Name: BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 배우세요 Granzyme B 단백질 분해 활성을 측정하는 색채 분석법을 통해 면역 반응 연구를 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 PCR이나 웨스턴 블롯보다 특이적으로 효소 활성을 직접 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG, 독일 연구 재단)로부터 MH에 대한 HA 6136/1-1 보조금을 통해 지원을 받았습니다. JAT는 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council of Australia)의 프로그램 및 프로젝트 보조금의 지원을 받습니다.

참고 : 마우스에서 파생 된 비장 (나이 6-10 주) 모든 동물 실험은 피터 맥 칼럼 암 센터 (E486)의 동물 윤리 지침에 따라 수행 하였다. 샘플 1. 준비. <ol><li> 활성화 마우스 NK 세포의 준비. <ol><li> 시판되는 키트를 사용하여 음성 선별에 의해 (GzmB 유전자 NULL) 마우스 - / - C57BL / 6 또는 B6.GrzmB의 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 기본 나이브 NK 세포를 분리. </li><li> 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 요약하면, 이러한 자기 T 및 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 대 식세포, 및 특정 표면 마커에 대해 바이오틴 - 컨쥬 게이트 항체를 사용하여 적혈구 세포와 같은 &quot;비 - NK&quot;세포를 라벨. &quot;비 NK&quot;세포를 고갈 방지 비오틴 구슬 자기 분리를 사용합니다. </li><li> 배양은 24 웰 플레이트에서 700,000 세포 / ml에서 IL-2 (1000 U / ㎖)를 함유하는 미디어 5-7 일간 NK 세포를 격리37 &#160; ° C. </li><li> 대안 적 사용은 19 T 세포, OT1 T 세포 수용체 트랜스 제닉 마우스 (20)로부터 기본 항원 제한된 CTL이 CTL 분비 GzmB (19)의 행동을 결정하기 위하여 활성화 된 NK 세포로부터 혼합 림프구 배양 물 (21), 또는 상층 액에 생성 된 활성화. </li></ol></li><li> 인간 NK 세포주 및 일차 NK 세포의 분리의 유지. <ol><li> 10 % 우태 혈청으로 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지에서 인간 NK 백혈병 (YT 세포)를 유지한다. 또한, 정상인의 말초 혈액에서 차 NK 세포를 정화하고 이전 22 설명 된 바와 같이 IL-2 100 U / ml의에서이 함유 배지 2 ~ 3 일 동안 자극한다. </li></ol></li><li> 세포 용 해물의 생성. <ol><li> PBS (PH 7.4)에 세포를 세 번 세척 한 후 Nonidet P-40 용해 버퍼에 일시 중단 (0.1 % NP-40, 250 mM의 염화나트륨, 25 mM의 헤 페스, 2.5 mM의 EDTA). 이상적으로는, 5 × 106의 최소 용해 </sNK 세포, 또는 100 μL 버퍼에 1 × 10 7 T 세포&gt;까지. 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오, 많은는 GzmA 취소 할 수없는 세린 프로테아제 억제제, 특히 tryptases에 있습니다. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션 한 후 10 분간 15,000 XG에 미세 원심에서 핵 펠렛. 핵 펠렛을 취소하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li></ol></li><li> 해물의 단백질 농도를 결정합니다. <ol><li> 이러한 브래드 bicinchoninic 또는 산 (BCA)과 같은 선택의 시판 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 농도가 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ 최소 있는지 확인하십시오. 