405 nm의 561 nm에서 두 음원 정보와 노출 2 노출 1. BIN2으로 비닝 (binning)을 선택합니다. </li><li> SNAP-25 채널과 최소한의 강도에 대한 낮은 제어 우물로 최대 강도와 노출 최적화를 위해 높은 제어 우물을 사용합니다. </li><li> 각 채널의 강도가 포화 레벨 (2,000-2,500 상대 단위)의 약 절반이되도록, 노출을 조정한다. </li><li> 델타 보정 스크립트를 사용하여 셀 마스크 채널에 최적의 Z 평면을 식별합니다. 참조 인터넷면역 염색 및 이미징 후 결과를 gure 5. 이미지 분석 소프트웨어가 상주하는 서버에 데이터를 내 보냅니다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 분석 (그림 6) 주 : 다음 단계는 콜럼버스 소프트웨어 알고리즘의 응용 프로그램을 설명합니다. <ol><li> 기본 객체 (핵) 세그먼트에 대한 적절한 알고리즘을 선택합니다. 필요한 경우, 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 콜럼버스 소프트웨어는 4 핵 검출 방법을 제공한다. 시각적으로 분할 핵을 검사하여 정확하게 세그먼트 핵 (F igure의 6A 방법 M에서 선택한 경우)하는 방법을 선택합니다. </li><li> 필요한 경우, 세그먼트에 신경 돌기를 신경 돌기 알고리즘 (CSIRO 신경 돌기 분석 2) 선택 배경을 제거하기 위해 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 신경 돌기를 감지하는 데 사용 매개 변수도 6b를 참조하십시오. </li><li> 신경 돌기 지역 (신경 돌기 세그먼트) BAS를 확인ED β-III 튜 불린 채널 마스크 (그림 6C)와 같은 (알렉사 밀가루 640)의 -3 픽셀 확장을 사용하여 보조 객체 (신경 돌기)에. </li><li> 신경 돌기 영역 및 β-III 튜 불린 채널 (그림 6D 및 6E)에 대한 신호 채널 (SNAP-25 (알렉사 밀가루 568)의 ​​강도를 계산합니다. </li><li> 이러한 신경 돌기의 길이, SNAP-25의 평균 강도, β-III의 튜 불린, 핵 번호, 신경 돌기 세그먼트 번호 등 (그림 6 층) 등의 수출에 원하는 매개 변수를 선택합니다. </li><li> 이미지 획득을위한 고 함량 이미 저에 로봇과 부하를 사용하여 플레이트 스태커에서 전송 접시. </li></ol> 5. 데이터 분석 : 설계된 분석의 견고성을 평가하기 위해, 플레이트 기반 실험으로부터 다음과 같은 파라미터를 계산한다. <ol><li> 배경에 신호 (S) (B) : 낮은 신호 제어의 S는 / B = 의미 /) 높은 신호 제어의 강도를 의미 강도 </li> &lt;액체 취급에 변동을 결정하는, CV = (표준 편차 (SD) 시료 / 평균) * 100 (%) : 리&gt; 신호와 배경의 변동 (CV)의 계수 (특정 신호의 균일 성을 측정) 시약 등 </li><li> 잡음 신호 : S는 = - 낮은 제어 / SD을 (신호의 강도를 의미하는 낮은 신호 제어의 강도를 의미) <ol><li> 하나의 96- 웰 플레이트의 절반 및 나머지 절반의 모의 중독 중독과 Z &#39;팩터를 계산한다. Z &#39;= 1 - 3 * (높은 신호 제어 + 낮은 신호 제어의 SD의 SD가) / (높은 신호 제어의 의미 - 낮은 신호 제어의 평균). 스크리닝 데이터의 추가 분석을 위해, 플레이트에 기초 기본 원료 일부 파라미터 비교 판 사이 실험의 다른 일 사이 있도록 정상화. </li></ol></li><li> 쪼개짐 % = 100 % * (MEA : 전체 길이 SNAP-25 특이 적 항체에 의해 검출 (BACS)와 연관된 신호의 감소를 반영하는 분열의 퍼센트,높은 신호 제어 n 개의 강도 - 시료의 강도) / 고 신호 제어의 강도를 의미한다. </li><li> 분열의 억제 백분율 : 억제 % = 100 % * - / (- 낮은 신호 제어의 강도를 의미하는 높은 신호 제어의 강도를 의미) (샘플의 강도는 낮은 신호 제어의 강도를 의미한다). </li></ol>

