Name: 분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 유동 세포측정법을 사용하여 골 형성 능력이 향상된 인간 지방 유래 줄기세포(ASCs) 하위 집단을 분리하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 두개안면 골격 재건 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 건강 연구 보조금 R01-DE021683-01 및 건강 연구 보조금 R01 - DE019434의 국립 연구소 MTL에 국립 연구소에 의해 지원되었다; MTCDCW 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구 활동은 ACS 프랭클린 마틴 교수 연구 활동, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 수상에 의해 지원되었다.

참고 : 모든 환자 샘플 동의 얻었다, 실험 프로토콜을 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 승인되었다. 1. 세포 분리 및 문화 : <ol><li> 일반 / 국소 마취하에 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지 영역의 선택 과목 lipoaspiration를 받고 건강한 여성 환자에서 인간의 피하 지방 조직을 얻습니다. 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 인체 조직에서의 ASC를 분리의 프로토콜 얻어되었는지 확인하고, 그러한 물질들로 작업하는 동안 제도적 안전주의 사항을 따르십시오. </li><li> lipoaspirated 지방 조직에서 SVF를 얻으려면, 먼저 1X 멸균 인산 완충 생리 식염수를 같은 부피 (PBS)와 리포 애스 퍼 레이트 세 번 씻는다. 조심스럽게 기음과 바닥 수성 층을 버린다. </li><li> 내가 행크의에서 콜라 0.075 % 유형 : 콜라겐 소화 버퍼를 준비균형 소금 솔루션 (HBSS). FACS 버퍼를 준비 : 2 % FBS, 1 % P188 및 PBS에 1 % 펜 연쇄상 구균을. 시판 0.22 ㎛의 공극 크기 빠른 유동 폴리 필터를 사용하여 두 용액을 필터. </li><li> 세척 된 지방 조직을 소화, 37 ° C (약 180 흔들기 / 분)에서 60 분 동안 진탕 수욕 안전하게 분해 용기를 콜라게나 제 소화 버퍼의 동일 부피를 추가 배치. 참고 :이 떨고 동안 최대한의 소화 수 있습니다대로, 요구되는 것보다 더 큰 볼륨 분해 용기를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다 (즉, 콜라겐 소화 버퍼 250 ml의, 1L 멸균 플라스크에 씻어 지방 조직의 250 ㎖). </li><li> FACS 완충액의 동량을 첨가하고 5 분 동안 RT에 앉아 있도록함으로써 효소 활성을 중화. 다음, 4 ℃에서 20 분 동안 233 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 기음과 고밀도 SVF 펠렛을 방해하지 돌보는, 상층 액을 제거한다. </li><li> RT 레드 5-10 ml의 펠렛을 재현 탁세포 펠렛의 크기에 기초하여, 용해 완충액. 실온에서 5 분 동안 233 XG에서 5 분 원심 분리기에 대한 RT에 앉아 솔루션을 남겨주세요. </li><li> 기음 상등액과 펠릿 크기에 따라 기존의 성장 배지 5-10 ml를 첨가하여 펠릿을 재현 탁 (둘 베코 변형 이글 중간 [DMEM] / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 [펜 연쇄상]). </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과. </li><li> 4 ° C에서 5 분 233 XG에 원심 분리기 및 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 펠릿의 크기에 기초하여 기존의 성장 배지 5~10 ㎖,에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 15cm 표준 배양 접시에 2 × 10 6 세포를 놓고 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2에서 차 문화 O / N을 설정합니다. 37 ° C / 21 % O 2, 성장 배지에서 5 % CO 2에서 자발적인 분화를 방지하기 위해 서브 합류 수준에서 유지한다. 참고 : 완전히의 셀 밀도합류 15cm 플레이트는 약 4-6 × 106 세포이다. </li></ol> 2. 염색 <ol><li> 염색하기 전에 36 시간 동안 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2, 전통적인 성장 배지에서 배양의 ASC는 / 정렬. </li><li> (제조사의 프로토콜에 따라) Accutase를 사용하여 배양 접시에서 리프트의 ASC. </li><li> 한 번 (2 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균과 PBS) FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 233 XG에 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. FACS 완충액 0.5 ml의 세포를 재현 탁 (세포 수 및 항체의 원하는 양에 따라). 