Name: 암 약물 과민 반응의 효과를 평가 체외 및 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 학습하세요 암 약물 과민 반응 평가 방법을 체외 대사 측정과 생체 전이 빈도 분석을 통해 수행하는 기술입니다. 병아리 배아 모델을 활용하여 종양 세포 대사 변화와 전이 양상을 실시간으로 모니터링함으로써 항암제 효능을 종합적으로 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 우수 온타리오 센터와 온타리오 연구 기금 JK 보조금에 의해 가능하게되었다. 우리는 촬영하는 동안 기술 지원을 Siddika Pardhan 박사 피터 퍼거슨 감독에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 다음 프로토콜이 부착 세포와 함께 사용하도록 설계되었습니다. 수정은 정지에서 재배 비 부착 세포에 방법을 적용해야합니다. 프로토콜에 설명 된 CAM 실험은 형광 표지 (예를 들면, GFP, RFP 등)를 발현하는 세포와 함께 사용하도록 설계된다. 나인 일된 닭 배아 CAM 실험에 대한 실험 프로토콜의 2 일에 필요합니다. 1. 준비 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드와 종양 세포의 형질 (ASOS) <ol><li> 관심의 세포를 포함하는 T75 플라스크 (들)에서 대기음 매체는 1XPBS로 세척하고, 0.25 % 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 각 플라스크에 완전 성장 배지 10 ㎖를 첨가하고 50 ㎖ 튜브 용액에 세포를 옮긴다. 세포를 세어 최종 농도는 1 ㎖ 당 1.0 × 105 세포가되도록 양을 조정한다. </li><li> T25 플라스크의 라벨 두 그룹 : 한 그룹은 1-8 표시 여덟 플라스크를 포함하며, U 될 것입니다실시간 대사 측정 실험 SED; 두 번째 그룹은 8 주 형틀을 포함하고 닭 배아 CAM 실험에 사용한다. 인큐베이터에있는 각 플라스크 및 장소 (37 ° C, 5 % CO 2 O / N)에 솔루션 세포 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 다음날 아침 (주 0, 0 분), 라벨 세 5 ml의 튜브를 다음과 같이 제어 (비 대상 ASO 또는 siRNA를), &#39;관심의 대상&#39;(즉, 대상 ASO 또는 siRNA를), 리포 펙 타민 2000 (또는 유사한 형질 전환 시약). 적합한 튜브에서 무 혈청 배지로 적당한 농도 ASO 스톡 용액을 희석. <ol><li> 적절한 튜브에 형질 전환 시약의 요구량을 첨가하고, 5 분 동안 무 혈청 배지에서 배양한다. ASO 튜브에 형질 전환 시약 솔루션을 추가하고 20 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 각 그룹에서 플라스크 1-4의 각 제어 ASO 형질 전환 시약 용액 250 μl를 추가, 250각각의 그룹 내의 5-8 플라스크 각각에 &#39;관심 대상&#39;ASO 형질 감염 시약 용액 μL. 4 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어. <ol><li> 배양하는 동안, 2.1 절에 설명 된 단계를 수행한다. 배양 후, CAM 실험 그룹의 각 플라스크에 완전 배지 3 ㎖을 추가하고 인큐베이터로 복귀 O / N (37 ᵒC, 5 % CO 2). 2.2 절에 설명에 따라 대사 실험 그룹을 처리합니다. 섹션 4의 설명에 따라 설정 CAM 실험을 처리합니다. </li></ol></li></ol> 2. 