장간막 림프 덕트 유관 쥐 모델 : 창자 림프 약물 운송의 평가에 응용

본 실험 절차의 전반적인 목적은 장내 투여 후 지질 및 약물이 장 림프계로 운송되는 속도와 정도를 평가하는 것입니다. 이를 위해 우선 장간막 림프관을 분리하고 캐뉼라를 삽입하여 림프액을 수집합니다. 두 번째 단계에서는 십이지장에 캐뉼라를 삽입하여 장내 주입이 가능하게 하고, 이어 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 혈액 샘플을 수집할 수 있도록 합니다.

마지막 단계에서는 실험적 처치물을 십이지장으로 투여하고, 전신 지질 또는 약물 농도를 정량화하기 위해 림프액과 혈액을 수집합니다. 궁극적으로 이 모델은 장내 투여 후 지질 및 약물의 총 흡수량과 장 림프 수송을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장간막 림프관을 직접 캐뉼레이션하여 전체 실험 기간 동안 림프액을 수집할 수 있다는 점입니다.

이를 통해 장간막 림프관으로 유입되어 흐르는 절대적인 물질의 양을 추정할 수 있습니다. 생체 내에서, 이 모델은 약물 및 지질 수송의 in vivo 평가를 가능하게 합니다. 또한, 관심 있는 모든 인자의 장 림프 수송을 측정하거나, 다양한 자극 또는 질환 상태에 반응하여 이러한 인자들의 림프 수송이 어떻게 변화하는지 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

장간막 림프관의 캐뉼라 삽입은 관이 작고 취약하며, 특히 금식한 동물에서는 더욱 복잡하고 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시연 절차는 여기 모나쉬 대학교의 동료 교수인 Natalie cus 박사와 해당 연구 그룹의 선임 박사후 연구원인 LJ Hugh 박사가 진행하겠습니다. 수술 전날, 캐뉼라를 적절한 길이로 자르고 멸균 수술용 칼날을 사용하여 각 튜브 끝부분에 베벨(사선)을 만듭니다. 다음으로, 십이지장 내 캐뉼라를 준비하기 위해 캐뉼라를 스스로 되돌아오게 고리 모양으로 구부린 후, 캐뉼라에 열을 가해 튜브에 고정 지점을 만듭니다.

수술 당일, 마취된 성체 랫드의 복부 우측, 목 및 좌측 쇄골 부위의 털을 제거한 후, 림프관 캐뉼라 삽입을 위해 포비돈 요오드 용액과 70% ethanol로 세 차례 연속 세척하여 수술 부위를 무균적으로 소독합니다. 동물의 우측이 위를 향하게 배치하고, 멸균된 메스 날을 사용하여 검상돌기부터 늑골 하단 약 2cm 아래의 우측 옆구리까지 4cm 길이로 직선 절개하여 복근벽의 상층을 엽니다. 소장을 좌측 복벽 아래로 밀어내고, 생리 식염수에 적신 2~3장의 멸균 거즈를 사용하여 소장을 고정합니다.

그런 다음 오른쪽 신장 높이에서 동물의 등 아래에 가로로 놓인 10 milliliter 플라스틱 주사기 위에 쥐를 걸쳐 놓습니다. 장간막 림프관의 시각화를 돕기 위해, 오른쪽 신장에 수직이며 암적색으로 박동하는 장간막 동맥의 바로 앞쪽(rostral)에 평행하게 위치한 직경 약 0.5 to 1 millimeter의 상장간막 림프관을 찾습니다. 여기에서 보여주는 것처럼 단식을 하지 않은 쥐의 경우, 상장간막 림프관은 흰색의 불투명한 상태이며 감염된 쥐보다 시각화하기가 더 쉽다는 점에 유의하십시오.