주 : 세포 현탁액의 부피는, FACS 항체 제조자의 권고에 따라, 항체 농도를 결정한다. 그러나, 항체의 농도가 적정, 하나의 출발 농도를 사용 : 그것은 항체를 사용하는 최초 시간 인 경우 (100), 일반적으로 권장된다. </li><li> 총 수를 계산혈구를 사용하여 세포. </li><li> 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에서 예약 100 UL 분취 흠 샘플 (사용하는 형광 항체의 수에 따라) 단일 색상 조절을 위해 사용된다. </li><li> (제조업체의 지침에 따라 소정의 농도에서) 적절한 형광 표지 된 단일 클론 항체를 추가하고 빛으로부터 보호 얼음에 20 ~ 30 분 동안 품어. <ol><li> 골 형성 모집단 레이블을 지정하려면 : 1시 50분의 농도로 FACS 버퍼에 안티 CD90 (APC 안티 - 인간 CD90 (Thy1)) 또는 안티 CD105 (FITC 안티 - 인간의 CD105 (endoglin))를 희석. </li><li> 다른 세포 집단 (예를 들어, 조혈 및 내피 세포)에 레이블을 지정하려면 : 안티 CD45 (안티 - 인간 CD45 태평양 블루), 항 CD34 (안티 - 인간 CD34 APC), 및 / 또는 항 CD31 (안티 - 인간 CD31 PE를 희석 ) FACS 1:50의 농도로 버퍼. </li><li> 직접 접합 된 항체를 사용하지 않는 경우, 적절한 스트렙 타비 딘 - 접합 제와 비오틴 차 항체를 사용하여하나의 희석 등 스트렙 타비 딘 PE-Cy7로 진 항체, 100. </li></ol></li><li> 상층 액을 흡입, 4 ° C에서 5 분 동안 233 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기와 튜브를 채우기 : 부화 후, 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 400 ~ 500 μL FACS 버퍼 및 필터 샘플에서 세포를 재현 탁. </li><li> 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 세포를 전송하고 분석 기간 동안 얼음에 샘플을 유지. </li></ol> 3. 형광 활성화 셀 정렬 주 : 다음 단계는 이전 형광 활성화 된 세포에서 지식 정렬 (FACS) 또는 숙련 된 기술자의 도움을 의무화. <ol><li> 포워드 산란 (FSC), 측면 산란 (SSC)를 조사하기 위해 설계 분석 플롯을 적절한 FACS 소프트웨어를 이용하여, 피코 에리 트린 (PE) - 텍사스 레드, 퍼시픽 블루, 형광 염료 (FITC), 알로 피코시 아닌 (APC)와 다른 형광 물질을 사용D는 세포 레이블을. </li><li> 셀 소터, 잠시 소용돌이 세포를 재현 탁 각 샘플에로드하기 전에. </li><li> 세포 파편을 제외하고,베이스 라인 형광도를 결정하기 위해, 전체 세포 집단을위한 게이트를 설정하기 위해 흠 견본의 분석을 시작. </li><li> 흠 견본에 요오드화 프로피 듐 (PI)를 첨가하고, 전체 세포 집단 내에서 살아있는 세포 집단을 시각화하기 위해 그것을 분석. 이 인구 주위에 게이트를 구축합니다. </li><li> 형광 보정을 설정하기 위해 각각의 형광 색소에 대한 단색 대조군 샘플을 분석한다. </li><li> 정렬 게이트의 위치를​​ 설정하는 스테인드 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 죽은 세포를 염색하기 위해 염색 된 샘플에 PI를 추가합니다. </li><li> 표지 된 세포 집단을 정렬합니다. 정렬 1.5 ml를 원심 분리기 튜브 또는 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브 (15 mL) 중 하나에. </li><li> 수동 셀들의 수량이 필요한 구하면 정렬 중단. </li><li> 우리FACS를 보내고, 극히 일부를 분석 (예., 500 세포) 취득 된 세포 집단의 순도에 의해 검사를 수행한다. 참고 :이 단계는 정렬 된 세포 집단의 순도를 확인합니다. 이상적으로, 순도 90-95 % 이상이어야한다. </li><li> 39 °에서 5 분 동안 원심 분리기 (233) XG 세포를 즉시 10 % FBS를 함유하는 새로운 배지 1 ㎖에 정렬 완료하고 다음을 재현 탁시켰다. 주 : 사용 된 용지의 양이 세포 펠렛의 크기에 따라 증가 될 수있다. </li><li> 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이트는 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 최종 세포 수율, 판 6 웰 플레이트에 웰 당 30 만 셀, 12 웰 플레이트에 웰 당 10 만 셀에 따라. </li></ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

저자 중에이 원고에서 언급 된 제품, 장치 또는 약물의에 재무 적 이해 관계가 없습니다. 저자 중에보고 어떤 경쟁 금융 관심이 없다.