바이오 센서 칩 준비 및 셀 시드 <ol><li> 무균 환경에서 조심스럽게 PBS 400 ㎕의 여섯 바이오 센서 칩을 씻는다. 20 분 동안 70 % 에탄올 400 μL와 칩 멸균. PBS의 400 μL로 3 회 세척 할 것. <ol><li> 무균 조직이 배양 내부의 칩을 배치전자 요리 오염을 방지합니다. &#39;제어&#39;라고 표시된 접시에 세 개의 칩을 놓고 &#39;관심의 대상&#39;이라는 레이블이 붙은 접시에 세. </li></ol></li><li> &#39;제어&#39;와 &#39;관심의 대상&#39;으로 두 개의 50 ㎖ 튜브 레이블. PBS로 세포를 씻으 0.25 % 트립신 / EDTA의 적절한 볼륨을 추가합니다. 단일 층 분리 될 때까지 기다린 후 각 플라스크에서 세포를 수집합니다. 적절한 튜브에 용액을 증착. <ol><li> 세포를 세어 6.0x10 최종 농도가 105 세포 / ㎖가되도록 양을 조정한다. 초기 농도가 너무 낮 으면 원심 분리하고 세포를 재현 탁. </li></ol></li><li> (칩당 1.25x10 5 세포의 총) 해당 그룹의 각 바이오 센서 칩에 셀 용액 250 μL를 추가한다. 칩 혼란의 위험을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 그룹이 태스크를 수행한다. 증발을 방지하기 위하여 습도 챔버 내부의 칩을 함유하는 멸균 접시를 놓은 습도 차를 배치mber 인큐베이터에서 O / N (37 ᵒC, 5 % CO 2). </li><li> 이튿날 아침 (주 1)은, 각 칩으로부터 신중 매체 대기음 0.2 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 및 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 성장 배지 250 μL로 대체. 4 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어. </li></ol> 3. 대사 측정 시스템 준비 및 솔루션 준비 <ol><li> 배양 중에 필요한 약액과 다가오는 대사 분석 용 측정 시스템을 준비한다. 참고 : 대사 측정 시스템은 여섯 모듈의 총이 포함되어 있습니다. 각 모듈은 실험 당 하나의 칩을 수용한다. <ol><li> 다음 실험 그룹으로 분석 세분 : 하나의 칩을 &#39;제어&#39;와 분석의 기간 동안 차량을받을 수있는 그룹 &#39;관심의 대상&#39;에서 각각; 각 그룹은 두 개의 칩 중 소정의 기간에 대한 약물 치료를받을ssay, 세척 기간 동안 차량 하였다. </li><li> 감작 약물 연구의 경우, 해당 특정 약물에 맞는 약물 치료의 길이, 타이밍 및 농도를 변경. 주 : 시스플라틴의 경우, 다음 단계는 A549 세포와 경험적으로 결정하고, 세포주에 따라 달라질 수있다. 4 μL / 분의 기본 유량을 갖는 모든 단계를 수행한다. 성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S 6 HR 매체에서 6 μM 시스플라틴의 24 시간 + 0.2 % FBS 1 배 P / S 성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S에 24 시간 성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S (18)의 HR 0.1 % 트리톤 X의 4 시간 참고 :이 단계로부터의 편차 원하는 유량과 실험의 지속 기간에 기초하여 중간 및 약물 용액의 필요한 양을 결정하기 위해 계산을 필요로 할 것이다. 다음 섹션은 위에서 설명 된 단계를 기준으로합니다. </li></ol></li><li> 라벨 및 성장 배지 + 0.2 % FBS를 50 ml의 열네 50 ㎖ 튜브를 채우기D 1 배 P / S. 한 대사 측정 시스템 튜브 랙에 여섯, 다른 여섯, 또한 시스플라틴과 튜브가 들어 세 번째 튜브 랙의 나머지 두 놓습니다. 증발을 방지하기 위하여 공기 투과성 막을 처음 두 실 랙. </li><li> 1 배 P / S 중간 + 0.2 % FBS에서 (해당 볼륨의) 6 μM 시스플라틴의 솔루션을 준비합니다. 