암 약물 과민 반응의 효과를 평가 체외 및 생체

다음 실험의 전반적인 목표는 in vitro 세포 대사 및 in vivo 전이 빈도의 변화를 측정하여 암 약물 감작의 효과를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 시험관 내에서 암세포를 안티센스 분자로 transection하여 관심 표적을 knockdown함으로써 달성됩니다. 다음으로, 형질주입된 세포를 바이오센서 칩에 도금하고 대사 측정 시스템에 로드하여 약물 치료 중 산성화, 호흡 및 부착의 변화를 열거합니다.

이와 별도로, 형질주입된 세포는 약물로 처리되고 전이 빈도에 대한 영향을 평가하기 위해 닭 배아의 정맥 순환에 주입됩니다. 그 결과, 세포 대사와 전이 빈도의 변화로 설명되는 암 약물 감작을 보여줍니다. 이 기술은 약물 표적 또는 화합물에 대한 기존의 전임상 검사 중에 항상 고려되지 않는 매개변수를 동시에 평가할 수 있기 때문에 암 치료의 개발을 확장합니다.

이 방법은 DNA 복구와 관련된 새로운 약물 표적에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포주기 제어와 같은 다른 시스템의 표적 검증에도 적용할 수 있습니다. 멸균 환경에서 텍스트 프로토콜에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드로 종양 세포를 transection한 후 400마이크로리터의 PBS를 사용하여 6개의 바이오센서 칩을 조심스럽게 세척하고 칩을 살균하려면 PBS를 제거하고 400마이크로리터의 70% 에탄올 인큐베이트를 20분 동안 추가한 후 PBS를 사용하여 칩을 세 번 세척합니다. 각각 3개의 칩을 멸균 배양 접시에 넣고 대조군 및 관심 대상이라고 표시한 다음 유사한 방식으로 2개의 50ml 튜브에 레이블을 붙입니다.

다음으로, 적절한 부피의 0.25%트립신 EDTA를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 형질주입된 세포를 세척하고, 단층이 분리될 때까지 기다렸다가 세포 현탁액을 적절한 튜브로 옮깁니다. 세포를 계수한 후 배지를 추가하거나 세포를 농축하여 밀리리터당 5번째 세포까지 6.0 곱하기 10의 최종 농도에 도달하도록 부피를 조정합니다. 한 번에 한 그룹을 준비하여 각 바이오센서 칩에 250마이크로리터의 세포 용액을 추가합니다.

증발을 방지하기 위해 칩이 들어있는 멸균 접시를 습도 챔버 내부에 놓고 밤새 배양하여 텍스트 프로토콜 라벨 1450 millilit tubes에 자세히 설명 된 실험 개요에 따라 신진 대사 측정을 수행하고 50 ml의 성장, 중간 플러스 0.2 % FBS 및 1 x 페니실린 및 스트렙토 마이신을 추가합니다. 또는 추신. 하나의 신진대사 측정 시스템에 6개의 튜브를 배치하고, 다른 시스템에 6개의 튜브 랙을 배치하고, 나머지 튜브를 시스플라틴이 함유된 튜브가 들어 있는 세 번째 튜브 랙에 놓습니다. 공기 투과성 멤브레인을 사용하여 처음 두 랙을 밀봉하여 증발을 방지합니다.

다음으로, 0.2% FBS와 1개의 XPS가 있는 배지에 6마이크로몰 시스플라틴을 적절한 부피로 준비합니다. 필요한 부피의 매체를 라벨이 붙은 50밀리리터 튜브 4개에 분배하고 세 번째 대사 측정 튜브 랙의 슬롯 4개에 다시 넣습니다. 공기 투과성 멤브레인을 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.

6개의 50 밀리리터 튜브에 라벨을 붙이고 0.1%Triton X 용액 각각에 20 밀리리터를 추가합니다.매체에서 Triton X 용액은 남아 있는 셀을 놓고 각 칩에 대해 0 값을 제공합니다. 튜브를 네 번째 튜브 랙에 놓고 밀봉합니다. 그런 다음 칩을 바이오 모듈에 로드합니다.

