Name: 마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 마이크로 CT를 이용한 누드 마우스 지방 이식 생존 평가 방법입니다. 인간 지방 조직을 처리하여 두피에 이식하고 주간 CT 촬영으로 부피 보존률을 정량 분석합니다. 이 기법은 재생의학 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 ACS 프랭클린 H. 마틴 교수 연구 활동, Hagey에 의해 지원되었다 오크 재단, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 MTLDCW에 국민 건강, 보조금 NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683 연구소 및 NIHU01HL099776에 의해 지원되었다 소아 재생 의학 및 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 상 실험실. 마이크로 CT는 생체 이미징 혁신 스탠포드 센터에서 실시했다.

참고 : 실험 프로토콜과 지방 얻기위한 환자 동의서를 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188)에 의해 승인되었다. 모든 동물의 절차는 프로토콜 # 9999에서 실험 동물 관리 (APLAC)의 스탠포드 행정 패널에 의해 승인되었다. 모든 실험은 동물의 안전과 인도적인 치료 가이드 라인을 엄격하게 준수하여 실시 하였다. 1. 지방 수확 <ol><li> 콜맨 절차 17-19을 사용하여, 선택 과목 지방 흡입 수술을받은 건강한 여성 환자의 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지의 영역에서 인간 지방 조직을 구하십시오. </li><li> 이식에 대한 리포 애스 퍼 레이트를 처리하기 위해, 지방은 30 분 동안 정착 할 수 있도록하여 시작합니다. </li><li> 리포 애스 퍼 레이트는 일반적으로 아래에서 위쪽에 오일, 중간에 지방, 혈액으로, 세 개의 층으로 정착. 대기음 오일은 상부 층 및 하부 층을 피 버린다. </li><li> 더 남아 tumesc를 제거하려면엔트 유체 또는 세포 파편은 350 XG에 5 분, 4 ° C의 지방을 원심 분리하고, 바닥 수성 층을 대기음. </li><li> 20 %의 전달을 허용 오차, 그라프 필요한 지방의 양을 계산하고, 50ml의 원뿔형 (들)에 지방의 전송을 원하는 볼륨. 그라프 필요한 지방 마이크로 리터를 수득 연구에서 쥐의 숫자로 400을 곱한다. </li><li> 이 시점에서, 수행하는 세포가 Lipotransfer (20, 21)를 보조하는 경우, 얼음에 접목 지방을 대신 볼륨. 이어서 Zuk 등 (22)에 의해 설명 된 표준 기술을 사용하여 잔여 지방에서 지방 - 유래 기질 세포 (ASC를)를 수확. </li></ol> 2. 지방 이식술 <ol><li> 여성, 실험 연구를위한 동형 접합 CD-1 누드 마우스를 가져옵니다. 나이 8-12주 사이에 마우스를 선택합니다. </li><li> 약 10 분 동안 2 L / 분으로 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 최저 상자에 마취, 도시를 유도하도록 마우스. 그 추천 isof 유의하시기 바랍니다lurane 용량은 마우스의 변형에 따라 달라집니다. </li><li> 마우스의 호흡 속도가 둔화되면, 발가락 핀치와 적절한 진정 작용을 확인합니다. 