현재, 인간 지방 조직의 SVF에서의 ASC의 동종 개체군의 분리는 바람직한 목표 그래도 도전 남아있다. 이러한 세포는 골격 조직의 형성 및 항상성을 연구하는데 이용 될 수있는 친 조골 ASC의 개체군의 분리는, 특히 바람직하다. 그러나, 지방 조직의 SVF는. 셀 용량과 분화 가능성을 막기위한 관련이 이질성에 대한 분자 기초는 세포의 풀링 된 인구에서 이해 될 수없는 11 이질성을 품고, 대신 단일 세포 분석을 필요로한다. (12)이 방법을, 표면 마커는 밀접의 ASC의 조골 세포 분화 능력이 확인 될 수와 연관된. 상기 방법에 설명 된대로의 ASC 성공적 농축을위한 가장 중요한 요소는, FACS에 이용 된 항체에 관한 것이다. 하나는 CEL에 대한 높은 친 화성 항체를 선택 신중해야문제의 1- 표면 마커. 이상적으로는, 따라서 여러 단계와, 세포 사멸, 세포 손실 및 오류 적립되는 기회를 증가 요구 간접 염색법, 반대로 일차 공액 된...

줄기세포 집단의 이질적인 특성은 아직 완전히 이해되지 않았으며 임상적으로 효과적인 줄기세포 기반 치료 응용 프로그램의 개발에 주요 장애물로 남아 있습니다. 이질적인 줄기세포 집단을 특성화하는 가장 일반적인 방법 중 하나는 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 같은 세포 분류 방법을 사용하여 표면 마커 발현 프로파일을 기반으로 세포를 분리하는 것입니다. 분류 방법이 더욱 복잡해짐에 따라 세포의 보다 뚜렷한 기능적 하위 집단을 식별하는 것이 가능해집니다. Microfluidic 근거한 기술은 단 하나 세포 수준에 유전자 발현의 분석에서 점점 더 빈번하게 이용되고 있습니다. 미세유체 칩 내의 다중화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 효과적이고 신뢰할 수 있는 고분해능 단일 세포 전사 분석이 가능합니다. 1-5명
48개 유전자의 단세포 전사 프로파일링을 사용한 이전 연구에서 ASC에서 상당한 전사 이질성이 관찰되었습니다. 6 그러나 MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 유전자의 분포는 고도의 골형성 전사 프로파일을 가진 세포 클러스터와 강한 연관성을 나타냈습니다. 이 골형성 유전자 발현 프로파일에 따라 세포를 분리하기 위해 표면 항원 발현 패턴은 전사 패턴과 상관관계가 있었고 엔도글린(CD105)의 표면 마커 발현은 ASC의 향상된 골생성 분화 잠재력과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌습니다. CD105 발현과는 별개로, Chen 등이 이전에 골전구세포와 관련이 있는 것으로 밝혀진 글리코실-포스파티딜이노시톨 결합 막 단백질인 표면 수용체 Thy-1(CD90)의 발현도 골형성 유전자 발현과 상관관계가 있었습니다. 6,7 이러한 발견은 세포 기반 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 골형성 능력이 증가된 ASC의 더 큰 이질적인 풀 내에서 하위 집단을 전향적으로 분리할 수 있는 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>일회용 250 ml 원뿔형 튜브</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - 항균 Povidone/Iodine 용액</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, US Origin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE 세포 분리 솔루션</td><td>줄기 세포 기술</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC 마우스 Anti-Human CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue 대체품)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II 기기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC)는 줄기세포 기반 조직 공학 응용 분야의 황금 표준으로 간주됩니다. 