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Krishna P Kota는 이 원고에 사용된 악기와 소프트웨어를 생산하는 매사추세츠주 월섬에 있는 Perkin Elmer Inc.의 직원입니다. 이 간행물의 내용은 반드시 미국 보건복지부, 미국 국방부, 미 육군부 또는 저자와 제휴한 기관 및 회사의 견해나 정책을 반영하는 것은 아닙니다.

보툴리눔 신경 독소와 무기화의 상대적 용이성의 높은 효능 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류 (가장 높은 우선 순위) biothreat 에이전트로서의 분류 가져왔다. 불행하게도 FDA는 독소는 운동 신경에 의해 내면화 된 후 본트 중독에 대응하기 위해 치료제를 승인하지 있습니다. 본트 중독에서 신경 세포의 회복을 촉진 모든 druggable 메커니즘이 생물학적 위협에 대한 군사 및 공공 모두를 보호하기 위해 잠재적 인 치료의 발전으로 이어질 수 있습니다. 이 글에서, 우리는 본트 / A로 치명적인 독소의 억제제를 스크리닝 자세한 HCI 분석 프로토콜을 제시한다. 이 분석의 특이한 점은 실험실 안전을 보장하기 위해 독소와 엄격한 바이오 안전성 프로토콜의 구현의 꼼꼼한 나눠입니다. 활성 독소를 사용하는 동안 극도의주의를 기울여야한다. 본트 / 메탄올 고정 및 마이크로 decontaminati를 통해 불 활성화10 % 표백제와 5 %에​​ 표면 와이프는 바이오 안전성 레벨 2 실험실 환경에서 다운 스트림 평가를 위해 바이오 안전...

박테리아 클로 스트 리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경 독소, 1 인간에게 알려진 가장 강력한 생물 독소 중 하나를 생성합니다. 7 별개의 본트 혈청 형 (본트 / AG)이 있습니다. 본트는 / A-담즙으로 인해 SNARE 복잡한 단백질 분해 2,3에 신경 근육 접합부에서 마비를 유도한다. SNARE 단백질 분해는 신경 전달 물질 소포 - 막 융합을 방지하고, 따라서 블록은 신경 전달 물질을 세포 외 유출 (4). 특정 SNARE 목표 중독 과정에 참여 본트 특정 혈청 형에 의존한다. 본트 / A 및 본트 / E 클리브 SNAP-25 본트 / C의 절단 모두 SNAP-25과 신택 5 반면. 또한 소포 관련 막 단백질 (VAMP)라고 나머지 혈청 형 절단하고 시냅 토브 레빈은 (. 본트 / A는 그것이 자연적으로 발생하는 보툴리누스 중독의 높은 비율에 대한 책임으로 분석 개발을위한 선택과 작은 분자의 작용 6. 개발의 가장 긴 기간을 가지고 있었다 본트 / A에 대한 치료제는 주요 목표이다우리의 약물 발견 및 프로그램은, 8-10은 활성 부위의 단백질 분해 효소 억제제 (7)를 식별하는 기존의 목표 기반의 방법을 이용했다. 그러나, 다수의 혈청 형과 노광 후 효능에 대해 넓은 스펙트럼의 활성을 갖는 활성 부위 억제제의 생성 가능성이 문제가 될 것이다. 따라서 우리는 본트 매개 운동 신경 중독을 차단할 수있는 작은 분자를 식별하는 기능을 엔드 포인트로 본트 SNAP-25의 절단을 사용하는 혁신적인 표현형 신약 개발 접근 방식을 구현했습니다. SNAP-25은 생체 내에서 마비와 치사의 예측이다 SNAP-25의 저하와 같은 신경 전달 물질의 방출이 필요합니다. 예를 들어, 세포 기반 스크리닝은 독소를 불 활성화 또는 표적 세포 내 독소 경로의 억제에 대한 책임 세포 요소의 새로운 변조기의 발견으로 이어질 수 있습니다. 표현형 분석 발달에 중요한 요인은 생리적으로 중요한 생물학적 모델의 선택이다. W전자 등은 SNAP-25 11 - 13의 발현을 포함한 일차 운동 신경 세포의 면역 학적 특성을 요점을 되풀이 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 유래 운동 신경을 설명했다. 중요한 것은, 이러한 셀룰러 시스템은 본트 / A 중독에 매우 민감하고 독소 11, 12의 농도 증가에 대한 응답으로 SNAP-25의 용량 의존적 분열을 보여줍니다. 차별화 운동 뉴런은 고 스루풋 플레이트 기반 분석 충분 셀룰러 분석법 어레이의 설계를 허용 양이 생산된다. 표현형 분석은 본트 / 마우스 운동 신경 문화의 중독시 내생 적으로 표현 된 전체 길이 SNAP-25의 분열을 정량화하는 두 가지 항체를 이용한 면역 형광 방법입니다. 단지 전체 길이 SNAP-25를 인식 카복실 말단 본트 / A 분열에 민감한 (BACS) 항체는 SNAP-25의 본트 / A 매개 단백질 분해의 평가를 할 수 있습니다마우스 모터의 발현은 10 뉴런. HCI 분석의 개략도는도 1에 도시된다.