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관 용 해물 (그랜 자임 활동은 -20 ° C에서 몇 달 동안 안정). </li></ol></li></ol> 2. 그랜 자임 B 활동 분석 <ol><li> 시약의 조제 <ol><li> DMSO에 기판 (BOC-AAD-S-BZL 또는 AC-IEPD-pNA를)의 10 mM의 주식을 준비합니다 (~ 5 ㎎ / ㎖) -20 &amp; #에서 분취에 저장176; C. 갓 작업 희석을 준비하고 BOC-AAD-S-BZL 부분적으로 DMSO에 저장에 가수 분해로, 하루 후 폐기합니다. </li><li> -20 ° C에서 250 밀리미터의 DMSO 비색 시약 (5,5&#39;- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산), DTNB)의 재고 (0.09 g / mL) 및 저장소를 준비한다. 매일 신선한 작업 희석을 준비합니다. 이 시약은 SBzl 표시가 아닌 그룹 pNA를 가진 기판이 필요합니다. </li><li> 신선한 버퍼 (0.1M HEPES, 0.05 M의 MgCl 2, pH를 7.3) 2 ~ 3 주까지합니다. </li></ol></li><li> 실온으로 DTNB 및 합성 기판을 준비한다. 희석 기판 (1시 16분, 예를 들어 1.6 버퍼 용액에 100 μL)과 DTNB (1 : 250, 예를 들어 10 2.5 ml의 버퍼의 μL) 잘 섞는다. </li><li> 160 μL의 최종 부피 버퍼에 각 시료 100 μg의 단백질 용 해물의 최소 희석. 멀티 채널 피펫을 사용하여 &#39;&#39;U &#39;&#39;바닥 비닐 96 웰 플레이트 (~ 33.3 ㎍ / 웰) 세중 잘 당 50 μl를 추가합니다.&quot;버퍼 전용&quot;제어를 포함 (또한 세중). </li><li> AC-IEPD-pNA를 사용하여 작업 할 때 샘플 / 버퍼 제어로 희석 DTNB 100 μl를 추가합니다 (이 단계를 생략합니다. 참고 : GzmB에 의해 AC-IEPD-pNA를의 쪼개짐 직접 형광 pNA를 (그림 4B)를 발표한다. </li><li> 빨리 다음 버퍼 부정적인 컨트롤로 시작하는 예상 양의 샘플을 마무리, 삼중의 각 세트로 희석 기판의 50 μl를 추가하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 플레이트 리더에서 접시를 놓습니다. OD 405 nm에서 마이크로 플레이트 리더에 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL / AC-IEPD-pNA를 가수 분해하여 ASP를-ASE 활동을 측정한다. 25 판독, 매 15 초 (약 6 분 총 독서 시간)을 가지고, 운동 분석 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 플레이트 리더 (VMAX)의 소프트웨어에 대한 값을 생성 할 수없는 경우 직접 기판의 절단 속도를 계산하기 위해 각 시점에서 생성 흡광도 판독 값을 사용한다. </li></ol> 다 3. 분석타 참고 : 시간이 지남에 OD의 변화 (MOD / 분)로 정의 된 최대 속도로 제시됩니다 생성 된 데이터,. <ol><li> 데이터를 분석하는, 흡광도의 변화율로부터 산출되는 기판 절단의 최대 속도를 결정한다. 자동 일반적으로이 옵션이 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 또는 수동으로 플레이트 리더에 운동 분석 중에 생성되는 흡광도의 변화의 운동 플롯을 본 후 가파른 직선을주는 데이터 포인트를 선택합니다. 대부분의 상기 분석 최대 레이트로는 분석의 제 2 분 이내에 달성된다. </li><li> 시간 간격으로이 직선과 분열의 가장 높은 OD 독서에서 초기 OD 읽기를 뺍니다. 통계 분석 및 그래픽 디스플레이 용 Microsoft Excel / 그래프 패드에 원시 데이터를 전송합니다. </li></ol>