그러나 수확해야 하는 과정은 상당한 기증자 부위 이환율과 관련이 있을 수 있습니다. 반면, 지방 유래 기질 세포(ASC)는 더 쉽게 풍부하고 더 쉽게 채취할 수 있어 BM-MSC에 대한 매력적인 대안이 됩니다. BM-MSC와 마찬가지로 ASC는 골형성 계통 세포로 분화할 수 있으며 두개안면 골격 결손에 사용하기 위해 골격에 파종하는 것과 같은 조직 공학 응용 분야에 사용할 수 있습니다. ASC는 ASC, 혈관 내피 세포 및 벽화 세포, 평활근 세포, 주위 세포, 섬유아세포 및 순환 세포의 이질적인 혼합물인 소화된 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 얻습니다. 유세포 분석은 ASC에 대한 표면 마커 프로파일이 BM-MSC에 대한 표면 마커 프로파일과 유사하다는 것을 보여주었습니다. ASC 표현형에 대한 마커를 확립하는 여러 발표된 보고서에도 불구하고 이 이질적인 집단에서 골전구 세포를 식별하는 프로필에 대한 합의가 여전히 부족합니다. 이 프로토콜은 중요한 크기의 calvarial defects를 복구하기 위해 향상된 osteogenic capacity를 가진 ASC의 하위 모집단을 분리하고 사용하는 방법을 설명합니다.

인간의 ASC (그림 1A, 1B)의 고농축 인구의 분리 향상된 골 형성의 결과 세포 마커로서 CD90 사용. 태평양의 ASC는 블루 - 공액 항 - 인간 CD45, FITC 접합 된 항 - 인간 CD105 및 APC 공액 항 - 인간 CD90으로 염색 하였다. 정렬 후 분석으로 정량으로 정렬 한 후 순도의 수준은 98 % 이상이었다. 두 개의 새로운 개체군의 미래의 격리를 위해 허용 전사 프로필을 기반으로 세포의 그룹을 정의. 앞서 설명한대로 6,8,9 각 유망 모집단 (낮은 CD90 및 CD105 +)의 전위 골 형성뿐만 아니라, 그 정렬되지 않은 체외에서 인구의 특성을, 세포를 14 일 골 세포 분화 배지에서 배양 하였다. 7 일째에 (골 형성 (10)의 조기 검출을 위해 사용) 알칼리 포스 파타 아제 염색 CD90 + 크게 증...

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

이 절차의 전반적인 목표는 이를 달성하기 위해 유동 보조 세포 분석을 사용하여 골 형성 가능성이 향상된 인간 지방 유래 줄기 세포의 하위 집단을 분리하는 것입니다. 인간 지방 유래 줄기세포 또는 ASC는 인간 lipo 흡인에서 수확하고 36시간 동안 배양합니다. 그런 다음 pros 골형성 집단을 라벨링하기 위해 선택된 항체로 세포를 염색하고 원하는 집단을 flow assisted cytometry를 사용하여 분리합니다.궁극적으로, 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase)와 아자린(azarin) 염색은 분리된 세포의 향상된 골형성 잠재력을 보여줍니다. 이 기술의 의미는 재생 의학과 새로운 중개 요법의 개발로 확장되는데, 이는 향상된 골형성으로 ASC의 하위 집단을 분리하는 방법을 설명하기 때문입니다. 다음 절차는 국소 또는 전신 마취 하에 복부, 옆구리 및/또는 허벅지 부위의 선택적 지방 흡인을 받은 건강한 여성 환자의 인간 피하 지방 조직을 사용하여 수행됩니다.수술실에서 직접 가져온 흡입 캐니스터에 500ml에서 1리터의 티슈를 넣는 것으로 시작합니다. 채취 즉시 수확 절차를 시작하십시오. 이렇게 하면 지방 흡인 지방 조직에서 기질 혈관 분획 또는 SVF를 얻을 수 있는 세포 생존 능력을 극대화할 수 있습니다. 먼저 멸균 PBS를 1:1의 비율로 첨가합니다.그런 다음 캐니스터를 부드럽게 흔들어 섞습니다. 혼합 후. 용액이 세 개의 층으로 분리될 때까지 그대로 두십시오.상단 오일 층은 투명하고 노란색입니다. 