마우스의 두 눈에 동물 윤활 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 마우스가 발가락 핀치에 대한 응답으로 움찔​​하지 않는 경우,이 마취의 충분한 비행기를 확인합니다. / 분 1-2 L에서 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물을 제공하는 노즈콘에 마우스의 코를 놓습니다. 마우스가 발가락 핀치에서 후퇴하는 경우, 5 분 후 최저 상자와 재시험로 돌아갑니다. </li><li> 70 % 에탄올 용액 다음에 2.5 % 포비돈 - 요오드와 두피를 소독 한 후 마우스의 무균 영역을 설정합니다. 두 번 더 반복합니다. </li><li> 마우스 위에 대한 수술 드레이프를 놓고 멸균 필드를 유지 보수하는 데주의해야합니다. 무균 악기, 장갑 및 PPE는 항상 사용되어야한다. </li><li> 지방 볼륨이 이전에 얼음에 배치 된 이식 할 경우, 먼저 배달하기 전에 실온으로 조정하는 지방 수 있습니다. </li><li> 1 mL를 1 ml의 루어 로크 시린지를 Backload의 지방. </li><li> 주사기의 끝으로 14 G, 8cm 긴 지방 이식 정맥을 연결합니다. </li><li> 지방의 200 사이의 400 μL까지 주사기 플런저를 누름으로써 국무 시스템은 주사기에 남아 있습니다. 주사기 플런저를 누르면서 캐 뉼러가 완전히 말초 정맥 구멍을 빠져 나가는 지방을 관찰하여 지방으로 가득 것을 확인합니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 두개골의 꼬리 - 대부분의 측면을 덮는 중간 선에서 등쪽 피부를 들어 올립니다. 미세 가위를 사용하여 피부를 잘라 1.5 mm를 확인합니다. </li><li> 나중에 이식이 수행 된 후 상처의 가장자리는 함께 가지고하는 데 사용되는 컷의 중간을 통해 하나의 6-0 나일론 봉합사를 놓습니다. 봉합사를 묶어하지 마십시오. </li><li> 피부 절개를 통해 정맥을 삽입하고 상부의 피부에 대한 모든 결합 조직의 첨부 파일을 무료로 두개골을 통해 팬 모양의 패턴으로 앞뒤로 캐 뉼러를 전달하여 두개골을 통해 피하 주머니를 만듭니다. </li><li> 포켓이 생성되면, (C)를 위치직접 팁까지 두개골 위에 마우스의 중간 선에서 annula는 눈 사이에 그려진 라인 뒤에 있어야 포켓의 주동이의 가장 측면에 자리 잡고 있습니다. (도 1a) </li><li> 천천히 다시 캐 뉼러를 잡아 당기면서 플런저를 전진, 역행 방식으로 지방을 주입. 집게를 사용하여, 함께 상처 가장자리를 가져오고 주머니에서 누출 어떤 지방을 유지하도록 올립니다. </li><li> 이전에 첫 번째 매듭이 피부에 가볍게있는 것을 확인하고, 배치 된 봉합사를 묶어. 3 개의 광장 매듭을 묶어 3mm 꼬리 봉합사를 잘라. (그림 1B) </li><li> 시각화 및 포켓 수량이 초과되지 않고 주머니를 덮는 피부가 긴장하지 않다 매뉴얼 촉진으로 확인합니다. 포켓 수량이 초과 된 경우에는 봉합을 잘라 주머니 내에서 모든 지방을 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 주머니를 씻어 내고 지방의 작은 볼륨을 다시 주입. </li><li> 에서 마우스를 제거그 자체로 깨끗한 케이지의 후면 또는 측면에 nesthesia과 장소. 규칙적인 호흡, 정상 운동, 출혈의 부재, 그리고 통증이나 고통의 징후 동물을 모니터링합니다. 