Name: 문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 학습하세요 양적 형광 웨스턴 블로팅을 사용하여 다양한 생물학적 샘플에서 단백질을 정확하게 정량화하는 방법을. 전기영동, 반건식 전이, 형광 항체 프로빙을 포함하는 이 기법은 민감하고 재현 가능한 단백질 분석을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 덕분에 금융 지원을 위해 다음과 같은 것이다 : BBSRC 연구소 전략 프로그램 기금 - CF 및 TMW을; BBSRC 동부 바이오 DTP 자금 - LG; 에딘버러의 다윈 신뢰 - MLH. 우리는 또한이 원고의 TREM2 최적화를 포함 할 수있는 권한에 대한 박사 배리 맥콜에게 감사의 말씀을 전합니다.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Protein+Protocols+on+CD-ROM%22">Protein Protocols on CD-ROM</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457(2013).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li>
<li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li>
<li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li>
<li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75%2FMortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95(2013).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+%CE%B2-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GalR1%2C+but+not+GalR2+or+GalR3%2C+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li>
<li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proceed+Online%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+%28Wlds%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

등을 고려해서 계획은 실험에 앞서 필수적이며 궁극적으로 사용 된 기술의 성공 여부를 확인할 수 있습니다. 적절한 항체, 전송 및 시각화 방법을 사용하기로 선택하려고 할 때 잠재적 인 장애물의 과다를 제공 할 수 WB를 사용하여 단백질 검출 발전. 다행히, 단백질의 존재와 샘플 사이 점점 더 미묘한 표현의 차이를 결정하기 위해 일상적으로 사용할 수있는 QFWB주의 깊게 점검하고 적절한 통제 수단을 사용. 이 프로토콜은 방지 및 / 또는 그와 관련된 많은 일반적인 함정 중 일부를 극복하기 위해 형광 양적 서부 모래 바닥뿐만 아니라 몇 가지 문제 해결 전략에 포괄적 인 가이드를 제공합니다. 감도를 유지하고 획득하기 위해 사용되는 중요한 단계는 진정으로 정량화 및 비교 측정은 다음과 같습니다 : 조직 샘플에서 1) 강력한 단백질 추출; 2) 샘플 준비; 3) 정확한 단백질 loading는 총 단백질 분석에 의해 측정; I-의 얼룩을 사용하여 단백질의 4) 최적의 전송; 열전달 및 관련 소프트웨어를 사용하여 0.1 % 트윈 20을 포함하는 버퍼를 차단하는 일차 및 이차 항체의 5) 준비, 6) 올바른 시각화 및 분석. 적외선 형광 검출은 진정으로 정량적이고 전통적인 ECL 검출 기법 3,11에 비해 민감도를 제공한다. 이 검출 시스템은 여러면 처리이며, 같은 QFWB에 한정되지 않는다. 이 시스템은 전체 조직 절편 (12)의 시각화 및 정량화를 허용 저전력 면역 조직 라벨링 촬상 할 수있다. 이 정량적 평가의 측면에서 기존의 현미경과 기존의 면역 캡처 필적까지 빨간색 영상을 볼 수 있었다 해상도의 측면에서 잠재적 인 미래 개발의 한 영역이다. 그러나, P의 미묘한 변화에 대한 민감도와최소 제어 조치를 유지 표현이 변동성을 보장하기 위해 매우 중요합니다 rotein하는 강력한 프로토콜과 엄격한이다. 이 샘플 로딩이 균일 검색이 현실과 관련하여 제조업체의 지침을 테스트하는 것은 전송하는 것입니다 여부를 결정하기 위해 기본 및 보조 항체의 최적화임을 보증을 제공하기 위해 총 단백질 스테인드 젤의 생산 다음에 조직 샘플에서 엄격한 단백질 추출로 시작 시간 효율적인 단백질 전달을 얻었다. 그럼에도 불구하고, WB의 조건이 최적화되는 경우에도, 여전히 문제가 완전히 여기에 탐험되지 않았을 수 있습니다 서부 실행과 관련이있다. 이들은 다음을 포함하지만, 단백질의 가용화 및 추출 완충액의 선택 등 다양한 요인에 한정되지 않는다. 일부 버퍼 단백질 농도 분석을 방해 할 수 있지만, 몇몇 조직은 자동화 macera의 사용으로 더 강력한 기술을 필요로 용해하는 것이 특히 어렵다팅은 맥의 dissociator과 함께 M 튜브 등의 용기를 밀봉. 또한, -80 ° C에서 추출 및 비 추출 된 물질의 저장을위한 간단한 제어 조치를 즉시 추출 후 최적의 라벨을 획득하고 가난한 결과 주 후 가진 사이의 차이가 될 수 있습니다. 현대 QFWB 방법은 단백질 발현에 미묘한 차이를 캡처 더 민감한 것으로 입증 및 ECL 같은 이전의 기술과 비교했을 때 더 융통성 동시 듀얼 라벨 3을 허용한다. 그것은 서양 블로 팅 프로토콜이 강력하고 정확한 정량 및 통계 분석을 위해 쉽게 반복적 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 서로 다른 조직 샘플 종 (3)의 종류에 걸쳐 단백질의 검출을 위해 일상적으로 사용하기에 민감하고 강력한 충분히 따라서 실험 1 당 소비 사용량뿐만 아니라 시간을 감소 동일한 QFWB 내 로우 및 하이 풍부 단백질의 정량화를 허용. 9,14 그러나 정확성함으로써 잘못된 데이터 수집을 방지하기 위해 준수해야 중요하고 적절한 통제 조치의 포함이다 오믹 연구 - (1) 또한,이 기술의 증가 감도는 점점 더 인기를 검증 할 수 있습니다.

