정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

이 절차의 전반적인 목표는 재구성된 시스템에서 CFTR 채널 집단의 기능을 측정하고, 조절 분자의 존재에 따른 채널의 반응을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 신속 정제법을 사용하여 SF nine 세포로부터 야생형 또는 돌연변이 CFTR 단백질을 정제함으로써 수행되며, 이를 통해 세제 용액 상태의 기능성 CFTR 단백질을 얻습니다. 두 번째 단계는 정제된 단백질을 실험자가 선택한 특정 지질의 프로테오리포좀(protea liposomes)으로 재구성하는 것입니다.

다음으로, 리포좀 외부의 과잉 요오드화물을 제거하여 막을 가로지르는 요오드화물의 화학적 구배를 형성함으로써 CFTR 채널을 통한 이온 이동의 추진력을 생성합니다. 마지막 단계는 관심 대상인 조절 분자가 존재하는 상태에서 채널을 활성화하여 프로테오리포좀으로부터 요오드화물 방출을 유도하는 것입니다. 최종적으로, 요오드화물 선택성 전극을 사용하여 이 재구성 시스템에서 CFTR 채널 기능을 실시간으로 모니터링합니다.

이 방법은 인지질 리포좀으로 재구성된 정제된 CFTR 분자 집단의 염화물 채널 활성을 연구할 수 있게 합니다. 이 방법은 CFTR 채널의 기능과 저분자 조절제의 효과에 대한 통찰을 제공하기 위해 고안되었으나, 다른 막 단백질의 기능적 특성 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해, 이 방법이 처음인 연구자는 자신의 시스템에 맞게 단백질과 지질의 비율을 최적화했는지, 기능이 떨어지거나 기능이 없는 단백질을 사용하고 있지는 않은지, 그리고 밀봉된 소포 전체에 충분한 요오드물 농도 구배를 생성했는지 확인해야 합니다.

지질을 준비하려면 먼저 비붕규산 유리 튜브에 5 mg의 egg phosphatidylcholine 또는 egg PC를 넣고, 실온에서 아르곤 가스 기류 하에 20분 동안 건조합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 필요한 buffer six의 부피를 계산한 후, buffer six를 지질에 직접 첨가합니다. 유리 튜브를 perfil로 밀봉한 다음, 실온에서 2분 동안 튜브를 볼텍싱하여 지질을 버퍼에 현탁시킵니다.

다음으로, 1mL 주사기에 25게이지 바늘을 장착하여 튜브 벽면에 눈에 보이는 지질 막이 없을 때까지 실온에서 지질을 현탁합니다. 현탁된 지질로 인해 버퍼 용액이 뿌옇게 보일 것입니다. 얼음이 담긴 소니케이터 수조에서 튜브 내의 지질을 22초 동안 짧게 초음파 처리한 후, 튜브를 얼음에 박아 1분 동안 방치합니다.

이 사이클을 세 번 반복합니다. 다음으로, CFTR 단백질을 지질에 첨가하여 최종 부피를 1mL로 맞춥니다. 25게이지 바늘을 사용하여 단백질과 지질 현탁액을 10회 혼합합니다.

시료를 얼음 위에 30분 동안 두고, 배양하는 동안 5분마다 튜브를 5회씩 회전시켜 혼합합니다. 일회용 세제 결합 스핀 컬럼(detergent binding spin column)의 하단 탭을 제거하고, 컬럼을 2000 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 보관 버퍼를 제거하기 위해 5 mL의 버퍼 7로 컬럼을 세척하고, 세척 버퍼를 용출시키기 위해 컬럼을 2000 ×g에서 4분 동안 원심 분리합니다.

컬럼을 세 번 세척하고, 1 mL의 단백질 지질 샘플 전체를 컬럼 레진 상단으로 옮긴 후, 상온에서 2분 동안 배양합니다. 상온에서 2000 ×g로 4분 동안 컬럼을 원심 분리합니다. 그런 다음 탁한 단백질 리포좀 샘플을 깨끗한 마이크로 퓨즈 튜브로 옮기고 튜브를 얼음에 둡니다. 5 g의 cidex G 50 비드를 50 mL의 버퍼 9에 넣고 상온에서 최소 2시간 동안 침지시킵니다.

그런 다음 4개의 소형 스크리닝 컬럼에 포화된 비드를 4분의 3 이상 채워줍니다. 2000 ×g에서 4분 동안 원심분리하여 레진에서 과잉 버퍼를 제거합니다. 원심분리 후 컬럼에는 약 2.25 mL의 충진된 레진이 들어 있어야 합니다.

