문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

이 절차의 목표는 정량적, 형광 트위스트 및 블로팅을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내에서 특정 단백질의 상대적 풍부도를 검출하고 정확하게 정량화하는 것입니다. 이는 프리캐스트 그라디언트 겔을 사용하여 단백질 추출물을 최초로 전기형광으로 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 총 단백질 염색을 통해 모든 시료 레인에서 등가 단백질 부하를 확인한 다음 eye block semi-dry fast transfer system을 사용하여 시료를 A-P-V-D-F 멤브레인으로 전송합니다.

마지막으로, 단백질은 특정 1차 항체로 프로브된 후 적절한 형광 표지된 2차 항체로 프로브되어 적외선 및 원적외선 파장에서 민감하고 강력한 선형 검출을 용이하게 합니다. 궁극적으로, 정량적 형광 서부 꽃은 광범위한 조직 샘플에서 많은 수의 막 결합 및 용해성 단백질을 재현성 있게 검출, 시각화 및 정확하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. ECL 기반 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 조직 샘플을 수동으로 침식하는 것으로 시작한 다음 부드럽고 일관된 균질화가 생성될 때까지 버퍼 부피당 약 1-10 조직 중량으로 새로 준비된 추출 버퍼에서 균질화하는 진정한 정량적 판독을 위해 광범위한 선형 스케일에서 향상된 정밀도로 더 높은 감도를 얻을 수 있다는 것입니다.

다음으로, 20, 4 섭씨 온도에 G 20 분 동안 세포 용해물을 원심 분리하십시오. 그런 다음 용해된 단백질을 포함하는 sate를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿과 S 상등액 분획을 모두 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. supinate의 단백질 농도를 측정한 후 샘플당 15마이크로그램의 단백질을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 각 샘플의 최종 부피를 증류수로 최대 10마이크로리터까지 가져오고 5마이크로리터의 Forex 로딩 버퍼를 추가합니다. 와류로 세포 용액을 철저히 교반한 다음 샘플을 섭씨 98도에서 2분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 변성 후, 적절한 분자량 표준의 3 마이크로 리터를 실험 및 로딩 제어 젤 각각의 첫 번째 웰에 첨가합니다.

그 후, 각 샘플 10마이크로리터를 전기영동 후 적절한 후속 웰에 로드합니다. 젤 나이프를 사용하여 카세트에서 젤을 분리하고 젤의 웰과 발을 제거합니다. 나중에 방향을 잡을 수 있도록 젤을 표시하십시오.

그런 다음 등가 단백질 로드 디캔트를 결정하기 위해 약 30ml의 단백질 염색을 정사각형 12 x 12cm 페트리 접시에 넣고 로딩 제어 젤을 염색에 넣어 용액이 전체 젤을 덮도록 합니다. 실온에서 최소 1시간 동안 젤을 부드럽게 저어준 다음 단백질 얼룩을 버리고 아이 블록을 시각화하기 전에 증류수로 젤을 세 번 세척합니다. 2개의 반건조 빠른 단백질 전달 전기영동 후, 호일 덮개를 제거하고 겔 탱크에서 직접 러닝 버퍼로 멤브레인을 미리 적셔 바닥 전달 스택을 준비합니다.

이때도 여과지를 증류수로 다시 적십니다. 다음으로, 준비된 하단 전사 스택에 실험용 젤을 끈으로 묶은 다음 사전 작업 여과지를 젤 위에 놓고 둘 다 굴려 층 사이에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 여과지와 하단 스택 위에 상단 스택을 놓습니다.

그런 다음 전사 스택 샌드위치를 굴려 기포를 제거합니다. 전사 스택 키트의 스폰지를 흡수 패드에 삽입하고 전사 스택 샌드위치를 전용 공간에 놓습니다. 그런 다음 뚜껑을 단단히 닫고 I 블록 2를 시작하여 프로그램 3에서 7분 동안 단백질을 전달합니다.

프로그램이 완료되면 아이 블록 기계에서 전사 스택을 제거하고 상단 전사 스택과 여과지 층을 벗겨내어 하단 전사 스택의 젤을 노출시킵니다. 전달 효율성 단백질 얼룩을 검사하기 위하여 막 트리밍에 따라 막에 오리엔테이션 목적을 위한 삼각형 커트를 만들기 위하여 주의하는 젤의 주위를 자르기 위하여 메스를 사용하고, 다만 설명되는 것과 같이 젤은, 그 후에 3개의 첫번째를 위한 PBS의 5 밀리리터를 포함하는 청결한 50 밀리리터 관으로 막을 신속하게 이동했습니다, 기계식 롤러로 5분 세척. 세 번째 세척 후 세척 버퍼를 버리고 실온에서 최소 30분 동안 희석되지 않은 차단 버퍼에 멤브레인을 배양합니다.