<ol><li>Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+functional+Asp-ase+%28natural+killer+cell+granzyme+B%29+using+a+monoclonal+antibody%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody).</a> Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+battlefield+of+perforin%2Fgranzyme+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways.</a> J Leukoc Biol. , (2009).</li>
<li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes%2C+containing+both+perforin+and+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).</li>
<li>Berthou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granzyme+B+and+Fas+ligand+proteins+by+human+keratinocytes+contributes+to+epidermal+cell+defense%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense.</a> J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).</li>
<li>Tschopp, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B%2C+a+novel+mediator+of+allergic+inflammation%3A+its+induction+and+release+in+blood+basophils+and+human+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma.</a> Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).</li>
<li>Strik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mast+cells+produce+and+release+the+cytotoxic+lymphocyte+associated+protease+granzyme+B+upon+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation.</a> Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).</li>
<li>Jahrsdorfer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+produced+by+human+plasmacytoid+dendritic+cells+suppresses+T+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+secrete+granzyme+B+when+recognizing+viral+antigens+in+the+context+of+the+acute+phase+cytokine+IL-21%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21.</a> J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+differentiate+into+granzyme+B-secreting+cytotoxic+B+lymphocytes+upon+incomplete+T-cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help.</a> Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).</li>
<li>Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule-associated+serine+proteases%3A+granzymes+might+not+just+be+killer+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases.</a> Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).</li>
<li>Hagn, M., Jahrsdorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+human+B+cells+secrete+granzyme+B%3F+Insights+into+a+novel+B-cell+differentiation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway.</a> Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).</li>
<li>Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controversies+in+granzyme+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Controversies in granzyme biology.</a> Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).</li>
<li>Odake, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+cytotoxic+T+lymphocyte+serine+proteases%3A+subsite+mapping+with+peptide+thioester+substrates+and+inhibition+of+enzyme+activity+and+cytolysis+by+isocoumarins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins.</a> Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).</li>
<li>Casciola-Rosen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+granzyme+B+have+distinct+tetrapeptide+specificities+and+abilities+to+recruit+the+bid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway.</a> J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).</li>
<li>Kaiserman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+human+and+mouse+granzymes+are+structurally+and+functionally+divergent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent.</a> J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).</li>
<li>Powers, J. C., Kam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+thioester+substrates+for+serine+peptidases+and+metalloendopeptidases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases.</a> Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li>
<li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+active+granzyme+B+in+cathepsin+C-null+lymphocytes+is+sufficient+for+perforin-dependent+target+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis.</a> J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).</li>
<li>Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule+serine+proteases+are+normal+nuclear+constituents+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells.</a> J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).</li>
<li>Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+granzyme+B+exhibit+divergent+substrate+preferences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences.</a> J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+apoptosis%3A+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li>
<li>Bots, M., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serpins+in+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Serpins in T cell immunity.</a> J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+%28proteinase+inhibitor+9%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+granzyme+B+tissue+distribution+and+cellular+localisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation.</a> Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8%2B+effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR%2Fepitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li>
<li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+%28chymase%29+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+apoptosis+by+granzyme+B+requires+direct+cleavage+of+bid%2C+but+not+direct+granzyme+B-mediated+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.</a> J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