<table><tbody><tr><td>보툴리눔 신경독소 A&nbsp;</td><td>Metabiologics</td><td>NA</td><td>카탈로그 번호</td></tr><tr><td>없음 Microtitre 플레이트</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Poly-D-Lysine 96-well 플레이트</td></tr><tr><td>BACs 항체</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT 미니 자동화 워크스테이션</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII tubulin 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Antimouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Clorox bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>플레이트스택</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25)는 시냅스 신경전달물질 방출에 필수적인 용해성 NSF 부착 단백질 수용체(SNARE) 복합체의 구성 요소입니다. 보툴리눔 신경독소 혈청형 A(BoNT/A)는 SNARE 복합체의 SNAP-25 성분을 절단하여 신경전달물질의 엑세포작용(exocytosis)을 차단하는 아연 금속프로테아제입니다. 현재 운동 뉴런에 의한 독소의 내재화 후 BoNT/A 중독을 치료할 수 있는 허가된 의약품은 없습니다. BoNT/A 중독에 대항하기 위한 효과적인 치료 조치의 개발은 제한적이었으며, 부분적으로는 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 강력한 고처리량 분석법이 부족하기 때문입니다. 여기에서는 BoNT/A 억제제 식별을 위한 유틸리티가 있는 HCI(High Content Imaging) 분석에 대해 설명합니다. 초기 최적화 노력은 여러 독립적인 실험에서 플레이트 간 결과의 재현성을 개선하는 데 중점을 두었습니다. 면역염색, 이미지 획득 및 이미지 분석의 자동화는 분석 일관성을 높이고 변동성을 최소화하는 동시에 쥐 운동 뉴런 시스템에서 실험 화합물의 다중 매개변수 평가를 가능하게 하는 것으로 밝혀졌습니다.

높고 낮은 컨트롤의 데이터는 3 표준 편차 (그림 7A)를 초과하는 두 중간 값의 차이가 별개의 두 집단을 만들었습니다. 선별 과정의 목적은 샘플 모집단 (도 7b, (ⅰ)) 내의 정규 분포를 가정하여, 가까이 양성 대조군 인구 값 샘플 모집단 내의 화합물을 찾는 것이다. 평균 이상 3 표준 편차이다 데이터 포인트는 소음에서 통계적으로 다른 생각과 활성 "히트"로 분류된다 (그림 7B (II), 빨간색 상자). "히트"로 분류되는 화합물은 향후 연구에서 상기 확인 시험을 실시한다. (ii) 상기 차폐 판의 대표적인 서브 세트로부터 샘플들의 집단에서 양성 히트의 검출을 도시도 7b. 보다 낮은 값을 가진 모든 4 점 (중간 샘플 - 3 * 샘플의 SD)를 소유4 가지 심사 플레이트 내에서 서로 다른 위치에서 발견 된 것과 같은 억제제. 그림 5와 같...