중간 지방층은 점성이 있고 불투명하며 노란색이고 아래쪽 혈액층은 빨간색입니다. 혈청학, 피펫을 사용하여 조심스럽게 흡입하고 하단 혈액 층을 버리고 상단 오일 층을 흡인합니다.그런 다음 이것을 반복하십시오. 두 번 더 세탁하십시오. 동봉된 문서에 명시된 대로 콜라겐분해효소 분해액 및 팩스 완충액을 준비한 후, 적혈구 용해 완충액과 함께 후드에 넣어 실온으로 데울 수 있도록 합니다.다음으로, 세척된 지방 조직을 큰 플라스크로 옮기고 동일한 부피의 콜라겐분해효소 분해 완충액으로 소화합니다. 플라스크를 흔들리는 수조에 60분 동안 단단히 넣습니다. 섭씨 37도에서.필요한 것보다 더 큰 부피의 소화 용기를 사용하는 것이 가장 좋으며, 이렇게 하면 쉐이킹 중에 최대 소화가 가능합니다. 예를 들어, 250ml의 콜라겐분해효소 분해 완충액과 250ml의 세척된 지방 조직을 멸균 1리터 플라스크에 넣어야 합니다. 배양 후, 동일한 양의 팩스 버퍼를 추가하고 조직을 5분 동안 실온에 두어 효소 활성을 중화합니다.다음으로, 소화 조직을 250ml 일회용 원뿔형 원심분리기 튜브로 옮기고 233Gs 또는 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리기를 합니다. 스핀 후, supinate를 흡인하고 5-10 밀리리터의 전통적인 성장을 추가하여 펠 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 알갱이의 크기에 따라 중간입니다.그런 다음 100마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 50ml 원뿔형 튜브에 현탁액을 피펫으로 넣어 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 버리면 그림과 같이 팔레트가 나타나야 합니다. 여기 Reese, 10ml의 실온에서 입천장을 매달아 놓습니다.적색 용해 완충액. 용액을 실온에서 5분 동안 그대로 두었다가 실온에서 5분 동안 233Gs로 원심분리합니다. 다음으로 섭씨 4도에서 5분 동안 233Gs에서 원심분리기를 하고 펠릿을 방해하지 않고 스내트를 버립니다.그런 다음 Resus, 펠릿을 5-10 밀리리터의 전통적인 성장에 현탁시킵니다. 알갱이의 크기에 따라 중간입니다. 세포 계수 후 10cm 표준 배양 접시에 200만 개의 세포를 넣고 하룻밤 동안 1차 배양을 설정합니다.자발적인 분화를 방지하기 위해 SVF 세포를 sub confluent 수준으로 유지하십시오.파종 후 36시간이 지나면 제조업체의 프로토콜에 따라 Accutane을 사용하여 세포를 들어 올립니다. 팩스 버퍼로 셀을 한 번 세척한 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 233Gs로 원심분리합니다.스핀 후 펠릿을 방해하지 않고 스내트를 버립니다. 세포를 0.5 - 1 밀리리터의 효과로 재현탁시킵니다. 완충기. 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.120만 개의 셀을 정렬되지 않은 그룹에 할당하여 대조군으로 별도로 플레이팅합니다. 이 실험에서는 100마이크로리터 쿼트를 하나의 1.5밀리리터 에이너 튜브로 옮깁니다. 분석할 각 샘플에 대해 염색되지 않은 샘플 1개와 사용할 각 항체에 대한 단색 대조군을 준비하고 얼음 위에 놓습니다.골형성 하위 집단을 팩스 버퍼에 희석하여 anti CD 90 또는 anti CD 1 0 5를 표시하여 조혈 및 내피 세포와 같은 다른 세포 집단을 레이블로 표시한 다음 팩스 버퍼에서 anti CD 45, anti CD 34 및/또는 anti CD 31을 희석합니다. 배양 후 튜브에 팩스 버퍼를 채우고 섭씨 4도에서 5분 동안 233Gs에서 원심분리기를 채워 세포를 두 번 세척합니다. 스핀 흡인 후, 두 번째 세척 후 스내트는 400-500 마이크로 리터의 효과로 세포를 재현 탁시킵니다.버퍼 필터는 70마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 샘플을 원심분리 튜브에 넣어 세포 덩어리를 제거합니다. 