역사적으로 granzymes은 표적 세포의 급속한 세포 사멸 죽음을 유도 할 수있는 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 이펙터 분자로 확인되었다. 이는 아스 파르 테이트 (D) 잔기에 타깃 기판 분자를 절단함으로써 그 하류 표적 여러뿐만 아니라, 모두 절단 프로 카스파하여 카스파 제 캐스케이드를 활성화 할 수 있었다 GzmB의 작용에 주로이었다. 그러나, 지금 GzmB 발현 림프구 세포 독성 세포에 국한되지 않고 그 기능이 아니라 타겟 셀 인식 및 세포 죽음을 넘어 연장 될 수 있다는 것을 이해할 수있다. 이 논문에서 우리는 하나의 간단한 비색 분석법을 이용하여 마우스와 인간의 CTL / NK 세포 모두에서 파생 된 세포 용 해물에서 활동 GzmB의 검출을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램이 다른 소스로부터 세포 샘플에서 GzmB를 검사 할 수있는 다음과 같은 연구 결과에 의해 확인으로이 분석의 단순화와 특이도의. 그러나, 세포 용...

Granzymes 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL) (1)의 분비 리소좀에서 발견되는 세린 프로테아제 패밀리이다. 다섯 가지 granzymes 인간 (A, B, H, K 및 M)에 존재하고, 마우스에서 십 (A - G, K, M 및 N) 2,3-. 그랜 자임과 그랜 자임 B (GzmA, GzmB)는 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 설치류 설정에서 조사되었다. GzmB의 고전 함수는 표적 세포 사이토 졸로 액세스 4 그랜 자임을 허용 기공 형성 단백질 퍼포과 함께 실행되는 표적 세포에서 아폽토시스의 유도이다. GzmB 발현 명백하게 세포 상해 성 림프구에서 발견되지만, 최근의 연구는 호염기구 (6), 비만 세포 (7) 형질 수지상 세포 (8) 및 B 세포 (9)를 포함하지만, 케 라티노 사이트 (5)에 한정되지 않고, 다른 GzmB 발현 세포 유형의 다양한 어드레싱되었습니다 10.이러한 맥락에서, 비 세포 사멸 GzmB 기능은 염증 과정, 조직 리모델링과 다른 면역 특성 11-14 참여에 이르기까지 드러났다. 폭 넓은 생물학적 역할이 이전에 의심보다 GzmB 제안 된 것을 감안할 때, 연구자는 검출 신뢰성과 특정 도구가 필요합니다. 이점 진핵 세린 프로테아제 (15) 사이에서 고유 아스파르트 산 잔기, 속성의 카복실 측 쪼개지 GzmB의 특정 요구 사항이다. 마우스는 인간과 쥐 GzmB 그러나 마우스 GzmB의 확장 기질 특이성 터미널 (P1)에서의 ASP와 특정 일반 기판 GzmB 효율적으로 절단 할 수 있음을 의미 모두 인간과 쥐 16과는 미묘하게 다른, 구조적으로 매우 유사 세 종, 상류 P1의 더 복잡한 시퀀스와 다른 기판 반면 널리 변수 결과를 제공 할 수 있습니다. 과거 최신 리튬 둘terature,이 사실은주의 깊게 통제에도 불구하고, 상당한 혼란과 일부 실험 결과의 생물학적 의미의 오해가 발생했습니다, 운동 연구는 상황 (17)를 해결하기 위해 노력했다. 이 논문에서 우리는 두 가지 상업적으로 이용 가능한 기판, 즉 BOC-알라 - 알라 -의 ASP SBzl 및 N- 아세틸 일드 서열 1 프로의 ASP-P-니트로 아닐리드를 사용하여 이러한 점을 설명하기 위해 노력했다. 이 시약은 분열 (형광 무료 paranitroanilide 대 무료 sulphydryl) 다음과 같은 서로 다른 반응 그룹을 생성 할 수 있지만,이 단백질 분해 분열에 영향 무엇이든이 없습니다. 기술 된 프로토콜은 매우 오래 프로토콜 (18)의 현대 적응이지만 또한 GzmA 및 GzmH 다른 granzymes의 활성을 검출하기위한 방법 론적 틀을 제공하면서 조사관, 적절히 다른 GzmB 기판을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Granzyme B 기판 (마우스 및 인간)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Granzyme B 기판 (인간만)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-lysine-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Granzyme A 기판</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Granzyme H 기판</td></tr><tr><td>5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8130</td><td>DTNB, 엘먼' s 시약</td></tr><tr><td>NK 세포 분리 키트 II 마우스</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>음성 선택 키트</td></tr><tr><td>NK 세포 분리 키트 human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>음성 선택 키트</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager 소프트웨어 버전 MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

boc-알라 - 알라 -의 asp-s-bzl의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 b 단백질 분해 활동를 측정 분석

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

세린 프로테아제 Granzyme B(GzmB)는 세포독성 T 림프구(CTL) 또는 자연살해(NK) 세포에 의해 방출될 때 표적 세포 자멸사를 매개합니다. GzmB는 인간과 생쥐에서 가장 많이 연구된 그랜자임이므로 연구자들은 병태생리학에서 그 기능과 역할을 연구하기 위해 구체적이고 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다. 이는 특히 구조적 또는 기능적으로 관련된 카스파제(caspasé) 또는 다른 그랜자임(granzyme)과 같은 프로테아제를 인식하지 않는 분석을 필요로 합니다. 여기에서는 펩타이드 티오에스테르 Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl을 사용하여 비색 분석에서 아스파르트산 잔류 후 절단에 대한 GzmB의 선호를 적용합니다. GzmB는 이 기질을 절단할 수 있는 유일한 포유류 세린 프로테아제입니다. 기질은 인간, 마우스 및 쥐 GzmB에 의해 유사한 효율로 절단되며, 이는 상업적으로 이용 가능한 다른 펩타이드 기질과 공유되지 않는 특성이며, 이러한 목적에 적합한 것으로 광고되는 일부도 있습니다. 이 프로토콜은 활성화된 NK 세포 또는 CTL의 분획되지 않은 용해물을 사용하여 입증되었으며 올바른 대조군이 사용되는 경우 다양한 원핵 및 진핵 시스템에서 생성된 재조합 단백질 분해 효소에도 적합합니다. 이 분석은 포유류 림프구에서 세포독성 분자와 다양한 방법론으로 표현되는 재조합 분자의 잠재적인 세포사멸 활성을 확인하기 위한 매우 특이적인 방법입니다.