동물이 고통에있는 경우 최대 48 시간 동안 프레 노르 핀 0.1 ㎎ / ㎏ 피하 매 6 시간을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 동물이 무인 떠나기 전에 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분히 깨어 있는지 확인하십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 동물을 올려 놓지 마십시오. </li><li> 4 시간 후, 동물이 먹고, 이동 음료, 정상적으로 호흡 할 수 있는지 확인하지 않고 수술 부위에서 출혈이 더 있다는 것을. 동물 보호 시설로 돌려줍니다. </li></ol> 3. 마이크로 CT <ol><li> 스캔 수술 후 3 일째되는 날 기준 볼륨 마우스 및 수술 후 2 주, 4, 6, 8에서 검사를 반복한다. </li><li> 각 시점에서 마우스를 이미징하는 경우, S에서 앞서 설명한 바와 같이 전후 절차 진정 및 동물 관리 지침을 따르2.2-2.4 및 2.17-2.19를 TEPS. </li><li> 100 ㎛ 이상의 재구성 복셀 크기의 마이크로 CT 스캐너에 스캔을 수행합니다. </li><li> 80 KVP의 피크 X 선 kilovoltage 450 μA의 양극 전류로, 각 마우스에 9 분 스캔 중에 약 5 centiGy의 배급 복용량을 관리 할 수​​ 있습니다. 이 값은 스캔 프로토콜에 따라 달라질 유의하시기 바랍니다. </li><li> 첫 번째 스캔을 수행하기 전에, 공기, 물, 및 뼈 강도 구별 촬상 팬텀 마이크로 CT를 교정. </li><li> 두 상단에 마우스 및 바닥에 두와 복부 위치에 스캐너로 네 마우스를 놓습니다. 주사 베드 용이 마우스 본체 노즈 콘과 같은 10 ㎖ 주사기를 보유하는 60 ㎖를 주사기를 사용하여 구성 될 수있다. (23) </li><li> 분당 1-2 L에서 2.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 마취 쥐를 유지한다. </li><li> 스카우트 이미지와 함께 확인 첫 번째 경추에 코에서, 그리고 두개골의 상단에서 SKU의베이스에 마우스의 전체 두개골,LL, 이미지를 만들 것입니다. </li></ol> 4. 마이크로 CT 분석 <ol><li> 화소 강도에 대한 임계 값을 사용하여 복셀을 선택하여 관심 영역의 생성을 허용하는 마이크로 CT 영상 분석 소프트웨어 (ROI &#39;S)로 재구성 된 이미지를 연다. 소프트웨어는 또한 3D 생성이 선택된 복셀의 보간 표면 및 볼륨 분석 할 수 있습니다. </li><li> 2 차원 코로나, 축, 및 시상 뷰에서 재구성 된 CT 이미지를로드하여 시작한다. (도 2a) </li><li> 가이드로 축 슬라이스를 사용하여 지방 이식의 가장 왼쪽 측면에 해당하는 시상 슬라이스로 이동합니다. 지방 이식에 대응하는 모든 복셀을 캡처 픽셀 강도에 대한 상위 및 하위 임계 값을 선택,하지만 그 주변 조직과 뼈를 제외합니다. (그림 2B) </li><li> 이전에 정의 된 화소 강도 임계치를 이용하여 지방 그래프트에 대응 시상 관점에서 ROI를 정의한다. R이식의 가장 오른쪽 측면에 도달 할 때까지 탐색이 절차마다 다섯 번째 시상 슬라이스를 EPEAT. (그림 2C) </li><li> 하나의 결합 된 3D ROI에 모든 2D ROI의에서 선택된 복셀 보간. (그림 2D) </li><li> 소프트웨어에 의해 계산 된 기록 ROI 볼륨. </li><li> 최종 그래프트 지방 부피를 시각화 된 3D 렌더링있는 isosurface. (그림 2E) </li><li> 후속의 분석에서, 화소 강도 최대 및 최소 임계 값 기준 분석에 사용 된 것과 동일하게 유지해야. </li></ol> 5. 