네 표지 50 ㎖ 튜브에 시스플라틴 용액의 필요한 양을 분배. <ol><li> 세 번째 대사 측정 튜브 랙에 남아있는 4 개의 슬롯에 튜브를 놓습니다. 튜브가 원하는 biomodules에 해당하는 해당 슬롯에 배치되어 있는지 확인합니다. 공기 투과 막으로 튜브를 밀봉합니다. </li></ol></li><li> 준비하고 여섯 50 ㎖ 튜브에 라벨을 20 ml의 배지에서 0.1 % 트리톤-X 솔루션의 각각을 입력합니다. 트리톤-X 솔루션은 남아있는 세포를 용해하고 각각의 칩에 대한 &#39;제로&#39;가치를 제공 할 것입니다. 네 번째 대사 측정 단위 튜브 랙에 튜브를 삽입하고 재치 밀봉H 과도한 증발을 방지하기 위해 공기 permable 막. </li><li> biomodules에 칩을 넣고 실험을 시작합니다. </li></ol> 4. CAM 실험 약물 치료와 주사 참고 : CAM 실험을위한 닭 배아를 준비하는 단계와 절차는 다른 19 설명되어 있습니다 <ol><li> CAM 실험 48 시간 후 - 형질 전환 (2 일)을 처리하기 시작합니다. 두 차량 플라스크 및 시스플라틴 두에 &#39;제어&#39;와 그룹 &#39;관심의 대상&#39;을 하위 나눕니다. 플라스크에서 매체를 대기음 3 신선한 매체의 ml의, 또는 6 μM 시스플라틴 (cisplatin) 중 하나와 함께 보충. 6 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어. </li><li> 세척 한 후, 매체를 대기음 세포를를 Trypsinize; 네 적절하게 레이블 15 ml의 튜브에 용액에 트립신 세포를 수집합니다. <ol><li> 원심 분리기와 PBS로 세포를 세 번 씻는다. PBS 5ml에 세포 펠렛을 다시 일시세포를 카운트 좋아. </li><li> 최종 세포 농도가 1.0 × 6 세포 / ml가되도록 양을 조정한다. 주입 표지 5 ml의 튜브에 세포 솔루션을 전송하고 얼음에 배치합니다. 세포가 잘 혼합되도록 조심스럽게 주입 전에 튜브를 전환. </li></ol></li><li> 주사 (9 일 이전) (24) 닭의 배아 (그룹 당 6)의 총을 옆으로 설정합니다. 1 ml의 시린지에 연결된가요 성 튜브에 부착 된 유리를 사용하여 바늘 주사를 수행한다. 주입을 수행하는 개별 처리 그룹 멀게한다. <ol><li> 스테레오 현미경을 이용하여, CAM의 정맥 순환에 1.0 × 100 μL 부피의 5 세포를 주입. 세포의 전체 볼륨을 주입하는 속도가 느린, 맥동 기술을 사용합니다. 부드러운 혈액의 흐름을 줄기 및 유출을 흡수 닦아 부드럽게 주사 부위를 가볍게 두 드리십시오. 적절하게 각 주입 다음 각 배아 컨테이너 레이블. </li></ol></li><li> 존재와 DISTRI 확인CAM의 혈관 세포의 형광 bution는 형광 현미경을 사용하여 가시화하여 주 사후. 종양 세포의 수가 적을 나타나거나 유통이 좋지있는 모든 배아에주의하십시오. </li><li> 습도 챔버에서 닭 배아를 놓고 인큐베이터 (37 ° C, 습도 60 %)에 저장합니다. 전이성 초점을 열거하기 전에 7~9일 기다립니다. </li></ol> 5. 전이성 초점 열거 <ol><li> 7~9일 배양 기간 동안 배아를 모니터링하고 죽은 사람을 버린다. 습도 챔버는 배양 기간 동안 항상 습기가 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 20X 배율 스테레오 형광 현미경을 이용하여, 정규, 격자 형상의 패턴으로 배아 CAM의 전체 상부 표면을 스캔. </li><li> 다음 배아 당 최종 총 수를 집계, 뷰의 각 필드에 전이 병소의 수를 계산합니다. 각 그룹의 여섯 배아 이렇게하면 평균 O를 제공 할 것입니다치료 당 F 전이성 초점. </li></ol>