다음으로, 우측 신장의 하단 가장자리에서 상장간막 림프관(superior mesenteric lymph duct)과 평행하게 회음부 지방층을 통과시킨 뒤, 하대정맥(vena cava) 바로 아래의 결합 조직층을 관통하여 직선 핀셋 한 쌍을 통과시킵니다. 그런 다음 핀셋 끝을 사용하여, 한쪽 끝은 장간막 림프관에 인접하고 다른 쪽 끝은 우측 신장 높이에서 동물 외부로 나오도록 림프 캐뉼라(lymph cannula)를 회음부 지방층을 통해 끌어당깁니다. 이어서 수술용 현미경과 정밀 핀셋(jewelers forceps)을 사용하여, 하단부터 둔성 박리(blunt dissection)를 통해 상부의 결합 및 지방 조직층으로부터 장간막 림프관을 분리하며, 이때 림프관이 손상되지 않도록 주의합니다.

미세 핀셋의 끝을 사용하여 림프관에 작은 구멍을 냅니다. 림프 캐뉼라가 항응고액으로 완전히 채워졌으며 기포가 없는지 확인한 후, 작은 핀셋을 사용하여 천자 부위를 통해 림프 캐뉼라를 장간막 림프관 내부로 약 2~4 mm 삽입합니다. 캐뉼라 삽입이 성공하면, 캐뉼라의 개방된 수집단에서 장 림프액이 서서히 흐르는 것을 관찰할 수 있습니다.

이러한 현상이 발생하면, 림프관 입구 구멍 위에 시아노아크릴레이트 접착제를 소량 도포하여 캐뉼라를 고정하되, 접착제가 과도하여 혈관을 폐쇄하지 않도록 주의하십시오. 십이지장 캐뉼라 삽입을 위해, 먼저 소장의 밝은 분홍색 부분으로 조직의 위치를 찾고 부드럽게 아래로 당겨 위를 노출시킵니다. 그런 다음 멸균된 23 gauge 바늘을 사용하여 위와 십이지장의 접합부에서 약 2 cm 아래에 위치한 유문 부위의 십이지장에 작은 구멍을 뚫습니다.

다음으로, 십이지장 캐뉼라의 J자 모양 갈고리 끝부분을 천자 부위에 삽입하고 Sano 아크릴 접착제 한 방울로 캐뉼라를 고정합니다. 그 후 봉합사를 사용하여 복근벽 절개 부위를 폐쇄합니다. 경동맥 캐뉼라 삽입은 장간막 림프관 캐뉼라 삽입 전이나 후에 수행할 수 있습니다. 일반적으로는 동물을 이동할 때 림프관 캐뉼라가 빠질 가능성을 줄이기 위해 림프관 캐뉼라 삽입 전에 경동맥 캐뉼라를 삽입하는 것을 선호합니다. 경동맥 캐뉼라를 삽입하려면, 먼저 동맥에 삽입할 튜브 부분을 식별하기 위해 경동맥 캐뉼라의 사면 팁으로부터 2.5 centimeters 지점에 표시를 합니다.

그 다음, 캐뉼라의 비사면 끝단을 항응고액이 채워진 주사기에 연결된 25 gauge 바늘에 연결하고, 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 캐뉼라 내부를 용액으로 채웁니다. 이어서 시상면에서 기관 왼쪽 상단 피부층을 따라 1~1.5 cm 길이로 세로 절개를 가한 뒤, 둔단 핀셋을 사용하여 피하 결합 조직을 박리하고 그 아래의 쌍을 이룬 목 근육을 노출시킵니다. 목 근육을 견인하여 피부 표면에서 약 1 cm 아래에 위치한 박동하는 왼쪽 경동맥을 확인합니다.

그 다음, 둔성 박리를 통해 동맥 위의 결합 조직을 제거하고, 둔성 조직 핀셋을 사용하여 동맥의 약 1cm 구간을 분리합니다. 이어서, 미세 팁 핀셋을 사용하여 분리된 동맥 구간의 양 끝단 아래로 두 개의 실크 봉합사를 통과시킵니다. 그런 다음 쥐의 심장과 쇄골에서 가장 멀리 떨어진 쪽의 봉합사를 묶고, 경동맥 아래에 일직선 모양의 미세 팁 핀셋을 배치하여 동맥을 통한 혈류를 차단합니다.