지방 수확 <ol><li> 생쥐 8 주 시점 (24, 25)을 검사 한 후에, 이전 단계에서 2.2-2.4 2.17-2.19 및 전술 한 바와 같이 쥐를 마취. </li><li> APLAC 지침에 따라, 자신의 척추 열을 분리하여 쥐를 안락사. </li><li> 수술 필드에 마우스를 놓습니다. 건 절단술 가위를 사용하여 조심스럽게 주머니를 열고 t을 해부그는 지방 이식에서 피부와 결합 조직의 첨부 파일을 덮는. </li><li> 이 시점부터, 그래프트의 추출을 돕기 위해 상부 등쪽 피부 패치를 절제하는 데 도움이 될 수있다. (그림 3A) </li><li> 살짝 집게로 이식에 견인을 유지하고 가위로 출시 할 필요가 긴장의 연속 포인트를 시각화하기 위해 좌우로 이식을 켭니다. </li><li> 그라프로 촬영 한 결합 조직을 최소화하기 위해 절개 할 때 가능한 이식에 가깝게있어. (그림 3B) </li><li> 이식을 절개 한 후, 적어도 0.01 그램 정확한 칭량 규모에 질량을 측정한다. </li><li> 질량 측정 값을 이용하여 지방 그래프트의 부피 및 전환율 인간 지방의 평균 밀도 (0.9 g / ㎖)를 계산. </li><li> 마이크로 CT를 사용하여 얻은 것과 지방 이식의 계산 된 볼륨을 비교. </li><li> 필요한 경우 지방 이식 조직 또는 조직 학적 분석을 위해 추가로 처리 될 수있다. </li></ol>

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저자 중 누구도 보고할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

이 시점까지는 대부분의 연구는 지방 이식의 장기 생존을 정량화하는 비 영상 방식에 의존하지만, 이러한 방법은 연구 동물의 희생을 필요로하고 단 하나의 측정을 얻을 수있다. 3,10-12 우리의 연구가 나타내는 마우스 모델에서 지방 이식편 생존의 대물 실시간 정량을 허용 개선 분석 방법. 이 과정에서 중요한이 그대로 면역 체계가 마우스를 사용하는 경우 발생할 수있는 이식 거부를 방지로 충분히 면역 마우스, 연구에 사용되는 것을 보장한다. 지방 무결성을 보존하는 것은 이식의 수확, 처리 및 배치 단계에서 중요하다. 전통적으로 허용 기준에 따라, 그 래프팅을위한 지방 흡입은 지방 흡입술 (SAL)에 의해 수득한다. 배치하는 동안 지방이 더 빨리 0.5 ㎖ / 초보다 안정된 유량으로 주입해야한다. 게이지 (14)는 캐 뉼러 I 그래프트 바람직하다NA 마우스, 그러나 더 큰 직경의 캐뉼라는 지방에 부상없이 사용될 수있다. 그들은 증가로 인해 전단 응력에 고장 지방의...

연조직 결손은 외상, 종양 절제, 노화, 선천적 기형 등 다양한 원인으로 인해 발생합니다. 이는 환자를 쇠약하게 만들 수 있으며 재건 외과 의사에게 가장 흔하지만 어려운 문제 중 하나입니다. 연조직 결핍을 해결하기 위해 국소 및 자유 피판, 콜라겐 주사, 합성 필러와 같은 많은 방법이 존재합니다. 4-8 그러나 1893년 Neuber가 처음 사용한 이래로 자가 지방 이식은 즉시 사용할 수 있고 수확이 쉽고 안전하며 자연적으로 호환되기 때문에 연조직 결핍을 복구하기 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 1,2 호
이러한 장점에도 불구하고 자가 지방 이식편은 예측할 수 없고 가변적인 생존율로 어려움을 겪으며 시간이 지남에 따라 유지율이 10-80%에 이릅니다. 1-3,9 이러한 예상되는 부피 및 대칭 손실을 설명하기 위해 외과의는 연조직 결손을 채울 때 종종 과도하게 교정하거나 여러 후속 절차를 수행해야 합니다.
