Name: 박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 학습하세요 재조합 단백질 발현을 박테리아, 곤충 세포 및 식물 시스템에서 비교 분석하는 방법을. 각 바이오팩토리 플랫폼의 수율, 품질 및 운영 특성을 평가하여 최적의 단백질 생산 전략을 수립할 수 있습니다.

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이 작업은 COST 조치 'Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804의 지원을 받았습니다. 저자는 연구 목적으로 MagnICON 벡터를 제공해 주신 Anatoli Giritch 박사와 Yuri Gleba 교수에게 감사를 표합니다.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
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<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
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<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system.</a> Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

박테리아 세포, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 및 식물 : 본 연구에서는 세 가지 플랫폼은 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다. (- MagnICON 및 pK7WG2 기반 - 안정적인 즉, 과도) 식물 기반 플랫폼은 더 세 널리 사용되는 표현 기술을 이용하여 탐구 하였다. 이 실험 hGAD65mut 위해 선택된 표적 단백질은 이전에 다른 시스템 (13)으로 표현되었고, 그것의 생산 및 기능은 쉽게 검출 및 측정 할 수있다 (14). hGAD65mut는 봉입체를 형성하기 때문에 세균 세포 따라서 힘드는 가용화를 요구 및 원시 형태를 달성하는 폴딩에도 저온 성장 조건에서, 효율적인 생산 플랫폼 아니었다. 실제로 복잡한 재조합 단백질의 발현을위한이 플랫폼의 주요 장애는 최종 제품의 우측 형태이다. 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 플랫폼은 면역 재조합 단백질의 고 발현을 ...

재조합 단백질은 새로운 생명공학 도구의 도움으로 이종 발현 시스템에서 상업적으로 대량 생산됩니다. 이종 발현 시스템을 선택할 때 고려해야 할 핵심 요소에는 단백질 품질, 기능성, 공정 속도, 수율 및 비용이 포함됩니다.
재조합 단백질 분야에서는 의약품 시장이 빠르게 확대되고 있으며, 이에 따라 오늘날 생산되는 대부분의 바이오의약품은 재조합 의약품입니다. 단백질은 박테리아, 효모, 곰팡이, 포유류, 식물 및 곤충의 세포 배양뿐만 아니라 식물 시스템(안정 또는 일시적 변형을 통해) 및 형질전환 동물에서 발현될 수 있습니다. 각 발현 시스템에는 고유한 장점과 한계가 있으며 각 표적 재조합 단백질에 대해 최적의 생산 시스템을 신중하게 평가해야 합니다.
식물 기반 플랫폼은 안전하고 비용 효율적인 재조합 단백질 생산을 위한 기존 발효기 기반 시스템의 중요한 대안으로 부상하고 있습니다. 다운스트림 처리 비용은 미생물 및 포유류 세포의 비용과 비슷하지만, 식물의 상업적 생산에 필요한 낮은 초기 투자와 넓은 면적의 배양으로 제공되는 잠재적인 규모의 경제가 주요 이점입니다.
우리는 제1형 자가면역 당뇨병(T1D)의 주요 자가항원 중 하나인 인간 글루탐산 탈카르복실라제(hGAD65)의 65kDa 동형의 발현을 위한 생물반응기로 식물을 평가했습니다. hGAD65는 질병의 진행 과정을 분류하고 모니터링하기 위한 마커로 널리 채택되고 있으며, T1D 예방에서의 역할은 현재 임상 시험에서 조사 중입니다. 이러한 임상시험이 성공적일 경우, 재조합 hGAD65에 대한 전 세계 수요가 급격히 증가할 것입니다.
여기에서는 보조인자 PLP(pyridoxal-5'-phosphate)를 아르기닌 잔기(K396R)1로 결합하는 라이신 잔기를 치환하여 생성된 돌연변이인 hGAD65, hGAD65mut의 효소 비활성 대응물의 발현에 초점을 맞춥니다. 
hGAD65mut는 면역원성을 유지하며 식물 및 곤충 세포에서 야생형 hGAD65보다 최대 10배 더 많이 축적됩니다. hGAD65의 효소 활성은 식물 세포 대사를 방해하여 자체 합성을 억제하는 반면, 효소 비활성 형태인 hGAD65mut는 식물 세포에 더 높은 수준으로 축적될 수 있다는 가설이 세워졌습니다.
hGAD65mut의 발현을 위해 식물 생명 공학에 널리 사용되는 다양한 기술의 사용을 탐구하고 기존 발현 플랫폼(Escherichia coli 및 Baculovirus/곤충 세포 기반)과 비교했습니다.
이 연구에서는 기존 및 식물 기반 시스템으로 구성된 hGAD65mut의 발현을 위해 개발된 재조합 플랫폼을 공정 속도와 수율, 최종 제품의 품질 및 기능을 기준으로 검토하고 비교했습니다.