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때문에 임상 시험과 관련된 고유의 비용과 위험에, 더 적절하게 신규 항암 치료법을 평가하기위한 예비 임상 시험 방법론보다 엄격한 개발이 요구된다. 현재 일반적으로 사용되는 기술 덜 효과​​적 일 수있다 모든 전시 잠재적으로 유망한 치료 대상 / 에이전트를 구별하는 능력을 제한 할 수 있습니다 약점, 그리고 그. 우리는 기존 방식의 많은 단점을 해결 새로운 항암 접근법을 평가하는 프로토콜을 고안했다. 설명 프로토콜의 특히 중요한 기능은 실시간으로 세포 반응을 측정하고, 분에 의해 신진 대사와 고수 분의 변화를 추적 할 수있는 기능입니다. 이것은 피크 약물 효과, 최적 투여 식별 및 조합 약물 치료의 구성 요소들 사이의 상호 작용의보다 상세한 이해를 위해 허용한다. 동시에, 그것은 discre에 대한 통찰력을 제공합니다셀 카운팅, 아폽토시스, 또는 염료 변환 분석법에 의해 제공되지 않은 정보는 암세포, 테 대사 변화. 이 분석의 한계를 정확하게 약물 치료 중에 발생되는 세포사의 ...

세포 독성 암 치료는 치료 실패, 재발로 이어질 수있는 중요한 임상 적 문제가 대상 및 / 또는에 대한 내성을 획득하고, 환자 사망률 1 증가했다. 대부분의 종양에서 이질성의 높은 수준을 고려할 때, 충분히 높은 세포 수의 종양은 그 세포가 생존 2,3- 대해 의존하는 분자 경로를 표적으로 단일 또는 조합 요법에 내성 세포의 서브 세트를 포함 할 것이다 수학적 확실성이다. 종양 세포에 긍정적 재발 선도, 치료 기간 동안 선택 될 수있다. 동시에 전 또는 치료 매개 선택 이후에, 다른 암 세포 생존 메카니즘을 대상 신규 치료법의 개발은, 따라서 임상 적으로 중요한 것이다. 종양에서 게놈의 불안정성 게놈 돌연변이의 높은 수준의 비 종양 (4) 숙주 세포로부터 암세포를 구별 기본적인 특징이다. 따라서, usefu- DNA 손상 화학 요법의 효능을 증가시키는 저항의 발생을 예방하기 위해 L 전략 적극적 종양 세포 5 DNA 복구를 억제하는 것이다. 이것은 예비 임상 탐구되고 조사 및 신규 DNA 복구 다양한 대상의 활성 필드이다. 이들 소분자 또는 안티센스 표적 계 억제제의 수는 개발되어 6-8 테스트 겪고있다. 목적은 임상 시험에서 안전성과 효능을 가장 유망한 전임상 후보를 식별하고 평가하는 것입니다. 임상 시험의 고비용 (차선 전임상 평가를 포함한 여러 이유로) 실패의 위험이 새로운 치료법의 개발에 9 진행 강력한 장애물이다. 적절히 치료 대상 및 새로운 약물 후보를 평가할 수있는 적절하고 엄격한 전임상 모델의 사용은 임상 시험 (10)의 높은 실패율을 감소시킬 수있다 </suP&gt;. 시험 관내 (세포 증식 분석법) 종양 세포의 능력에있어서, b) 치료 - 유도 환원에서 종양 세포의 증식을 감소시키는 능력) 측정 : 일부 공통적으로 사용 전임상 방법은 신규 한 항암 요법의 효과이다을 평가 폼 조직 배양 콜로니 (콜로니 형성 어 세이) 시험 관내 (레 독스 염료 변환) 시험 관내 종양 세포 사멸, d) 요법 - 유도 유도 (세포 사멸, 괴사가 포식이 연관된 종양 세포 대사 활동에있어서, c) 요법 - 유도 환원 생체 내에서 유사 분열 등) (11), 전자)와 함께 인간과 마우스 이종 이식 12-14의 성장 또는 절제의 감소를 치료 유도. 체외 나열된 방법 중 가장 큰 문제점은 이들 중 어느 것도 후보 치료제의 효과를 실시간 평가를 제공하지 않는다는 것이다. 오히려, 그들은 단지 선택된 넓게 분리 된 시점에서 정보를 제공 할치료 과정 동안. 이러한 측정은 정확하게 종양 세포 반응의 강도 및 타이밍을 반영하는 능력을 감소 하였다. 생체 내 마우스 이종 이식 모델은 또한 높은 비용, 완료하는 시간의 길이, 차선 투여 및 치료시기 (스케줄링)의 위험에 의해 제한된다. 또한, 설치류 이종 이식 모델 차 인간 종양 세포의 반응을 시험 관내 평가와 비교하여 인간에서의 임상 효능 한정 예측 및 후보 치료 개입 (15, 16)에 확립 된 인간 종양 세포주가 있다는 증거가있다. 우리는 위에서 설명한보다 일반적인 절차의 단점을 해결하는 방식으로, 예비 임상 신약 조합을 평가하기 위하여 새로운 조합 프로토콜을 고안했다. 증식, 콜로니 형성 또는 산화 환원 염료 변환 분석 대신에, 우리는 실시간으로 세포 부착, 호흡, 산성화를 분석 대사 측정 유닛을 이용전체 치료 기간 동안 17. 동시에, 우리는 닭 배아 침윤 및 전이의 융모 18,19 막 (CAM) 모델을 사용하여 생체 내에서 조합 치료의 효과를 조사 하였다. 우리는 일반적으로 사용되는 화학 요법 약물 시스플라틴의 효과를 강화시키는 데 BRCA2 타겟팅 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASO)의 능력을 평가하기 위해 다음 방법을 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>A549 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>AeraSeal film</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Antisense oligodeoxynucleotides</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 타겟 서열: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biosensor Chips</td><td>Bionas GmbH 및 Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Bionas Discovery 2500 System&nbsp;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr> <tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr>현지<td></td><td></td>에서 <td>조달한</td><td>수정된 닭 달걀</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen - 라이프 테크놀로지스&nbsp;</td><td>12566014</td><td></td></tr><tr><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>트립신(0.25%)/EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