웨스턴 블롯 (WB)는 원래 같은 조직 파쇄 한 바와 같이, 복잡한 생물학적 샘플에서 목적 단백질의 존재 여부를 결정하기 위해 1970 년대 후반에 개발 된 분석 기술이다. 일반적으로 인해 키 항체 - 항원 상호 작용, 단백질 면역라고, 방법론은 5 별개의 단계로 구성되어 자신의 등전점에 의한 단백질의 1) 전기 영동 분리; 2) 니트로 셀룰로오스 또는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인로 전송; 3) 관심 단백질에 특이 차 항체를 사용하여 라벨링; 차 항체에 대항 차 항체 4) 배양; 5) 시각화. 시각화 방법론은 안전과 감도를 개선하기 위해 시간이 진화하고있다. 첫 번째 WBS의 일부는 더 널리 사용 chemilluminescent (ECL) 방법 색채와에 진행 라디오 라벨 태그를 사용하여 수행되었다. Radioactivi비색과 ECL 방법은 알칼리 포스 파타 아제 또는 스트렙 타비 딘 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 2 등의 효소 기자와 간접 라벨링 기술을 사용하는 반면 타이 직접 특정 항원에 대한 프로브에 표지 하였다. 크로마 또는 발광 제품 라벨의 강도가 강하거나 약한 신호 강도는, 샘플에 관심 단백질의 다소간 존재를 나타내고있다 농도계를 사용하여 측정한다. ECL은 더욱 민감하고, 따라서이 방법론 선호되지만 3 방법은 초기에이어서 3 확립보다 정교한 디지털 이미징 기술로 엑스레이 필름이 개발되었다. WB의 디지털 이미징의 발전뿐만 아니라 그들의 관심 단백질의 존재 여부를 결정하기 위해 연구를 허용하지만, 다른 샘플과 비교할 때, 또한 선택된 단백질의 발현 수준에 대한 추론을 허용하고, 따라서로 지칭 될 수있다 &quot;반 정량적 &amp; #8221 ;. 측정 된 형광의 레벨을 직접 시료 내의 수량 및 단일 단백질의 발현과 관련된다 최근 진정한 정량적 더 민감 웨스턴 블럿 기술이 개발되었다 : 정량적 (QFWB) 웨스턴 블로 팅 형광등. ECL 표지와 QFWB를 비교하면, 형광 이차 항체의 사용은 선형 검출 프로파일 (4)를 생성한다. 이것은 신호 선형성 일반적 도처 발현 하우스 키핑 유전자 5,6로, 즉, 직접 단백질 발현과 관련된 5 μg의 신호 포화 아래 낮은 단백질 부하 발생 ECL 기법 대조적이다. 이 불균형은 대부분 전위 신호 포화의 높은 가능성의 결과로, 보조 바이오틴에 결합하는 아비딘 ECL 기판에 사용할 결합 부위의 수에 의해 크게 유발된다. 이것은 같은 ONL 지칭되는 ECL베이스 면역의 주된 이유 중 하나이다Y &quot;반 정량적&quot;7. 발현 수준에서의 미묘한 차이를 측정하고 측정에 부정확을 초래할 수있는 경우 신호의 포화 점은 매우 중요하다. 최근 몇 년 동안 계속 증가하는 민감도와 미묘한 표현 차이의 식별을 자세히 널리 프로테오믹스 기술의 출현은 검증 실험 8,9에 대한 진정한 양적 웨스턴 블로 팅에 계속 증가하는 의존 가져왔다. 민감한 강력한 진정 정량적 방법론의 적용은 따라서 중요하다. 많은 &quot;최적화&quot;서양 블롯 방법은 자주 인해 공식적인 문서화 된 프로토콜에서 쉽게 보이지는 미묘한 방법론 조정을 설정하거나 복제하기 어려울 독립적 인 실험실에 의해 이용되어왔다. 이 QFWB에 설립하고 강력한 프로토콜이며 추가로 일반적인 문제 그쪽으로 문제 해결을위한 유용한 전략을 제공합니다T 구현시 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원래 쥐의 뇌 균질 물과 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만, 이후 조직 샘플과 종 4,9,10의 넓은 범위에 걸쳐 효과적으로 사용되어왔다. 특정 문제를 해결하기 위해 필요한 잠재적 인 프로토콜의 변화가 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RIPA 완충기</td><td>피셔 사이언티픽 UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M 튜브</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, 영국</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>웨스턴 블로팅을 위한 젤 1에서 사용</td></tr><tr><td>SeeBlue Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>젤에 사용 2 총 단백질 염색 젤</td></tr><tr><td>NuPAge LDS 샘플 버퍼 4x</td><td>Life Technologies, 영국</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer(Bis-Tris 젤 전용) (20x)</td><td>Life Technologies, 영국</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 젤 1.0mm, 12</td>웰 <td>Life Technologies, 영국</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Sigma-Aldrich, 영국</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, 단백질 분석 키트</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 차단 버퍼</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 염소 안티-토끼 IgG (H+L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Donkey 안티-마우스 IgG (H+L), 0.5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 염소 항 토끼 IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 당나귀 항 염소 IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL 적외선 이미저</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>견적 요청</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blotting System</td><td>Life technologies, UK</td><td></td><td>이 모델은 더 이상 생산되지 않습니다</td></tr><tr><td>. InstantBlue 단백질 염색</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼&nbsp;</td><td>록랜드 이뮤노케미컬 Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