보툴리눔 신경독소는 A급 생물위협제 중 가장 강력한 독소 중 하나이지만, 노출 후 치료제는 이용할 수 없다. High Content Imaging 접근법은 이 독소의 주요 표적인 생물학적으로 관련된 운동 뉴런을 사용하여 다중 매개변수 스크리닝을 가능하게 하기 때문에 새로운 억제제를 식별하기 위한 강력한 방법론입니다.

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

다음 실험의 전반적인 목표는 정상적인 신경 신호 전달 중 독소 기능을 억제하는 작은 분자를 식별하기 위해 IES 보툴리눔이 기질 SNAP 25의 절단을 매개하는 표현형 선별 분석을 개발하는 것입니다. 활동 전위는 SNAP 25가 시냅스 소포를 운동 뉴런 말단의 원형질막에 결합하여 신경 전달 물질의 방출을 초래합니다. 그러나 보툴리눔 신경독이 존재하면 세포내이입에 흡수되어 시냅스 부톤에서 방출되어 SNAP 25를 절단하여 신경전달물질의 방출을 방해하여 마비를 유발합니다.이 분석법은 보툴리눔 독소 활성을 억제할 수 있는 분자를 식별하여 보툴리눔 독소가 있는 상태에서 SNAP 25 절단을 방지하여 신경근 접합부에서 신경전달물질 방출을 복원할 수 있습니다. 마우스 운동 뉴런으로 수행된 고함량 이미징 분석은 SNAP 25의 보존을 입증하는 데 사용되어 보툴리눔 신경독의 메탈로 프로테아제 활성을 억제할 수 있는 작은 분자를 식별합니다. A. 이 기술 또는 cell-free 생화학 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 스크리닝 화합물 및 독소로 처리된 운동 뉴런을 포함하는 단일 웰에서 여러 표현형 종말점을 동시에 캡처할 수 있다는 것입니다.이 방법은 세포 기반 활성 및 세포 독성의 정량화와 같은 라이브러리 스크리닝 중에 발생하는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 보툴리눔 중독 치료로 확장되는데, 이는 금속 단백질 분해 효소 활성을 직접 차단하거나 독소 흡수 처리 또는 기타 메커니즘을 차단하여 간접적으로 작용하는 억제제를 식별할 수 있기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 SNAP 25 검출에 필요한 면역염색 조건의 최적화가 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 면역염색 단계는 주위의 모터가 다소 섬세하기 때문에 완벽하기 어렵기 때문입니다. 스탠딩 및 세척 단계는 다운스트림 분석에 필요한 고품질 이미지를 개발하기 위한 핵심입니다. 살아있는 세포와 활성 독소를 활용하는 모든 연구는 생물 안전 레벨 2 조건에서 수행되며, 마이크로 켐 용액과 같은 5% 세제 소독제 세척제로 이러한 실험 전후에 작업 영역의 오염을 제거합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 배아 줄기세포를 운동 뉴런으로 분화한 후 12채널 수동 피펫을 사용하여 기존 배지를 교체합니다. 80마이크로리터의 새로운 말단 분화 매체가 있는 96개의 웰 플레이트에서 흡입 및 분주 단계를 행별로 수행하여 셀이 주변 공기에 노출되는 것을 최소화합니다. 다음으로, 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 10 x 테스트 화합물 10마이크로리터를 추가한 다음 x를 혼합하기 위해 두 번 흡인합니다.6개의 웰로 구성된 2개의 열을 매체에 희석된 10 X-D-M-S-O로 처리하여 높은 신호 및 낮은 신호 제어 역할을 합니다. 섭씨 7도에서 30분 동안 화합물로 세포를 배양하고 이산화탄소를 6%로 배양합니다. 다음으로, 다채널 피펫을 사용하여 최종 10 X 작업 스톡을 생성하기 위해 PBS에서 보툴리눔 신경독소 A를 희석하고, 10 x 보툴리눔 신경독소 스톡의 10마이크로리터를 처리를 위해 지정된 웰과 낮은 신호 제어 웰에 추가합니다.고위험군으로 지정된 우물을 매체만으로 처리하고, 보툴리눔 신경독소와 접촉하는 모든 플라스틱 마모 및 기타 일회용품의 오염을 제거합니다. A: 0.825%차아염소산염 용액에 최소 20분 동안 물에 담그십시오. 