이제 미세 팁 아이리스 가위를 사용하여, 분리된 영역의 상단에서 약 3분의 1 지점의 동맥 상단 표면에 작은 절개를 가합니다. 곡선 팁 포셉을 사용하여 캐뉼라의 팁을 동맥 내부로 삽입합니다. 삽입 후, 직선 미세 팁 포셉을 제거하여 혈류를 차단하고, 두 쌍의 포셉을 사용하여 캐뉼라를 동맥 내부로 2.5 centimeters 진입시킵니다.

한 명은 혈액이 역류하는 것을 막기 위해 동맥 내부의 캐뉼라를 고정하고, 다른 한 명은 캐뉼라를 삽입합니다. 그 다음 소형 동맥 클램프를 사용하여 동맥 내에 캐뉼라를 고정합니다. 캐뉼라에 항응고 용액을 주입한 후, 소량의 혈액을 역으로 흡인하여 튜빙의 개통성을 확인합니다.

그 후 캐뉼라를 항응고액으로 세척하고 라이터 불꽃을 이용해 끝부분을 밀봉합니다. 마지막으로 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 고정하고 동맥 클램프를 제거합니다. 이어서 동맥과 캐뉼라 주위에 세 번째 봉합사를 고정하고, 동맥 주위 봉합사의 길이를 조절한 뒤 회복 기간이 지나면 추가 봉합사로 목 부위의 상처를 봉합하며, 십이지장 캐뉼라를 통해 관심 제형을 동물에 주입하였습니다.

모델인 지용성 약물 halal fanene을 투여한 후 그래프에 나타난 바와 같이, 캐뉼라 삽입에 성공한 쥐의 평균 림프 유량은 시간당 0.4에서 1.3 milliliters였습니다. 일부 동물의 경우, 캐뉼라 삽입 후 처음 1~3시간 동안 림프 유량이 약간 낮았다가 이후 증가하는 경향을 보였는데, 이는 림프 캐뉼라 삽입 성공 후 흔히 관찰되는 현상입니다. 반면, 삽입에 실패한 쥐의 유량은 수집 기간 내내 성공한 실험군에서 나타난 것보다 상당히 낮은 수준을 유지했습니다.

마찬가지로, 이러한 대표 실험에서 트리글리세라이드와 halal RIN의 누적 림프 수송량은 캐뉼라 삽입에 실패한 동물에서 상당히 더 낮았습니다. 반면, 캐뉼라 삽입에 성공한 그룹의 평균 누적 halalan 수송량은 투여량의 15.1%였으며, 누적 트리글리세라이드 수송량은 10시간 동안 61 milligrams였습니다. 이 대표 지질 수송 실험에서 림프를 통해 수송된 투여 방사성 표지 외인성 지질 용량의 비율은 54%였습니다. 이러한 값들은 이전에 관찰된 값들과 유의미한 차이가 없었습니다.

유사한 제형의 경우, 트리글리세라이드와 약물의 림프 수송률은 지질 및 약물 투여 후 몇 시간 뒤에 정점에 도달한 다음 기저 수준으로 돌아갑니다. 이는 장 림프 지질 및 약물 수송 실험의 일반적인 특성입니다. 각 시간대별 림프 내 약물 수송률은 약물이 림프 내로 수송됨에 따라 트리글리세라이드 수송 양상과 유사하게 나타납니다.

트리글리세라이드 풍부 지질단백질과 관련하여, 캐뉼라 삽입법을 숙달하면 별다른 어려움이 없을 경우 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후, 수집된 림프 내의 성분들을 분리하여 수혜 동물에게 다시 주입함으로써 그 기능, 대사, 제거 또는 분포 패턴을 직접 평가하는 것과 같은 추가 실험에 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 장간막 림프관, 경동맥 및 십이지장을 분리하고 캐뉼라를 삽입하는 기술에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 기술을 사용하여 Viva 내의 장에서 장간막 림프관을 통해 그리고 그 안으로 이동하는 약물, 지질 및 기타 인자들의 수송을 평가할 수 있을 것입니다.