1970 년대 말은 웨스턴 블롯, 존재와 복잡한 생체 시료 내 특정 단백질의 상대적인 풍요 로움을 평가하는 기술의 첫 번째 공식보고 사용을 보았다. 그 이후로, 웨스턴 블로 팅 방법은 분자 생물학 실험적인 레퍼토리의 공통 요소가있다. 용어는 &quot;웨스턴 블롯&quot;을 사용하여 PubMed에의 피상적 검색 이십이만 출판 원고를 초과 중요한 것은 2014 년에이 기술의 사용을 만든 것을 제안, 지난 10 년은 개발과 함께 기술 이미징의 발전을 보았다 감도 개선 및 선형 검출 더 큰 범위를 산출 한 민감한 형광 라벨. 결과는 생물 학자들이 이전보다 민감도와 정확도를 비교 발현 분석을 수행 할 수 있습니다 웨스턴 블롯 (Western Blot) (QFWB)을 기반으로 지금 진정으로 계량화 형광입니다. 많은 &quot;최적화&quot;서양 블롯방법론이 존재하고 서로 다른 실험실에서 사용된다. 이들은 종종 인해 미묘하지만 문서화되지 않은 절차 개정의 요구에 구현하기 어려울. 이 프로토콜은 문제 해결 전략을 완성 설립하고 강력한 QFWB 방법의 포괄적 인 설명을 제공합니다.