이질성 때문에 동일한 경로를 대상으로 인간의 암 치료 단독 투여 또는 조합 요법에 내재 돌연변이 하이 레벨로, 실패 할 가능성이있다. 중점 치료에 고유 및 / 또는 적응 저항에 대한 책임이 있습니다 경로의 억제에 배치해야합니다. 조사의 활성 필드는 일반적으로 개발 및 화학 요법과 방사선 요법을 사용의 작용을 촉진하고, 내성을 방지 DNA 수리 억제제의 시험이다. 우리는 DNA 손상 약물 시스플라틴에 종양 세포를 감작하는 수단으로 BRCA2 억제의 효과를 평가하기 위해 신규 한 프로토콜을 사용했다. 종양 세포 대사 (호흡 산성화)는 분 단위로 분에 치료 효과를 묘사하기 위해 72 시간 동안 실시간으로 모니터링 하였다. 조합에서, 우리는 닭 배아 융모 막 (CAM) 혈관 외 유출과 침략의 모델을 이용하여 전이 주파수의 평가를 수행 하였다. 이프로토콜은 새로운 암 치료 요법을 평가하기 위해 생체 외 및 생체 방법에 사용되는 일반적으로의 약점 중 일부를 해결합니다. 이는 이러한 세포 증식 분석, 세포 사멸 분석과 같은 일반적인 방법에 더하여 사용될 수 있으며, 생체 내 뮤린 이종 이식 연구에서 더욱 밀접 후보 타겟 및 에이전트들 사이를 구별하고, 또한 개발을위한 가장 유망한 후보를 선택한다.