BOC-AAD-S-BZL 기판 GzmB에 대한 특정 세린 프로테아제 GzmB 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 구성 성분이며, 바이러스 감염 또는 형질 전환 세포와 같은 표적 세포에 빠른 세포 사멸 죽음을 유도 주로 담당하고 있습니다. 이 때문에 선택된 단백질의 특정 특정 아스파 테이트 잔류 후 분열에 대한 기판 선호도에 크게이며, 속성은 아스 파르 테이트 잔류 후 절단하지만 단백질 분해 효소의 다른 클래스, 시스테인 프로테아제 가족 15 인 카스파, 공유. 단백질 분해 메카니즘의 차이는 AAD-SBzl 어떤 카스파 의해 절단 될 수 없다는 것을 의미한다. GzmB 발현은 이들 세포 (도 1)에서 제조 된 세포 용 해물에서 모니터링 될 수있다 세포 독성 림프구 및 효소 활성의 활성화 다음 유도된다. 그랜 자임 유전자 녹아웃 마우스의 가용성은 우리가를 구축 할 수있다합성 펩티드 기질...

우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

다음 실험의 전반적인 목적은 내성 프로테아제인 그랜자임 B의 단백질 분해 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 관심 세포의 용해물을 준비한 다음, 샘플에 기질을 빠르게 첨가함으로써 이루어집니다. 그 후 발색 반응을 통해 그랜자임 B의 활성을 측정합니다. 결과적으로, 아스파르트산 잔기에 대한 그랜자임 B의 고유한 기질 특이성을 바탕으로 alla alla as s benzo의 매우 특이적인 절단을 평가할 수 있습니다.PCR 또는 Western blot을 이용한 granzyme B 발현 검출과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 벤질의 가수분해가 granzyme B에 특이적이며 또한 해당 프로테아제가 활성 상태임을 나타낸다는 점입니다. 세포 용해물을 준비하려면, 먼저 세포를 활성화시킨 후 시판 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 음성 선택(negative selection) 방식으로 wild type C 57 black six 또는 대조군 granzyme B 유전자 결핍 마우스의 비장 단일 세포 현탁액에서 일차 NK 세포를 분리합니다. 배양물을 PBS로 세 번 세척하고 최대 속도로 2~3초간 원심분리한 다음, 최소 5 million 개의 NK 세포가 포함된 펠릿을 100 µL의 Nont P 40 용해 버퍼에 현탁하여 얼음 위에서 20분 동안 둡니다.그런 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 용해물을 15,000 Gs에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 적절한 상용 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정한 후, granzyme B 활성 분석을 수행하기 위해 최소 약 2 mg/mL 농도로 맞추어 -20 °C에서 보관합니다. 다음으로, 샘플당 최소 100 µg의 단백질 용해물을 갓 조제한 HEPES 완충액으로 희석하여 최종 부피를 160 µL로 맞춥니다.그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 96-웰 비닐 U-바닥 플레이트의 각 웰에 샘플 50 µL를 3회 반복하여 분주합니다. 완충액만 포함된 대조군 웰 3개를 포함하도록 유의하며, 각 웰에 희석된 DTNB 100 µL를 첨가합니다. 그 후, 완충액 전용 웰부터 시작하여 음성 대조군, 그리고 마지막으로 예상되는 양성 샘플 순으로 갓 희석한 alala asks s benzoyl 기질 50 µL를 각 웰에 빠르게 첨가합니다.마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nanometers의 광학 밀도에서 15초마다 25회 측정하는 키네틱 분석 프로토콜을 통해 alala as benzyl의 가수분해로 aase 활성을 측정합니다. 마지막으로, 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 기질 분해 최대 속도를 계산한 다음, granzyme 유전자 결핍 마우스를 사용하여 원시 데이터를 적절한 통계 분석 소프트웨어로 전송합니다. 합성 펩타이드 기질인 alala as benzyl은 granzyme B에 의해 특이적으로 가수분해된다는 것이 밝혀졌습니다. 합성 기질의 추가적인 강력한 분해는 야생형 일차 NK 세포의 세포 용해물에서 측정할 수 있으며, 대조군인 granzyme B 결핍 동물의 NK 세포에서는 측정되지 않습니다.본 실험에서, 트립신 유사 기질 특성을 가지며 두 세포 유형의 용해물 모두에 존재하는 그랜자임 A의 단백질 분해 활성은 BLT 벤질의 가수분해로 측정했을 때 동일했습니다. I-E-P-D-P-N-A는 여러 종에 걸쳐 그랜자임 B 활성을 테스트하기 위해 일반적으로 사용되어 왔습니다. 이 대표 실험에서 테트라펩타이드 서열을 분석한 결과, 마우스가 아닌 인간의 그랜자임 B만이 인간과 마우스 bid 모두의 인식 서열과 일치하는 IEPD 서열 뒤를 효율적으로 절단할 수 있음이 밝혀졌습니다. 반면, 인간 NK 백혈병 세포 용해물의 양을 30 µg에서 10 µg으로 줄여도 I-E-P-D-P-N-A 기질을 가수분해하기에 충분한 그랜자임 B가 여전히 존재합니다.이 영상을 시청한 후에는 인간 및 마우스의 red enzyme B in vitro 분석을 위해 적절한 기질과 실험 대조군을 선택하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 비디오에서는 생물학적 샘플 내의 단백질 분해 활성을 분석하기 위해 전기영동 기술인 자이모그래피를 수행합니다.