다음으로, 5ml의 차단 완충액과 0.1 ml로 희석된 1차 항체에 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, 1차 항체 용액을 버린 후, 방금 시연한 것처럼 PBS에서 5분 동안 멤브레인을 6번 세척합니다. 그런 다음 형광 태그가 붙은 2차 항체로 어둠 속에서 멤브레인을 배양하고, 5ml의 차단 완충액과 0.1%에서 지속적인 교반으로 20 사이에 팽창시킨 다음, 모든 이미징에 대해 6번의 5분 PBS 세척을 수행합니다.

먼저 컴퓨터와 이미저에 로그인합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 열어 서쪽 얼룩을 이미지화합니다. 먼저 이미저의 뚜껑을 열고 소량의 PBS를 유리에 붓습니다.

이미저의 왼쪽 하단 모서리에서 멤브레인을 PBS 위에 놓고 이미저의 축과 정사각형이 되고 멤브레인과 그리드 축 사이에 1cm의 간격이 남도록 합니다. 멤브레인을 굴려 유리와 멤브레인 사이에 기포가 갇히지 않도록 한 다음 x축과 y축에서 멤브레인이 차지하는 사각형 수를 계산합니다. 그런 다음 이미저의 덮개를 닫고 컴퓨터 소프트웨어에 사각형 수를 입력합니다.

적절한 적외선 채널과 적절한 강도를 선택하고 스캔을 시작하여 로딩 제어 겔의 총 단백질 염색을 시각화합니다. 실험용 멤브레인에 대해 방금 설명한 대로 젤과 이미저를 수리한 다음 700 채널을 선택합니다. 강도를 5로 설정하고 스캔을 시작합니다.

스캐닝 데이터를 정량화합니다. 최상의 이미지 품질을 생성하기 위해 스캔한 파일의 밝기 및 대비 버튼을 조정하고 원하는 방향을 얻는 데 필요한 이미지를 회전하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 모양 메뉴에서 사각형을 선택하고 이를 사용하여 전체 차선 주위에 사각형을 그립니다.

샘플 레인 1에서. 레인 1 주위의 셰이프를 복사하여 붙여넣어 레인 2를 샘플링합니다. 배경 측정이 다음 레인에 신호를 통합하지 않는지 확인한 후 나머지 샘플 레인에 대해 각 레인 주위에 직사각형을 그립니다.

그런 다음, 임의의 형광 단위로 그려진 각 사각형에 대한 형상 테이블의 신호를 표시하고 이미지를 tiff 담즙으로 저장합니다. 정량적 형광 웨스턴 블로팅(Western blotting) 중에 정확한 데이터를 수집하기 위해 중요한 여러 가지 제어 조치가 있습니다. 예를 들어, 양성 대조군 샘플을 포함하는 것이 바람직합니다.

둘째, 겔에서 멤브레인까지 고분자량 및 저분자량 단백질의 등가 이동을 보장하기 위해 전달 시간을 최적화하는 것이 중요합니다. 셋째, 이러한 이미지에 나타난 바와 같이 비특이적 밴딩(banding)으로 인한 관심 단백질의 잘못된 해석을 피하기 위해 적절한 1차 및 2차 항체 희석을 결정해야 합니다. 넷째, 특히 예상되는 단백질 띠가 검출되지 않는 경우 다른 숙주 종에서 생성된 2차 항체가 필요할 수 있는지 여부를 고려하는 것이 중요합니다.

다섯째, 로딩 제어 겔의 생산은 샘플 하중의 균일성을 확인할 수 있습니다. 총 단백질 분석과 결합하면 겔을 사용하여 각 샘플에 대해 측정된 다양한 분자량 범위에서 각 레인의 단백질 부하를 비교하고 정량화할 수 있습니다. 마지막으로, 이 기술은 감도 증가, 배경 감소, 이중 색상 감지 및 장기 보관 조건에서의 멤브레인 안정성을 포함하되 이에 국한되지 않는 요인으로 인해 kemi 발광보다 더 유연하게 멤브레인을 스트리핑 및 재프로빙하는 데 적합합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 정량적 형광 웨스턴 플로팅을 사용하여 관심 단백질을 검출하고 정확하게 정량화하는 방법과 이 기술을 수행할 때 발생할 수 있는 일반적인 문제를 해결하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.