혈관이 제대로 형성되지 않은 이식층은 이러한 조직 흡수에 부분적으로 책임이 있습니다. 또한, 이식편 생존율을 비교하기 위한 벤치마크 분석 방법이 없다는 점도 보고된 결과의 불일치에 기여할 수 있습니다. 이식편 부피를 측정하는 정확한 방법은 머무름 속도를 평가할 때 측정 오류를 줄일 수 있습니다. 이는 연구자들이 이식편 생존에 영향을 미치는 원인 요인을 보다 정확하게 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 많은 실험실 동물 모델이 인간 지방 이식 생존에 대한 정량적 및 정성적 평가를 모두 촉진했지만, 대부분은 조직학적 및 생화학적 수단을 기반으로 하며 단일 측정을 산출하기 위해 연구 동물을 희생해야 합니다. 3,10-12 생체 내에서 지방 이식 부피 유지를 열거하기 위한 이미징 기술의 사용에 대해서는 거의 보고되지 않았습니다.
소수의 임상 연구에서 이미징을 사용하여 더 효과적인 측정 기술을 보여주었습니다. MRI(Magnetic Resonance Imaging)는 Hörl et al.에 의해 채택되었습니다.지방 이식 생존을 측정하기 위해13 CT를 Har-Shai et al. 에 의해 활용하였다.및 Fontdevila et al. HIV로 고통받는 환자에 이식 한 후 부피 유지에 대한 분석에서. 14,15 3차원(3D) 이미징 소프트웨어 사용, Meier et al. 자가 지방 이식 후 인간의 부피 유지를 수술 전과 수술 후 기간의 이미지를 비교하여 측정했습니다. 16세
그러나 지방 이식의 생존을 측정하기 위해 이미징을 사용하는 표준화된 방법은 기초 과학 연구에서 부족합니다. 지방 이식편의 부피를 평가하기 위한 고해상도 이미징 접근 방식은 정확하고 재현 가능한 부피 측정뿐만 아니라 반복 측정을 가능하게 하여 지방 이식 생존의 진화를 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>SAL lipoaspirate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-1 누드 마우스 (Crl:CD1-Foxn1nu)</td><td>Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein, Dublin, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Betadine</td><td>Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올 용액&nbsp;</td><td>Gold Shield, Hayward, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1cc 루어락 주사기</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 게이지 캐뉼라</td><td>Shippert Medical, Centennial, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tenotomy scissors</td><td>Fine Science Tools, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 나일론 봉합</td>사 <td>Ethicon, Blue Ash, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate 완충 식염수</td><td>Gibco, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-CT 스캐너&nbsp;</td><td>지멘스 헬스케어, 플레즌튼, 캘리포니아</td><td></td><td></td></tr><tr><td>팬텀&nbsp;</td><td>TriFoil Imaging, Northridge, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 분석 소프트웨어</td><td>IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo International, Inc., 오하이오</td><td></td><td></td>주 콜럼버스</tr></tbody></table>

마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer는 몸 전체의 연부 조직 결손의 치료를 위해 외과 의사의 필수품 전반에 중요한 도구입니다. 지방은, 쉽게 사용할으로 쉽게 구할 수있는 저렴하고, 본질적으로 생체 적합성 그대로 이상적인 부드러운 조직 필러입니다. (1) 그러나, 그 싹 트는 인기에도 불구하고, 지방 이식술을 10에서 어디까지 공개 유지율과, 예측할 수없는 결과가 변수 이식 생존에 의해 방해된다 -80 %. 1-3 지방에 조사 래프팅을 촉진하기 위하여, 우리는 따라서 주입 된 지방 부피 보존 실시간 분석을 허용 동물 모델을 개발 하였다. 간단히, 작은 상처가 CD-1 누드 마우스의 두피에서 만든 가공 리포 애스 퍼 레이트의 200 ~ 400 μL은 두개골 위에 배치됩니다. 두피 때문에 에이즈 두 개관에서 제공하는 훌륭한 배경의 대비로 인해 고유의 피하 지방의 부재로받는 사이트로 선정하고,분석 과정. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)는베이스 라인에서 이식 2 주에 한 번씩 스캔하는 데 사용됩니다. CT 이미지는 재구성 및 이미징 소프트웨어는 그래프트 양을 정량화하는 데 사용된다. 전통적으로, 생체 외 기술은 실제 측정에 의해 그래프트 중량과 체적의 단지 하나의 평가를 제공하기 위해 연구 동물을 안락사 필요로 한 지방 그래프트 량을 평가. 생화학 적 및 조직 학적 비교는 마찬가지로 안락사 할 수있는 연구의 동물이 필요했다. 설명이 영상 법은 연구 동물을 희생하지 않고도 시각화 객관적 초기 그 래프팅 후에 여러 시점에서 볼륨을 정량화 이점을 제공한다. 이식 기술은 더 큰 위험과 지방 피부 괴사로 주입 될 수 이식편의 크기에 의해 제한된다. 이 방법은 지방 이식 가능성 및 볼륨 유지를 평가하는 모든 연구를위한 유틸리티를 가지고있다. 그것은 특히 providi에 적합하다지방 이식의 시각적 표현 겨와 시간에 따른 볼륨의 변화를 다음과 같습니다.