독소 사용을 나타내기 위해 플레이트에 명확하게 라벨을 붙이고 배양 후 섭씨 37도에서 6%의 이산화탄소에서 4시간 동안 플레이트를 배양합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 독소와 화합물이 포함된 매체를 제거하고 10% 표백제 용액에 넣어 폐기합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 각 웰에 직접 첨가하여 보툴리눔 신경독을 막습니다. 단백질 분해 분열.다음으로, 고정이 일어날 수 있도록 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 고정 후, 폐기된 중화 시약은 생물 안전성 레벨 1 프로토콜에 따라 처리하고 그에 따라 폐기합니다. 메탄올을 버린 후 100마이크로리터의 PBS로 세포를 세 번 세척하여 면역 염색 전에 재수화합니다.클래스 2 생물 안전성 작업대에서 수행되는 면역 염색은 필요에 따라 사람의 개입 없이 시약에 접근할 수 있도록 배치된 자동화된 워크스테이션을 사용하여 수행됩니다. 고정 셀이 포함된 플레이트를 PLATE 매거진에 로드하고 액체 취급 작업에 필요한 경우 데크로 옮깁니다. 워크스테이션은 250마이크로리터 팁이 장착된 96 피펫 헤드를 사용하여 웰에서 10마이크로리터까지 PBS를 흡입합니다.워크스테이션은 PBS에서 1%horse 혈청과 0.1%tween 20을 포함하는 100마이크로리터의 차단 버퍼를 모든 마이크로 플레이트에 분배합니다. 그런 다음 플레이트를 플레이트 매거진에 다시 넣어 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 차단 완충액을 제거하고 BS 항체 밀리리터당 4마이크로그램 50마이크로리터와 블로킹 버퍼인 베타 3 튜불린 밀리리터당 0.5마이크로그램을 모든 플레이트에 분배합니다.플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 1차 항체를 제거하고 100마이크로리터의 PBST로 3회 세척합니다. 밀리리터당 2마이크로그램을 준비하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다른 플루오로 4로 라벨링된 2차 항체의 희석액을 준비합니다. 혼합물 50마이크로리터를 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후 2차 항체를 흡인하고 100마이크로리터의 PBST로 3회 세척합니다.다음으로, 32 마이크로몰 후크를 포함하는 100마이크로리터의 PBS에서 핵 검출을 위해 DNA를 염색하기 위해 염료를 주입합니다. 마지막으로 광표백으로부터 플루오로 4층을 보호하기 위해 가벼운 불투과성 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트는 심각한 신호 손실 없이 몇 주 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.이미지 획득 시스템에서 플레이트 유형을 grinder u로 지정합니다. 레이아웃을 96으로 지웁니다. 필드 수를 16으로, 대물렌즈를 20 x water로 형식을 지정합니다.그런 다음 405나노미터의 핵 여기를 위한 채널을 선택합니다. 640 나노미터의 세포질 여기를 위해 채널 4를 선택합니다. 561나노미터의 항원 특이적 항체 채널 여기를 위해 채널 2를 선택하고 채널 3을 선택합니다.다음으로 각 레이저의 여기 파워를 설정합니다. 이 실험은 640나노미터에서 1:1 여기(1:1 excitation)를 설정하는 두 가지 노출과 405 나노미터 및 561 나노미터에서 2-2 여기(excitation)를 설정합니다. Benning을 빈 2로 선택합니다.최대 강도로 노출 최적화를 위해 SNAP 25 채널로 높은 제어 웰을 사용하고 최소 강도를 위해 낮은 제어 웰을 사용합니다. 각 채널의 강도가 채도 레벨의 약 절반 또는 약 2000에서 2, 500 상대 단위가 되도록 노출을 조정합니다. 다음으로, 델타 보정 스크립트를 사용하여 셀 마스크 채널에서 최적의 Z 평면을 식별합니다.이미지 분석 소프트웨어에서 신경돌기 알고리즘을 선택하여 신경돌기를 분할합니다. beta three tubulin channel의 마이너스 3 픽셀 확장을 마스크로 사용하여 2차 물체인 신경돌기를 기반으로 신경돌기 영역을 식별합니다. 신경돌기 영역과 베타 3 튜불린 채널에 대한 신호 채널의 강도를 계산합니다.신경돌기 길이, SNAP 25 베타 3의 평균 강도, 튜불린 핵 수 및 신경돌기 세그먼트 수와 같은 내보내기를 위해 원하는 매개변수를 선택합니다. 설정이 완료되었습니다. 