BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석
2014년 11월 28일
우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
다음 실험의 전반적인 목적은 내성 프로테아제인 그랜자임 B의 단백질 분해 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 관심 세포의 용해물을 준비한 다음, 샘플에 기질을 빠르게 첨가함으로써 이루어집니다. 그 후 발색 반응을 통해 그랜자임 B의 활성을 측정합니다. 결과적으로, 아스파르트산 잔기에 대한 그랜자임 B의 고유한 기질 특이성을 바탕으로 alla alla as s benzo의 매우 특이적인 절단을 평가할 수 있습니다.
PCR 또는 Western blot을 이용한 granzyme B 발현 검출과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 벤질의 가수분해가 granzyme B에 특이적이며 또한 해당 프로테아제가 활성 상태임을 나타낸다는 점입니다. 세포 용해물을 준비하려면, 먼저 세포를 활성화시킨 후 시판 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 음성 선택(negative selection) 방식으로 wild type C 57 black six 또는 대조군 granzyme B 유전자 결핍 마우스의 비장 단일 세포 현탁액에서 일차 NK 세포를 분리합니다. 배양물을 PBS로 세 번 세척하고 최대 속도로 2~3초간 원심분리한 다음, 최소 5 million 개의 NK 세포가 포함된 펠릿을 100 µL의 Nont P 40 용해 버퍼에 현탁하여 얼음 위에서 20분 동안 둡니다.
그런 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 용해물을 15,000 Gs에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 적절한 상용 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정한 후, granzyme B 활성 분석을 수행하기 위해 최소 약 2 mg/mL 농도로 맞추어 -20 °C에서 보관합니다. 다음으로, 샘플당 최소 100 µg의 단백질 용해물을 갓 조제한 HEPES 완충액으로 희석하여 최종 부피를 160 µL로 맞춥니다.
그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 96-웰 비닐 U-바닥 플레이트의 각 웰에 샘플 50 µL를 3회 반복하여 분주합니다. 완충액만 포함된 대조군 웰 3개를 포함하도록 유의하며, 각 웰에 희석된 DTNB 100 µL를 첨가합니다. 그 후, 완충액 전용 웰부터 시작하여 음성 대조군, 그리고 마지막으로 예상되는 양성 샘플 순으로 갓 희석한 alala asks s benzoyl 기질 50 µL를 각 웰에 빠르게 첨가합니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nanometers의 광학 밀도에서 15초마다 25회 측정하는 키네틱 분석 프로토콜을 통해 alala as benzyl의 가수분해로 aase 활성을 측정합니다. 마지막으로, 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 기질 분해 최대 속도를 계산한 다음, granzyme 유전자 결핍 마우스를 사용하여 원시 데이터를 적절한 통계 분석 소프트웨어로 전송합니다. 합성 펩타이드 기질인 alala as benzyl은 granzyme B에 의해 특이적으로 가수분해된다는 것이 밝혀졌습니다. 합성 기질의 추가적인 강력한 분해는 야생형 일차 NK 세포의 세포 용해물에서 측정할 수 있으며, 대조군인 granzyme B 결핍 동물의 NK 세포에서는 측정되지 않습니다.
본 실험에서, 트립신 유사 기질 특성을 가지며 두 세포 유형의 용해물 모두에 존재하는 그랜자임 A의 단백질 분해 활성은 BLT 벤질의 가수분해로 측정했을 때 동일했습니다. I-E-P-D-P-N-A는 여러 종에 걸쳐 그랜자임 B 활성을 테스트하기 위해 일반적으로 사용되어 왔습니다. 이 대표 실험에서 테트라펩타이드 서열을 분석한 결과, 마우스가 아닌 인간의 그랜자임 B만이 인간과 마우스 bid 모두의 인식 서열과 일치하는 IEPD 서열 뒤를 효율적으로 절단할 수 있음이 밝혀졌습니다. 반면, 인간 NK 백혈병 세포 용해물의 양을 30 µg에서 10 µg으로 줄여도 I-E-P-D-P-N-A 기질을 가수분해하기에 충분한 그랜자임 B가 여전히 존재합니다.
이 영상을 시청한 후에는 인간 및 마우스의 red enzyme B in vitro 분석을 위해 적절한 기질과 실험 대조군을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 논문은 인간, 생쥐 또는 쥐 샘플에서 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 정량적 비색 분석법을 제시합니다. 이 방법은 다른 합성 펩타이드 기질을 사용함으로써 다른 과립 세린 프로테아제에 맞게 조정될 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 프로테아제 활성
- 세포 생물학
배경
- Granzyme B는 면역 반응에 관여하는 세린 프로테아제입니다.
- 이 효소의 활성을 측정하는 것은 세포 매개 세포독성에서 그 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다.
- PCR이나 Western blot과 같은 기존 방법으로는 프로테아제 활성을 직접적으로 측정할 수 없습니다.
- 본 분석법은 GzmB 활성을 특이적이고 직접적으로 측정하는 방법을 제공합니다.
연구 목적
- GzmB 활성을 정량화하기 위한 간단한 분석법을 개발합니다.
- 다른 프로테아제에도 적용 가능한 방법을 제공합니다.
- GzmB 활성에 대한 특이성을 제공함으로써 기존 기술을 개선합니다.
사용된 방법
- 일차 NK 세포로부터의 세포 용해물 준비.
- GzmB 활성 측정을 위한 비색 반응의 이용.