두 개의 브랙을 두 개의 브랙 홀더에 넣은 다음 실험을 시작합니다. 세포 형질주입 2일차에 텍스트 프로토콜에 언급된 닭 배아를 준비한 후, 대조군 및 표적 관심 그룹을 비히클용 플라스크 2개와 시스플라틴용 플라스크 2개로 세분화합니다. 배지를 흡입하고 3ml의 신선, 중간 또는 중간과 6마이크로몰 시스플라틴을 사용하여 보충합니다.

플라스크는 6시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인하고, 세포를 세척 및 트립하여 항아리화하고, 세포 현탁액을 적절하게 표지된 4개의 15밀리리터 튜브로 옮기고, 회전시키기 전에 PBS를 사용하여 세포를 3번 세척하고, Resus는 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 계산 후 PBS를 사용하여 세포를 1.0 곱하기 10의 최종 농도로 농축하여 밀리리터 당 6 번째 세포로 농축합니다.

세포 현탁액을 주입용으로 표시된 5ml 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 24 9 일 된 닭 배아를 실체 현미경으로 주입하고 1 밀리리터 주사기에 연결된 유연한 튜브에 부착 된 유리 바늘을 사용하여 천천히 맥동하는 동작으로 주입합니다. 1.0 곱하기 100 마이크로 리터의 부피로 5 번째 세포에 100 배를 부드러운 닦음으로 choal toic membrane 또는 cam의 정맥 순환에 주입합니다.

주사 부위를 부드럽게 두드려 혈액의 흐름을 막고 스핀 유출을 흡수합니다. 형광 현미경으로 각 주입 후 각 배아 용기에 적절하게 라벨을 붙입니다. cam의 혈관 구조에서 형광 세포의 존재 및 분포를 확인합니다.

종양 세포의 수가 적어 보이거나 분포가 좋지 않은 배아를 주목하십시오. 마지막으로, 닭 배아를 습도 챔버에 넣고 7-9일 동안 배양한 후 여기에 나타난 바와 같이 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전이성 병소를 열거합니다.인간, SO 및 시스플라틴을 표적으로 하는 BRCA 2로 처리된 5 49개의 폐암 세포는 대조군 SO 및 시스플라틴만 투여받은 세포에 비해 호흡의 조기 및 비가역적 감소를 보였습니다. 대조군 투여군에 비해 39%의 감소는 세포 부착력의 검출 가능한 저하가 감지되기 약 10시간 전에 시작되었으며, 이는 세포 수의 변화와 무관하게 발생했으며 여기에서 입증된 바와 같이 세포 사멸에 선행하는 형성 사건일 수 있음을 시사합니다.

72시간 실험에서 산성화의 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 BRCA 2 A SO 및 시스플라틴 처리가 포도당 대사에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 시사합니다. 이 실험에서 인간 A 5 49 폐암 세포를 시스플라틴의 유무에 관계없이 대조군 A SO 또는 BRCA 2 A SO로 치료하고 캠의 정맥 순환에 주입했습니다. 9일 후, BRCA 2 a SO 및 시스플라틴으로 처리된 세포는 대조군 A SO와 시스플라틴 또는 BRCA 2 A SSO 단독으로 처리한 세포에 비해 전이성 병소 빈도가 77% 낮았으며, 이는 BRCA 2 a SO 및 시스플라틴 치료가 고형 종양 환자의 전이 부담을 줄이거나 예방할 수 있는 잠재력이 있음을 시사합니다.

이 절차에 따라 세포 증식, 분석 및 생체 내 이종 이식 연구와 같은 보다 전통적인 방법을 수행하여 약물 감수성 향상에 대한 특정 표적의 기여도를 추가로 조사할 수 있습니다.