<table><tbody><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacteriological Grade</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM medium</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s 곤충 배지, 보충되지 않은</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II 시약</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>비타민을 포함한 MS 배지</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>식물 한천</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>독성</td></tr><tr><td>겐타마이신 황산염</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td>독성</td></tr><tr><td>간시클로비르</td><td>Invitrogen</td><td>I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린 디소</td><td>듐 Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>독성</td></tr><tr><td>카나마이신 황산염</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>독성</td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>독성 & 은대쉬; DMSO</td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td>독성</td></tr><tr><td>스펙티노마이신 디하이드로클로라이드</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG(이소프로필-&베타;-D-1-티오갈라토피라노사이드)</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td>독성</td></tr><tr><td>MES 수화물</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biochemical</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>아세토시링곤</td> 시<td>그마</td><td>D134406</td><td>독성 &ndash; 0.1 M 재고 DMSO</td></tr><tr><td>주사기 (1 ml)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-벤질아미노퓨린)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>독성</td></tr><tr><td>NAA (나프탈렌 아세트산)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td>자극성</td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>Mylan Generics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tris-HCl 버퍼를 만들기 위해 1 N HCl로 pH 조정</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>부식성</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M 재고</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>부식성, 독성</td></tr><tr><td>요소</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>독성</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>독성 &ndash; 1 M 재고, -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td>독성</td></tr><tr><td>식물 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>너무 많이 동결/해동하지 마십시오</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>가연성, 독성, 부식성 &ndash; 10% 재고</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>가연성</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>부식성</td></tr><tr><td>항글루타민산 탈카르복실라제 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>너무 많이 동결/해동하지 마십시오</td></tr><tr><td>양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합체 항토끼 항체</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>너무 많이 동결/해동하지 마십시오</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>수명 기술</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 유능한 E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A 세파로스</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Radio Immuno Assay kit</td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>Radioactive material</td></tr></tbody></table>

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 biofactories에서 표현의 비교 분석

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

식물 - 기반 시스템은 높은 품질의 생체 활성 제품의가요 성, 저비용 생산을 위해 자신의 잘 문서화 전위의 결과로 재조합 단백질의 생산에 유용한 플랫폼 여겨진다. 본 연구에서 우리는 과도하고 안정적​​인 식물 기반 발현 시스템, 전통적인 발효기 계 세포 배양 (세균성 및 곤충)에서 표적 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다. 각 플랫폼을 위해, 우리는 셋업, 최적화 및 제조 공정의 길이, 최종 제품의 품질과 수율을 설명하고 우리는 선택된 대상 재조합 단백질에 특이 잠정 생산 비용을 평가 하였다. 전반적으로, 우리의 결과는 박테리아 인해 불용성 봉입체 내에서 축적 목적 단백질의 생산에 적합하지 않은 것을 나타낸다. 한편, 식물 기반 시스템은 다목적 플랫폼 t는모자 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템보다 낮은 비용으로 선택된 단백질의 생산을 허용한다. 특히, 안정된 형질 전환 라인은 최종 생성물의 높은 수율 및 과도 발현하는 식물 빠른 프로세스 개발을 표시. 그러나, 모든 재조합 단백질은 식물 기반 시스템의 혜택을 누릴 수 있지만, 여기에 설명 된대로 최고의 생산 플랫폼, 사례 별 접근 방식을 경험적으로 결정되어야한다.

다른 생산 시스템의 목표 재조합 단백질의 이종 발현을위한 실험 설계는 여기에 설명되어 있습니다. 제 1 초점 각 시스템에서 목적 단백질의 발현을 위해 최적의 조건을 설정함으로써 다른 플랫폼의 셋업이다. 표적 단백질의 발현 hGAD65mut는 E. 중으로 유도 하였다 대장균 문화. 37 ° C에서 3 시간의 발현 후, 균체를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리에 의해 용해. 원심 분리 단계 이후에, 수용성 단백질은 불용성 봉입체 분리 및 초기 분석 (데이타 미기재) hGAD65mut은 불용성 봉입체에서 축적 prevalently 것을 증명 하였다. 재조합 단백질 용액 화는 강한 변성 속성, hGAD65mut 불가 적절한 정량을, RIA 분석을 방해하는 요소 6 M의 사용이 필요합니다. 몇 가지 전략이 될 수있다EN은, 봉입체의 형성을 제한하는 낮은 온도에서 11 균체 성장하기위한보고. 배양 물은 15 ° C, 20 ° C...

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

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