QFWB 감도 및 검출의 선형 범위를 기존의 ECL 검출보다 큰으로하여 효율적인 해석을 돕는 정확한 데이터가 수집되는 것을 보장하기 위해 매우 중요하다 통제 조치의 숫자가 있습니다. 첫째로, 양성 대조군 샘플의 포함은도 1에 도시 된 바와 같이. 둘째, 전송 최적화 멤브레인 겔로부터 고 분자량 및 저 분자량 단백질의 상응하는 이동을 보장하기 위하여도 2에 나타나는 바와 같이. 셋째, 항체의 최적화, 특히 이차 그 최적화 종종 간과되지만, 항체는 관심 단백질 (들)의 정확한 해석을 방해 할 밴딩 비특이적 생산할 수있다. 도 3 참조. 넷째, 또한 수있다 경우 단백질이 검출되지 나타나지만 존재할 것으로 예상되는 경우, 이는 단순히 보조 RAIS를 사용하여 보정 될 수 이차 항체 문제가 될 수 있다는다른 종의 호스트에 에드. 도 4를 참조. 다섯째, 총 단백질 라벨 및 분석 도처 내부 참조 표준 3 표현 전통적인 단일 단백질 (들)의 사용에 비해 훨씬 더 견고하고 정량화 방법이다. 이러한 단일 단백질의 대부분은 차동 퇴행성 신경 질환의 모델 간에는 물론 다른 조직 샘플에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 표현의 균일 성이 동일한 조직 내 3 변경할 수있다. 표준 오차를 나타내는 비교하고, 각 샘플에 대해 측정 된 다양한 분자량 범위에서 각 레인에서 단백질 부하를 정량함으로써 총 단백질 분석과 결합 될 때,도 6에서 입증 된 바와 같이 따라서로드 제어 겔의 제조는 시료 하중의 균일 성을 확인한다 . 중요한 것은, 이러한 문제 해결 기술 및 모든 컨트롤 만 분석 t의 민감도 일관성만큼 효과적운영자 (그림 5)에 의해 적용 ools. 마지막으로이 기술은 스트리핑과 같은 요인을 포함하지만 장기간 저장 조건 하에서 감도 증가, 감소 된 배경, 이중 색상 검출 및 막 안정성에 한정되지으로 ECL보다 더 유연성을 가진 멤브레인의 재 프로빙라는 것으로. 그림 7을 참조하십시오.

형광을 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)의 발전으로 단백질 발현의 미묘한 변화를 감지할 수 있게 되어 정량 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다양한 종과 조직 유형에 걸쳐 다양한 단백질을 검출하기 위한 강력한 방법론에 대해 설명합니다. 일반적인 기술 문제를 극복하기 위한 전략도 제공됩니다.