지방 이식은 점진적으로 8 주 스캔이 완료되면 주 (8) (그림 4A)로 62.2 %의 평균 생존율 (24)의 결과, 연구의 과정을 통해 볼륨 감소, 각 지방 이식은 하나의 조각으로 추출 하였다. Wilcoxan 순위 합 시험 중 마이크로 CT에 의해 얻어진 또는 물리적 질량으로부터 산출 이식 지방의 체적 측정의 차이를 비교하기 위해 사용 하였다. 유의 한 차이는 이러한 두 가지 방법 (양면 페이지 - 값 = 0.9362) 사이에서 발견되지 않았다. (그림 4B) 스캔 당 5 centiGy 다섯 스캔 시점으로, 각 마우스는 연구의 과정을 통해 25 centiGy 총보다는 더 이상 수신되지. 이과 일치, 마우스 중 어느 것도 피부 방사선 화상의 총 증거가 표시되지 않습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="alw...

지방 이식은 연조직 결핍을 재건하기 위한 필수 기술입니다. 그러나 이는 다양한 이식 생존을 특징으로 하는 예측할 수 없는 절차로 남아 있습니다. 우리의 목표는 지방 이식 준비 및 전달의 서로 다른 기술 간의 부피 유지를 비교하기 위해 새로운 이미징 방법을 활용하는 마우스 모델을 고안하는 것이었습니다.

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 CT를 사용하여 지방 이식 준비와 전달의 지연 기술 간의 부피 유지를 비교하는 마우스 모델을 설명하는 것입니다. 이것은 이식할 준비가 된 지방을 얻기 위해 먼저 인간 lipo aspirate를 처리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 CD 1 개의 흉선 누드 마우스의 두피에 지방 이식편을 삽입하는 것입니다.다음으로, CT 스캔 마우스, 이미지 재구성 및 볼륨 유지를 정량화하여 매주 지방 이식 생존을 분석합니다. 마지막 단계는 8주가 끝날 때 지방 이식을 설명하고 체중 및 조직학별로 비교하는 것입니다. 궁극적으로 마이크로 CT와 조직학은 지방 이식의 질과 생존율의 차이를 보여주기 위해 사용됩니다.지방 이식편의 계량과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 연구 동물을 희생하지 않고도 초기 이식 후 여러 시점에서 지방 이식 부피를 시각화하고 객관적으로 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 마이크로 CT를 사용하여 calva Defects를 분석하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 기술의 의미는 지방 이식, 유지 및 생존력을 평가하는 모든 연구에 대한 수술 모델을 제공한다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 두피 위의 올바른 위치에 지방 이식편을 포함하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 기술의 시각적 시연은 기술의 작은 편차가 결과를 바꿀 수 있는 수많은 단계가 있기 때문에 이식 및 재구성 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. Coleman 절차를 사용하여 선택적 지방 흡입술을 받는 건강한 여성 환자의 복부, 옆구리 및 허벅지 부위에서 인간 지방 조직을 채취합니다.이식을 위해 lipo 흡인을 처리하려면 먼저 지방이 30분 동안 가라앉도록 합니다. 