프로테아 리포좀을 이용한 용출을 위해 레진을 적절하게 수화시키는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 프로테아 리포좀 샘플 125 µL를 각 컬럼 상단에 옮기고 2000 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 요오드 FLX 실험에 사용하기 위해 EIT를 함께 모읍니다.

96-웰 플레이트의 한 웰에 작은 F 플리스 스터 바(stir bar)를 넣고, 버퍼 9에 20 $\mu$M 농도로 희석한 VX 770 150 $\mu$L를 해당 웰에 첨가합니다. 피펫 팁을 사용하여 기포를 제거합니다. 그런 다음 프로테아 리포좀 샘플 150 $\mu$L를 웰에 첨가하여 총 부피를 300 $\mu$L로 맞춥니다.

96웰 플레이트를 130 rpm의 교반기에 놓습니다. 요오드화물 민감 전극의 팁이 교반 바나 웰 바닥에 닿지 않도록 용액에 삽입합니다. 전극 신호의 트레이싱을 기록하려면, 2 Hz의 샘플링 속도를 가진 저역 통과 필터를 통해 신호를 필터링하고, 샘플이 평형에 도달할 수 있도록 5분 동안 샘플의 트레이싱을 기록합니다.

안정적이고 거의 평평한 기선(baseline)이 생성되어야 합니다. 그다음 pH 7인 100 mM magnesium ATP 스톡 용액 3 µL를 첨가합니다. CFTR 채널을 활성화하기 위해 샘플을 5분 더 평형 상태로 두어 새로운 기선에 도달하게 합니다.

다음으로, CFTR 활성으로 인해 생성된 전기화학적 기울기를 제거하기 위해 2 µM 농도의 발리노마이신(valinomycin) 스톡 솔루션 3 µL를 첨가합니다. CFTR 매개 요오드화물 유출(FLX) 활성으로 인한 전압 감소를 최소 5분 동안 기록합니다.

그 다음, 대조군으로서 프로테아 리포좀 루멘에서 요오드화물을 방출시키기 위해 10% Triton X 100 용액 3 µL를 시료에 첨가합니다. 상당량의 요오드화물이 방출되었다는 것은 소포 내에 갇힌 요오드화물이 CFTR 활성에 제한 요인이 아니었음을 나타냅니다. 시료 측정이 끝나면, 버퍼 9에서 요오드화칼륨을 마이크로몰(µM)에서 나노몰(nM) 농도까지 희석 계열로 준비합니다.

가장 희석된 용액부터 시작하여, 표준 곡선을 생성하기 위해 각 요오드화물 농도에서 전극의 응답을 밀리볼트로 기록합니다. 야생형 CFTR을 대상으로 요오드화물 F 플럭스 활성을 측정하였으며, 재구성과 이후 초당 아노몰 단위로 측정하였습니다.

CFTR과 ATP가 존재하는 경우 CFTR이 결여된 대조군에 비해 요오드물질(Iodide) 플럭스가 유의하게 자극되며, ATP의 첨가로 인해 촉진됩니다. CFTR이 cyclic AMP 의존성 단백질 인산화효소의 촉매 하위 단위인 PKA에 의해 인산화될 때, 반대로 강력한 억제제인 CFTR inhibitor 172로 전처리하면 요오드물질 플럭스 속도가 감소합니다. 야생형 CFTR의 요오드물질 플럭스를 강화하는 VX-770의 능력은 PKA에 의한 인산화 유무에 따라 테스트되었습니다. VX-770은 인산화된 CFTR이 존재할 때만 상대적 요오드물질 플럭스를 증가시켰습니다. VX-770의 효능은 Delta 508 CFTR이라고 불리는 CFTR 변이체를 사용하여 분석하였으며, 비활성 아날로그인 V-09-1188은 인산화된 Delta 508 CFTR의 활성을 강화하지 못한 반면 VX-770은 상대적 요오드물질 플럭스를 증가시켰습니다. 숙련된 경우, 이 기술은 정제부터 CFTR 활성 측정까지 전형적인 8시간 근무일 내에 완료할 수 있으며, CFTR 정제에 약 4시간이 소요되고 eFlex 분석을 시작하기 전 재구성에 추가로 1시간이 소요됩니다.

이 절차 이후, 소분자와의 상호작용을 더욱 자세히 특성화하기 위해 동일하게 준비된 CFTR 단백질을 사용하여 T PS 분석 및 단일 채널 파라 리피드 S 전도도 측정(single channel conduct a measurement in the para lipid S)을 포함한 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 방법들을 통해 낭성 섬유증 연구자는 CFTR 조절제 분야의 핵심 질문, 즉 해당 조절제가 CFTR 단백질과 직접적으로 상호작용하는지, 그리고 해당 조절제의 작용 기전은 무엇인지에 대한 답을 얻을 수 있을 것입니다.