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

이 절차의 목표는 정량적, 형광 트위스트 및 블로팅을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내에서 특정 단백질의 상대적 풍부도를 검출하고 정확하게 정량화하는 것입니다. 이는 프리캐스트 그라디언트 겔을 사용하여 단백질 추출물을 최초로 전기형광으로 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 총 단백질 염색을 통해 모든 시료 레인에서 등가 단백질 부하를 확인한 다음 eye block semi-dry fast transfer system을 사용하여 시료를 A-P-V-D-F 멤브레인으로 전송합니다.마지막으로, 단백질은 특정 1차 항체로 프로브된 후 적절한 형광 표지된 2차 항체로 프로브되어 적외선 및 원적외선 파장에서 민감하고 강력한 선형 검출을 용이하게 합니다. 궁극적으로, 정량적 형광 서부 꽃은 광범위한 조직 샘플에서 많은 수의 막 결합 및 용해성 단백질을 재현성 있게 검출, 시각화 및 정확하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. ECL 기반 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 조직 샘플을 수동으로 침식하는 것으로 시작한 다음 부드럽고 일관된 균질화가 생성될 때까지 버퍼 부피당 약 1-10 조직 중량으로 새로 준비된 추출 버퍼에서 균질화하는 진정한 정량적 판독을 위해 광범위한 선형 스케일에서 향상된 정밀도로 더 높은 감도를 얻을 수 있다는 것입니다.다음으로, 20, 4 섭씨 온도에 G 20 분 동안 세포 용해물을 원심 분리하십시오. 그런 다음 용해된 단백질을 포함하는 sate를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿과 S 상등액 분획을 모두 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. supinate의 단백질 농도를 측정한 후 샘플당 15마이크로그램의 단백질을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 각 샘플의 최종 부피를 증류수로 최대 10마이크로리터까지 가져오고 5마이크로리터의 Forex 로딩 버퍼를 추가합니다. 와류로 세포 용액을 철저히 교반한 다음 샘플을 섭씨 98도에서 2분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 변성 후, 적절한 분자량 표준의 3 마이크로 리터를 실험 및 로딩 제어 젤 각각의 첫 번째 웰에 첨가합니다.그 후, 각 샘플 10마이크로리터를 전기영동 후 적절한 후속 웰에 로드합니다. 젤 나이프를 사용하여 카세트에서 젤을 분리하고 젤의 웰과 발을 제거합니다. 나중에 방향을 잡을 수 있도록 젤을 표시하십시오.그런 다음 등가 단백질 로드 디캔트를 결정하기 위해 약 30ml의 단백질 염색을 정사각형 12 x 12cm 페트리 접시에 넣고 로딩 제어 젤을 염색에 넣어 용액이 전체 젤을 덮도록 합니다. 실온에서 최소 1시간 동안 젤을 부드럽게 저어준 다음 단백질 얼룩을 버리고 아이 블록을 시각화하기 전에 증류수로 젤을 세 번 세척합니다. 2개의 반건조 빠른 단백질 전달 전기영동 후, 호일 덮개를 제거하고 겔 탱크에서 직접 러닝 버퍼로 멤브레인을 미리 적셔 바닥 전달 스택을 준비합니다.이때도 여과지를 증류수로 다시 적십니다. 다음으로, 준비된 하단 전사 스택에 실험용 젤을 끈으로 묶은 다음 사전 작업 여과지를 젤 위에 놓고 둘 다 굴려 층 사이에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 여과지와 하단 스택 위에 상단 스택을 놓습니다.그런 다음 전사 스택 샌드위치를 굴려 기포를 제거합니다. 전사 스택 키트의 스폰지를 흡수 패드에 삽입하고 전사 스택 샌드위치를 전용 공간에 놓습니다. 그런 다음 뚜껑을 단단히 닫고 I 블록 2를 시작하여 프로그램 3에서 7분 동안 단백질을 전달합니다.프로그램이 완료되면 아이 블록 기계에서 전사 스택을 제거하고 상단 전사 스택과 여과지 층을 벗겨내어 하단 전사 스택의 젤을 노출시킵니다. 전달 효율성 단백질 얼룩을 검사하기 위하여 막 트리밍에 따라 막에 오리엔테이션 목적을 위한 삼각형 커트를 만들기 위하여 주의하는 젤의 주위를 자르기 위하여 메스를 사용하고, 다만 설명되는 것과 같이 젤은, 그 후에 3개의 첫번째를 위한 PBS의 5 밀리리터를 포함하는 청결한 50 밀리리터 관으로 막을 신속하게 이동했습니다, 기계식 롤러로 5분 세척. 세 번째 세척 후 세척 버퍼를 버리고 실온에서 최소 30분 동안 희석되지 않은 차단 버퍼에 멤브레인을 배양합니다.다음으로, 5ml의 차단 완충액과 0.1 ml로 희석된 1차 항체에 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 1차 항체 용액을 버린 후, 방금 시연한 것처럼 PBS에서 5분 동안 멤브레인을 6번 세척합니다. 그런 다음 형광 태그가 붙은 2차 항체로 어둠 속에서 멤브레인을 배양하고, 5ml의 차단 완충액과 0.1%에서 지속적인 교반으로 20 사이에 팽창시킨 다음, 모든 이미징에 대해 6번의 5분 PBS 세척을 수행합니다.먼저 컴퓨터와 이미저에 로그인합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 열어 서쪽 얼룩을 이미지화합니다. 먼저 이미저의 뚜껑을 열고 소량의 PBS를 유리에 붓습니다.이미저의 왼쪽 하단 모서리에서 멤브레인을 PBS 위에 놓고 이미저의 축과 정사각형이 되고 멤브레인과 그리드 축 사이에 1cm의 간격이 남도록 합니다. 멤브레인을 굴려 유리와 멤브레인 사이에 기포가 갇히지 않도록 한 다음 x축과 y축에서 멤브레인이 차지하는 사각형 수를 계산합니다. 그런 다음 이미저의 덮개를 닫고 컴퓨터 소프트웨어에 사각형 수를 입력합니다.적절한 적외선 채널과 적절한 강도를 선택하고 스캔을 시작하여 로딩 제어 겔의 총 단백질 염색을 시각화합니다. 실험용 멤브레인에 대해 방금 설명한 대로 젤과 이미저를 수리한 다음 700 채널을 선택합니다. 강도를 5로 설정하고 스캔을 시작합니다.스캐닝 데이터를 정량화합니다. 최상의 이미지 품질을 생성하기 위해 스캔한 파일의 밝기 및 대비 버튼을 조정하고 원하는 방향을 얻는 데 필요한 이미지를 회전하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 모양 메뉴에서 사각형을 선택하고 이를 사용하여 전체 차선 주위에 사각형을 그립니다.샘플 레인 1에서. 레인 1 주위의 셰이프를 복사하여 붙여넣어 레인 2를 샘플링합니다. 배경 측정이 다음 레인에 신호를 통합하지 않는지 확인한 후 나머지 샘플 레인에 대해 각 레인 주위에 직사각형을 그립니다.그런 다음, 임의의 형광 단위로 그려진 각 사각형에 대한 형상 테이블의 신호를 표시하고 이미지를 tiff 담즙으로 저장합니다. 정량적 형광 웨스턴 블로팅(Western blotting) 중에 정확한 데이터를 수집하기 위해 중요한 여러 가지 제어 조치가 있습니다. 예를 들어, 양성 대조군 샘플을 포함하는 것이 바람직합니다.둘째, 겔에서 멤브레인까지 고분자량 및 저분자량 단백질의 등가 이동을 보장하기 위해 전달 시간을 최적화하는 것이 중요합니다. 셋째, 이러한 이미지에 나타난 바와 같이 비특이적 밴딩(banding)으로 인한 관심 단백질의 잘못된 해석을 피하기 위해 적절한 1차 및 2차 항체 희석을 결정해야 합니다. 넷째, 특히 예상되는 단백질 띠가 검출되지 않는 경우 다른 숙주 종에서 생성된 2차 항체가 필요할 수 있는지 여부를 고려하는 것이 중요합니다.다섯째, 로딩 제어 겔의 생산은 샘플 하중의 균일성을 확인할 수 있습니다. 총 단백질 분석과 결합하면 겔을 사용하여 각 샘플에 대해 측정된 다양한 분자량 범위에서 각 레인의 단백질 부하를 비교하고 정량화할 수 있습니다. 마지막으로, 이 기술은 감도 증가, 배경 감소, 이중 색상 감지 및 장기 보관 조건에서의 멤브레인 안정성을 포함하되 이에 국한되지 않는 요인으로 인해 kemi 발광보다 더 유연하게 멤브레인을 스트리핑 및 재프로빙하는 데 적합합니다.이 동영상을 시청한 후에는 정량적 형광 웨스턴 플로팅을 사용하여 관심 단백질을 검출하고 정확하게 정량화하는 방법과 이 기술을 수행할 때 발생할 수 있는 일반적인 문제를 해결하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