함께 제공되는 프로토콜에 자세히 설명된 대로 형광 활성화 세포 분류를 수행합니다. 팩트 소프트웨어 설계 분석 플롯을 사용하여 전방 산란 측 산란 피코, 에린, 텍사스 레드 퍼시픽 블루 형광 이소티오시아네이트, 시안화물 모두 및 세포 라벨링에 사용되는 기타 Fluor four를 조사합니다.원하는 세포 집단을 실수로 제외하지 않도록 사실 분석 플롯이 적절하게 그려지도록 하는 것이 중요합니다. 라벨링된 세포 집단을 1.5ml 원심분리 튜브 또는 배양액이 포함된 15ml 원추형 튜브로 분류합니다. 매체는 수동으로 정렬을 중단합니다.이 실험에 필요한 양의 세포를 얻으면 약 200만 개의 세포가 필요합니다. 다음으로, 사실을 사용하여 획득된 세포 집단의 약 500개 세포의 작은 부분을 분석하여 순도 검사를 수행합니다. 이 단계는 분류된 세포 집단의 순도를 확인합니다.이상적으로는 순도가 섭씨 4도에서 5분 동안 233Gs로 원심분리 셀을 분류한 직후 90-95% 이상이어야 합니다. 그런 다음 세포 생존력을 향상시키기 위해 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 10% FBS 플레이트를 포함하는 1밀리리터의 신선한 배지에 세포를 재현탁합니다. 최종 세포 수율 플레이트에 따라 6개의 웰 플레이트에서 웰당 300, 000개의 세포 또는 100, 웰당 000개의 세포가 있습니다.인간 지방을 분리하기 위한 12개의 웰 플레이트에는 골형성 잠재력이 증가된 기질 세포가 도착합니다. ASC는 Pacific Blue conjugated anti-human CD 45, Fitz Conjugated anti-human CD 1 0 5 an A PC conjugated anti-human CD 90으로 염색하고 여기에 표시된 바와 같이 이 비디오에 설명된 대로 분리하고, 높은 CD 90 또는 낮은 CD 1 0 5 발현을 기반으로 정렬하여 두 하위 집단의 골형성 가능성을 특성화하기 위해 매우 풍부한 인간 ASC 집단을 산출했습니다. CD 90 양성 CD 1 0 5, 낮고 분류되지 않은 ASC를 본 이미지에서 볼 수 있듯이 14일 동안 골형성 분화 배지에서 배양했습니다.뼈 형성의 초기 지표 역할을 하는 알칼리성 인산가수분해효소 염색은 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 정량화에 비해 배양 CD 90 양성 모집단에서 증가하여 관찰된 차이가 유의한 것으로 확인되었습니다. 마찬가지로, 14일째에, 세포외 기질 광물화를 검출하는 데 사용되며 말단 골형성 분화를 위한 척도를 제공하는 aller 및 red staining이 다른 그룹에 비해 CD 90 양성 모집단에서 증가했습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 정량화도 관찰된 차이가 유의하다는 것을 확인했습니다.이러한 데이터는 CD 90 양성 ASC가 분류되지 않은 세포보다 훨씬 더 많은 양의 세포외 기질을 광물화할 수 있음을 나타내며, 이는 분리된 ASC가 분류 후 골형성 분화를 거칠 수 있는 능력을 유지한다는 것을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 골형성 잠재력이 향상된 ASC의 하위 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 인체 샘플로 작업할 때는 항상 적절한 보호복을 착용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

학습하세요 유동 세포측정법을 사용하여 골 형성 능력이 향상된 인간 지방 유래 줄기세포(ASCs) 하위 집단을 분리하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 두개안면 골격 재건 연구에 활용됩니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

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