형광 펩타이드 자이모그래피: 자이모그램 겔에서 형광 기질을 사용하여 프로테아제 활성을 검출하는 수정된 기술

이 동영상은 세포 사멸 또는 세포사멸을 정량화하기 위한 체외 Caspase-3/7 발광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 pro-luminescent DEVD 기질의 caspase-3/7 절단 후 생성된 발광을 측정합니다. 생성된 발광은 caspase-3/7 활성에 비례합니다.

Caspase-3/7 Assay: 개구리 피부 이식에서 Caspase-3/7 활성을 측정하여 세포사멸을 정량화하는 발광 기반 분석

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

이 동영상은 탈과립 분석을 통해 호중구 활성화 및 과립 외세포작용(granule exocytosis)을 모니터링하는 분석을 보여줍니다. 전염증성 화합물에 의해 활성화되면, 젤라티나제를 함유한 호중구 내의 세포질 과립이 세포막과 융합하여 화물을 배출합니다. 상등액 내 젤라티나아제의 존재 여부는 형광단 접합 젤라틴 기질의 가수분해를 통해 평가되어 호중구 활성화 및 탈과립화를 확인합니다.

호중구 활성화 및 젤라티나아제 방출을 모니터링하기 위한 탈과립 분석

이 비디오는 마우스 호중구에서 호중구를 자극하여 골수페록시다아제를 함유한 친화성 과립을 방출하는 것과 관련된 흡혈성 과립의 탈과립 분석을 보여줍니다. 후속 효소 반응은 골수과산화효소 수준을 정량화하는 데 사용되어 호중구 활성화에 대한 통찰력을 제공합니다.

An Assay to Monitor Degranulation of Azurophilic Granules in Neutrophils following Activation

여기에서는 순수하고 완전히 글리코실화되었으며 효소 활성 프로테아제를 높은 수율로 생산하는 HEK293T 세포를 사용하는 비용 효율적인 그랜자임 발현 시스템을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

이 프로토콜은 엘라스타제 활성을 억제하거나 활성화하는 화합물의 능력을 결정하기 위한 비색 분석 방법의 개발을 설명합니다.

비색 분석을 통한 엘라스타제 효소 활성의 조절 정량화

배우세요 Granzyme B 단백질 분해 활성을 측정하는 색채 분석법을 통해 면역 반응 연구를 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 PCR이나 웨스턴 블롯보다 특이적으로 효소 활성을 직접 평가합니다.

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

더 많은 동영상 탐색