이 비디오는 면역침전된 용해물의 화학발광 기반 서부 블로팅에 대해 설명합니다. 이 기술은 단백질 처리 및 활성화를 결정하는 데 도움이 됩니다. 감지된 화학발광 신호는 활성화 중 단백질 처리 수준에 비례합니다.

단백질 가공을 위한 화학발광 웨스턴 블롯 분석

V3 워크플로우는 얼룩이 없는 젤을 사용한 웨스턴 블롯 시술입니다. 얼룩없는 기술은 연구원이 단백질 분리 품질을 시각화하고, 전달 효율을 검증하며, 가장 중요한 것은 신뢰할 수있는 적단백질 정량화를 사용하여 관심있는 단백질의 변화를 검증 할 수 있게합니다.

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 - 트리스 겔 시스템을 이용한다.

타운 웨스턴 가장 빠른 : 클래식 웨스턴 블롯 분석에 현대 트위스트

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

초고속 서양 블로팅 기술은 면역 반응 강화 제와 함께 순환 배수 및 보충 (CDR) 기술을 통해 결합하는 항원 항체의 운동성을 개선하여 개발됩니다.

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

Luminex Corporation의 xMAP의 microsphere 기술을 사용, 우리는 다양한 실험실 동물 종의 serosurveillance에 대한 다중 Fluorometric 면역 분석법 (MFIA)를 개발했습니다. MFIA는 항원, 조직 제어 또는 면역 글로불린이 covalently 색으로 구분되는 폴리스티렌 마이크로에 연결되어 정지 microarray입니다. MFIA 테스트 방법뿐만 아니라 다양한 문제 해결 항목은 해결됩니다.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

학습하세요 양적 형광 웨스턴 블로팅을 사용하여 다양한 생물학적 샘플에서 단백질을 정확하게 정량화하는 방법을. 전기영동, 반건식 전이, 형광 항체 프로빙을 포함하는 이 기법은 민감하고 재현 가능한 단백질 분석을 제공합니다.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

더 많은 동영상 탐색