리포 흡인은 일반적으로 위쪽에 기름, 중간에 지방, 아래쪽에 혈액이 있는 세 개의 층으로 침전됩니다. 흡입하고 상단 오일층을 버린 다음 하단 혈액층을 버립니다.남아 있는 tumescent 유체 또는 세포 파편을 추가로 제거하려면 350Gs 및 섭씨 4도에서 5분 동안 지방을 원심분리합니다. 원심분리 후 하단 혈액층과 상단 오일층을 흡인합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이식에 필요한 지방의 양을 계산하기 위해, 지방 이식을 수행하기 위해, 암컷 동형접합 CD 누드 마우스 1마리를 얻는다.실험 연구의 경우 생후 8주에서 12주 사이의 쥐를 선택하여 마취를 유도합니다. 마우스의 호흡 속도가 느려지면 약 10분 동안 분당 2리터의 불소 산소 혼합물 2.5%is가 있는 녹다운 박스에 마우스를 넣습니다. 발가락 꼬집기로 적절한 진정제를 확인하십시오.마우스의 양쪽 눈에 수의학 윤활 안과 연고를 바르고 마우스의 코를 콧방울에 넣어 분당 1-2리터의 속도로 2.5%ISO 불소 산소 혼합물을 전달합니다. 다음으로, 마우스 아래에 멸균 필드를 설정합니다. 그런 다음 2.5% 포비돈 요오드로 두피를 살균한 다음 70% 에탄올 용액을 투여합니다.살균을 두 번 더 반복합니다. 실온과 평형을 이룬 1ml의 지방이 든 1ml의 루어 잠금 주사기를 다시 로드합니다. 14 게이지 8cm 길이의 지방 이식 캐뉼라를 주사기 끝에 연결합니다.주사기에 200-400마이크로리터의 지방이 남을 때까지 주사기 플런저를 눌러 시스템을 프라임합니다. 주사기 플런저를 누르면서 미세한 집게를 사용하여 원위 캐뉼러 구멍에서 나오는 지방을 관찰하여 캐뉼라가 지방으로 완전히 채워졌는지 확인합니다. 두개골의 가장 큰 측면 위에 놓인 정중선의 등쪽 피부를 들어 올립니다.가는 가위를 사용하여 피부를 1.5mm 정도 자릅니다. 상처 중간에 6개의 나일론 봉합사를 놓으면 나중에 상처 가장자리를 함께 가져오는 데 사용됩니다. 이식 후 봉합사를 묶지 마십시오.그런 다음 피부 절개를 통해 캐뉼라를 삽입하고 두개골 위에 부채꼴 모양의 패턴으로 캐뉼라를 앞뒤로 통과시켜 두개골 위에 있는 피부에 대한 결합 조직 부착을 해제하여 두개골 위에 있는 피부에 대한 결합 조직 부착을 해제하여 두개골 위에 피하 포켓을 만들고, 끝이 포켓의 테라모스 측면에 놓일 때까지 캐뉼라를 두개골 바로 위의 마우스 정중선에 배치합니다. 눈 사이에 그려진 선 바로 뒤에 있어야 합니다. 역행 방식으로 지방을 천천히 주입하여 캐뉼러를 뒤로 당기면서 플런저를 전진시킵니다. 집게를 사용하여 상처 가장자리를 함께 가져와서 주머니에서 지방이 새어 나오지 않도록 들어 올립니다.이전에 놓인 봉합사를 묶고 첫 번째 매듭이 피부에 가볍게 닿도록 합니다. 사각형 매듭을 세 개 더 묶고 3mm 꼬리로 봉합사를 자릅니다. 마취에서 마우스를 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 복구를 진행합니다.첫 번째 스캔을 수행하기 전에 공기, 물 및 뼈 강도를 구별하는 이미징 팬텀으로 마이크로 CT를 보정합니다. 보정 후. 4개의 마우스를 복부 위치의 스캐너에 2개의 마우스가 위에, 2개의 마우스가 아래에 위치하도록 놓습니다.스캐닝 침대에 놓습니다. 이전에는 마우스 본체를 고정하기 위해 60ml 주사기로 제작되었으며 10ml 주사기는 노즈 콘으로 제작되었습니다. 스카우트 이미지를 통해 코에서 첫 번째 경추까지, 그리고 두개골 위에서 두개골 기저부까지 마우스의 전체 두개골이 이미지화될 것임을 확인합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스캔을 계속합니다. 