로봇을 사용하여 플레이트 스태커에서 플레이트를 옮기고 High Content Imager에 로드한 다음 이미지 획득을 시작합니다.여기에 표시된 것은 제어 웰에서 계산된 분할 비율의 상자 그림 분석입니다. 분홍색은 매체만 있고 독소가 없는 우물인 높은 신호 제어를 나타냅니다. 이 우물에서는 분열이 거의 관찰되지 않습니다.파란색은 낮은 신호 제어, 즉 독소만 있고 샘플 화합물이 없는 우물을 나타냅니다. 이 우물은 상당한 분열을 기록했습니다. 제어 값의 이러한 히스토그램 분포는 두 제어 모집단 사이의 거리를 보여줍니다.스크리닝 프로세스의 목표는 표본 모집단 내에서 positive control 모집단에 더 가까운 값을 가진 화합물을 찾는 것입니다. 보툴리눔 신경독 A를 함유한 192개의 복합 처리된 샘플의 분포는 여기에 녹색으로 표시되어 있습니다. 이 우물의 대부분은 상당한 분열을 보였습니다.그러나 대조군과 비교했을 때 유의미한 분열이 없는 통계적으로 유의한 몇 가지 이상치가 있었습니다. 제어 값은 이 히스토그램 분포에서 분홍색과 파란색 막대로 다시 표시됩니다. 녹색 막대는 표본 값과 대조 값의 겹침을 보여주었습니다.hits로 간주되는 표본 값은 표본 모집단의 중앙값에서 3 표준 편차보다 낮은 분열 비율 값을 가진 이상치에서 선택되었습니다. 이 4개의 히트는 높은 신호 제어와 유사한 값을 가지며 SNAP 25 절단을 차단하는 synanon에 대한 억제제로 알려진 보툴리눔 신경독소인 동일한 화합물을 나타냅니다. 이 억제제는 보툴리눔 신경독소 A에 대한 강력한 SNAP 25 보호를 입증했으며, 독소와 이 억제제는 모두 독소가 없는 웰과 유사하게 작용하고 독소가 있는 웰과 유사하지 않게 작용했지만, 억제제가 없었습니다.이 기술은 적절하게 수행되면 4-6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 에세이의 통계적 성과를 계산하고 각 개별 선별 플레이트에 대해 합격 불합격 결정을 가능하게 하기 위해 여러 컨트롤을 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 생화학적 단백질 분해 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 Bot의 직접 또는 간접 억제제로서의 스크리닝 히트 평가와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 면역 염색을 통한 SNAP 25의 정량화를 1차 종점으로 사용하는 표현형 스크리닝 분석을 자동화하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다. 보툴리눔 신경독소를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 말아야 하며, 개인 보호 장비를 사용하고 보틴에 대한 적절한 오염 제거 및 폐기 절차를 시행하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이 절차를 수행하는 동안 항상 신경독을 복용해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

보툴리눔 신경독소 A형 경쇄(BoNT/A LC)는 운동 뉴런에 들어가 기질 SNAP-25를 절단하고 신경 전달을 방해하여 이완 마비를 일으키는 금속프로테아제입니다. 고처리량 호환 FRET 기반 분석을 활용하여 작은 분자의 대규모 라이브러리를 BoNT/A LC 효소 활성에 미치는 영향을 스크리닝할 수 있습니다.

Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators의 식별 및 특성화를 위한 고처리량 호환 FRET 기반 플랫폼

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

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배우세요 보툴리눔 신경독 억제제를 식별하기 위한 고내용 이미징 분석법을. 마우스 운동신경원을 이용한 이 표현형 스크리닝은 SNAP 25 절단을 방지하고 신경전달물질 방출을 회복시키는 분자를 찾아내어 신경독 중독 치료제 개발에 활용됩니다.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

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