결과 및 수치는 출판 일 (22)의 허가 적응. BRCA2 억제 시스플라틴 처리 된 종양 세포 호흡의 감소를 유도 ASO를 BRCA2가 타겟팅 및 시스플라틴 단독 제어 ASO 시스플라틴을받은 세포에 비해 호흡에서 이른 감소 및 비가역을 나타내 처리 인간 A549 폐암 세포; 처리 된 세포를 시스플라틴 치료 24 시간 BRCA2 ASO 제어 ASO 호흡 사이의 차이 후 39 % (도 1a)이었다. 중요한 것은, 호흡 감소는이 세포 수의 변화와 무관 발생한 것을 시사 세포 부착에서 검출 드롭 전에 시작했다. 호흡은 호흡 저하는 세포 사멸 (그림 1B)를 앞에 조형 이벤트가 될 수 있음을 시사 접착의 첫 번째 관찰 드롭이 약 10 시간을 감소하기 시작했다. 교류에 차이 없음idification은 BRCA2 ASO와 시스플라틴 치료가 당...

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

다음 실험의 전반적인 목표는 in vitro 세포 대사 및 in vivo 전이 빈도의 변화를 측정하여 암 약물 감작의 효과를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 시험관 내에서 암세포를 안티센스 분자로 transection하여 관심 표적을 knockdown함으로써 달성됩니다. 다음으로, 형질주입된 세포를 바이오센서 칩에 도금하고 대사 측정 시스템에 로드하여 약물 치료 중 산성화, 호흡 및 부착의 변화를 열거합니다.이와 별도로, 형질주입된 세포는 약물로 처리되고 전이 빈도에 대한 영향을 평가하기 위해 닭 배아의 정맥 순환에 주입됩니다. 그 결과, 세포 대사와 전이 빈도의 변화로 설명되는 암 약물 감작을 보여줍니다. 이 기술은 약물 표적 또는 화합물에 대한 기존의 전임상 검사 중에 항상 고려되지 않는 매개변수를 동시에 평가할 수 있기 때문에 암 치료의 개발을 확장합니다.이 방법은 DNA 복구와 관련된 새로운 약물 표적에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 세포주기 제어와 같은 다른 시스템의 표적 검증에도 적용할 수 있습니다. 멸균 환경에서 텍스트 프로토콜에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드로 종양 세포를 transection한 후 400마이크로리터의 PBS를 사용하여 6개의 바이오센서 칩을 조심스럽게 세척하고 칩을 살균하려면 PBS를 제거하고 400마이크로리터의 70% 에탄올 인큐베이트를 20분 동안 추가한 후 PBS를 사용하여 칩을 세 번 세척합니다. 각각 3개의 칩을 멸균 배양 접시에 넣고 대조군 및 관심 대상이라고 표시한 다음 유사한 방식으로 2개의 50ml 튜브에 레이블을 붙입니다.다음으로, 적절한 부피의 0.25%트립신 EDTA를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 형질주입된 세포를 세척하고, 단층이 분리될 때까지 기다렸다가 세포 현탁액을 적절한 튜브로 옮깁니다. 세포를 계수한 후 배지를 추가하거나 세포를 농축하여 밀리리터당 5번째 세포까지 6.0 곱하기 10의 최종 농도에 도달하도록 부피를 조정합니다. 한 번에 한 그룹을 준비하여 각 바이오센서 칩에 250마이크로리터의 세포 용액을 추가합니다.증발을 방지하기 위해 칩이 들어있는 멸균 접시를 습도 챔버 내부에 놓고 밤새 배양하여 텍스트 프로토콜 라벨 1450 millilit tubes에 자세히 설명 된 실험 개요에 따라 신진 대사 측정을 수행하고 50 ml의 성장, 중간 플러스 0.2 % FBS 및 1 x 페니실린 및 스트렙토 마이신을 추가합니다. 또는 추신. 하나의 신진대사 측정 시스템에 6개의 튜브를 배치하고, 다른 시스템에 6개의 튜브 랙을 배치하고, 나머지 튜브를 시스플라틴이 함유된 튜브가 들어 있는 세 번째 튜브 랙에 놓습니다. 공기 투과성 멤브레인을 사용하여 처음 두 랙을 밀봉하여 증발을 방지합니다.다음으로, 0.2% FBS와 1개의 XPS가 있는 배지에 6마이크로몰 시스플라틴을 적절한 부피로 준비합니다. 필요한 부피의 매체를 라벨이 붙은 50밀리리터 튜브 4개에 분배하고 세 번째 대사 측정 튜브 랙의 슬롯 4개에 다시 넣습니다. 공기 투과성 멤브레인을 사용하여 튜브를 밀봉하십시오.6개의 50 밀리리터 튜브에 라벨을 붙이고 0.1%Triton X 용액 각각에 20 밀리리터를 추가합니다.매체에서 Triton X 용액은 남아 있는 셀을 놓고 각 칩에 대해 0 값을 제공합니다. 튜브를 네 번째 튜브 랙에 놓고 밀봉합니다. 그런 다음 칩을 바이오 모듈에 로드합니다.두 개의 브랙을 두 개의 브랙 홀더에 넣은 다음 실험을 시작합니다. 세포 형질주입 2일차에 텍스트 프로토콜에 언급된 닭 배아를 준비한 후, 대조군 및 표적 관심 그룹을 비히클용 플라스크 2개와 시스플라틴용 플라스크 2개로 세분화합니다. 