픽셀 강도에 대한 임계값을 사용하여 복셀을 선택하여 관심 영역 또는 ROI를 생성할 수 있는 마이크로 CT 이미징 분석 소프트웨어로 재구성된 이미지를 엽니다. 먼저 재구성된 CT 이미지를 2차원, 관상, 축 방향 및 시상 뷰로 로드합니다.축 슬라이스를 가이드로 사용하여 지방 이식편의 가장 왼쪽 측면에 해당하는 시상 슬라이스로 이동합니다. 지방 이식편에 해당하는 모든 복셀을 캡처하지만 주변 조직과 뼈는 제외하는 픽셀 강도에 대한 상한 및 하한 임계값을 선택합니다. 지방 이식편에 해당하는 시상면(sagittal view)에서 ROI를 정의합니다.이전에 정의된 픽셀 강도 임계값을 사용하여 이식편의 가장 오른쪽 측면에 도달할 때까지 5번째 시상 절편마다 이 절차를 반복합니다. 다음으로, 모든 2D ROI에서 선택한 복셀을 단일 결합된 3D ROI로 보간하고, 소프트웨어가 계산한 ROI 볼륨을 기록합니다. 3D 등가곡면을 렌더링하여 최종 지방 이식 부피를 시각화합니다.후속 분석에서는 픽셀 강도 최대 및 최소 임계값을 8주차 시점에 대해 마우스를 스캔한 후 기준선 분석에 사용된 값과 동일하게 유지해야 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 안락사시킵니다. 건절개술 가위를 사용하여 마우스를 수술 필드에 놓고 주머니와 지방 이식편의 피부 및 결합 조직 부착물을 조심스럽게 엽니다.이 시점에서는 이식편의 발치를 돕기 위해 위에 있는 등쪽 피부의 일부를 절제하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 절제 후 이식편에서 채취한 결합 조직을 최소화하기 위해 절제 시 가능한 한 이식편에 가깝게 유지하십시오. 최소 0.01g까지 정확한 찢어진 저울로 질량을 측정합니다.지방 이식은 연구 기간 동안 점진적으로 감소하여 8주차까지 평균 생존율이 62.2%에 이르렀습니다. 8주차 스캔이 완료되면, 각 지방 이식편을 한 조각으로 추출했습니다. WIL 콕신 랭크 합계 테스트는 마이크로 CT로 얻은 지방 이식편의 부피 측정 또는 물리적 질량으로 계산된 부피 측정 간의 차이를 비교하는 데 사용되었습니다.이 두 방법 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행되면 세션당 2시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 이 절차를 따를 때마다 동일한 방식으로 수술과 재건을 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.면역 염색 및 Q-R-T-P-C-R과 같은 다른 방법을 수행하여 혈관성 및 유전자 발현이 다양한 이식 방법에 의해 어떻게 영향을 받는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 연속 이식을 위한 지흡입 처리 방법, 생체 내 CT 스캔 이식편, 이식편 생존을 평가하고 체중 조직학을 위한 이식편을 계획하는 방법, 개발 후 향후 분석 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 성형 수술 분야의 연구자들이 미러링 모델에서 지방 이식을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

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