- 야생형 및 granzyme B 유전자 결핍 마우스의 비장에서 NK 세포 분리.
- 프로테아제 활성 평가를 위한 기질 가수분해.
주요 결과
- 본 분석법은 특정 기질 분해를 통해 GzmB 활성을 성공적으로 측정합니다.
- 타 방법과 비교하여 GzmB에 대해 높은 특이성을 보입니다.
- 결과는 기질 가수분해를 바탕으로 프로테아제가 활성 상태임을 나타냅니다.
- 이 방법은 다른 과립 세린 프로테아제에도 적용 가능합니다.
결론
- 개발된 분석법은 GzmB 활성을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 도구입니다.
- 이 방법은 프로테아제 기능을 직접 평가함으로써 전통적인 방법보다 이점을 제공합니다.
- 이러한 접근 방식은 면역 반응 및 프로테아제 생물학 연구를 강화할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Granzyme B의 단백질 분해 활성을 정확하게 측정하는 것은 면역요법 개발에서 세포독성 림프구 기능을 검증하는 데 필수적입니다. 이 비색 분석법은 프로테아제 활성에 대한 직접적이고 특이적인 판독값을 제공하여, 전임상 모델에서 표적 결합 및 전-세포사멸(pro-apoptotic) 잠재력에 대한 기전적 리스크 제거를 가능하게 합니다. 또한, 종 간 호환성이 뛰어나 설치류 연구에서 인체 적용으로 이어지는 중개 연구의 연속성을 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 세포독성 림프구에서 Granzyme B 의존적 세포사멸 경로의 분석을 가능하게 함.
- 운용적 가치: 단순한 발현과 활성 프로테아제를 구별하여, 표적 검증 시 위양성 결과를 줄임.
- 예측적 가치: 면역 매개 종양 제거의 기전적 동인으로서 Granzyme B의 기능적 확인을 뒷받침함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 인간, 생쥐 및 쥐 시스템 전반에서 Granzyme B에 의해서만 가수분해되는 Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl 기질을 사용합니다.
- 정량적 출력: kinetic 분석을 위해 405 nm에서 DTNB-결합 비색 반응을 통해 초기 가수분해 속도를 측정합니다.
- 특이성 제어: 고유한 aspartate 선호도 덕분에 caspase 및 기타 granzyme의 간섭을 배제합니다.
- 재현성: 적절한 대조군이 포함된 경우, 분획되지 않은 용해물 및 재조합 프로테아제와 호환됩니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: Granzyme B가 표적 세포 사멸을 매개하는 종양 면역 감시, 바이러스 감염 및 자가면역 병리 모델에 적용 가능합니다.
- 중개 연속성: 종 간의 일관된 활성 측정을 가능하게 하여, 마우스 데이터에서 인간 데이터로의 외삽을 지원합니다.
- 위험 조정 결정: 확정된 세포 독성 잠재력을 가진 후보 물질의 우선순위를 정하기 위한 활성 기반 바이오마커를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 타겟 검증부터 리드 최적화까지의 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 여기서 기능적 프로테아제 활성은 생물학적 효능과 작용 기전에 대한 정보를 제공합니다.
- 발견 생물학: Granzyme B가 기질 특이적 절단을 통해 작동 림프구의 세포 사멸을 유도한다는 가설을 입증합니다.
- 스크리닝: 조건 또는 유전적 섭동을 비교하기 위한 표준화된 정량적 활성 판독값을 제공합니다.
- 분석: 샘플 간 비교 및 단백질 분해 능력을 통계적으로 평가할 수 있는 반응 속도 데이터(Vmax)를 생성합니다.
- 중개 연구: 인간, 마우스 및 랫 Granzyme B 전반에 걸쳐 보존된 활성을 검증함으로써 전임상 검증을 지원합니다.
- 기업 재사용: 기질 대체가 가능하여 다른 과립 단백질 분해 효소 플랫폼으로 적용할 수 있으므로 장기적인 활용도가 높습니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 단백질 분해 기능을 직접 측정함으로써 mRNA나 단백질 수준과 같은 대리 표지자에 대한 의존도를 낮춥니다.
- 운영적 가치: 수작업 시간이 최소화된 단순한 플레이트 기반 형식으로, 표준 마이크로플레이트 리더와 호환됩니다.
- 전략적 가치: 단순한 발현이 아닌 기능적 활성에 기반한 진행 여부(go/no-go) 결정을 가능하게 하여 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 개발 초기 단계에서 기전적 효능을 확인함으로써 면역요법의 리스크 조정 기반 진전을 촉진합니다.
실행 시 고려 사항
- 프로테아제 활성을 보존하기 위해 제어된 조건 하에서 일차 면역 세포의 분리 및 용해에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 키네틱 OD405 측정이 가능하고 호환되는 분석 소프트웨어가 갖춰진 마이크로플레이트 리더의 사용이 가능해야 합니다.
- 출처에서 입증된 바와 같이, 분석의 특이성을 확인하기 위해 Granzyme B 녹아웃 대조군을 반드시 포함해야 합니다.
- 다른 프로테아제에 적용하려면 동일한 특이성과 시그널 윈도우를 유지하기 위해 대체 기질에 대한 검증이 필요합니다.
- 실질적 제한 사항: 본 분석법은 전체 용해물 활성을 측정하므로, 세포 내 소기관 국소화 연구를 위해서는 분획 과정이 필요할 수 있습니다.