배지를 흡입하고 3ml의 신선, 중간 또는 중간과 6마이크로몰 시스플라틴을 사용하여 보충합니다.플라스크는 6시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인하고, 세포를 세척 및 트립하여 항아리화하고, 세포 현탁액을 적절하게 표지된 4개의 15밀리리터 튜브로 옮기고, 회전시키기 전에 PBS를 사용하여 세포를 3번 세척하고, Resus는 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 계산 후 PBS를 사용하여 세포를 1.0 곱하기 10의 최종 농도로 농축하여 밀리리터 당 6 번째 세포로 농축합니다.세포 현탁액을 주입용으로 표시된 5ml 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 24 9 일 된 닭 배아를 실체 현미경으로 주입하고 1 밀리리터 주사기에 연결된 유연한 튜브에 부착 된 유리 바늘을 사용하여 천천히 맥동하는 동작으로 주입합니다. 1.0 곱하기 100 마이크로 리터의 부피로 5 번째 세포에 100 배를 부드러운 닦음으로 choal toic membrane 또는 cam의 정맥 순환에 주입합니다.주사 부위를 부드럽게 두드려 혈액의 흐름을 막고 스핀 유출을 흡수합니다. 형광 현미경으로 각 주입 후 각 배아 용기에 적절하게 라벨을 붙입니다. cam의 혈관 구조에서 형광 세포의 존재 및 분포를 확인합니다.종양 세포의 수가 적어 보이거나 분포가 좋지 않은 배아를 주목하십시오. 마지막으로, 닭 배아를 습도 챔버에 넣고 7-9일 동안 배양한 후 여기에 나타난 바와 같이 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전이성 병소를 열거합니다.인간, SO 및 시스플라틴을 표적으로 하는 BRCA 2로 처리된 5 49개의 폐암 세포는 대조군 SO 및 시스플라틴만 투여받은 세포에 비해 호흡의 조기 및 비가역적 감소를 보였습니다. 대조군 투여군에 비해 39%의 감소는 세포 부착력의 검출 가능한 저하가 감지되기 약 10시간 전에 시작되었으며, 이는 세포 수의 변화와 무관하게 발생했으며 여기에서 입증된 바와 같이 세포 사멸에 선행하는 형성 사건일 수 있음을 시사합니다.72시간 실험에서 산성화의 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 BRCA 2 A SO 및 시스플라틴 처리가 포도당 대사에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 시사합니다. 이 실험에서 인간 A 5 49 폐암 세포를 시스플라틴의 유무에 관계없이 대조군 A SO 또는 BRCA 2 A SO로 치료하고 캠의 정맥 순환에 주입했습니다. 9일 후, BRCA 2 a SO 및 시스플라틴으로 처리된 세포는 대조군 A SO와 시스플라틴 또는 BRCA 2 A SSO 단독으로 처리한 세포에 비해 전이성 병소 빈도가 77% 낮았으며, 이는 BRCA 2 a SO 및 시스플라틴 치료가 고형 종양 환자의 전이 부담을 줄이거나 예방할 수 있는 잠재력이 있음을 시사합니다.이 절차에 따라 세포 증식, 분석 및 생체 내 이종 이식 연구와 같은 보다 전통적인 방법을 수행하여 약물 감수성 향상에 대한 특정 표적의 기여도를 추가로 조사할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.

항암 약의 특이성 평가<em&gt; 체외</em

비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

EGFR TKI와 암 세포에서 메트로 TKI 듀얼 저항을 설정 하기 위한 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 이 방식은 메트로 증폭 EGFR TKI 치료에도 불구 하 고 질병의 진행을 전시 EGFR 돌연변이와 환자에 대 한 치료를 개발 하는 데 유용 합니다. 그것은 또한 다른 분자를 대상으로 하는 저 해제에 대 한 수정할 수 있습니다.

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

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이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

학습하세요 암 약물 과민 반응 평가 방법을 체외 대사 측정과 생체 전이 빈도 분석을 통해 수행하는 기술입니다. 병아리 배아 모델을 활용하여 종양 세포 대사 변화와 전이 양상을 실시간으로 모니터링함으로써 항암제 효능을 종합적으로 평가할 수 있습니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가

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