마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 형광 표지된 이식된 신경 전구 세포 또는 NPC와 마우스 척수의 형광 축삭돌기 상호 작용을 실시간으로 이미지화하는 것입니다. 이것은 NPC와 함께 이식된 마우스의 척수를 조심스럽게 제거하고 5%aros에 삽입하고 커버 슬립에 부착함으로써 달성됩니다. 척수의 방향을 변경하여 척수의 모든 영역에서 형광을 볼 수 있습니다.

두 번째 단계에서는 척수 준비를 두 개의 광자 이미징 스테이지에 배치하여 최대 10시간 동안 따뜻한 산소가 공급된 RPMI 배지와 슈퍼 융합하면서 실행 가능한 NPC를 이미징합니다. 적절한 단일 에지 diic 빔 스플리터는 YFP 및 GFP 방출을 분리하는 데 사용됩니다. 궁극적으로, 두 개의 광자 이미징을 통해 손상된 척수에서 NPC를 발현하는 GFP와 축삭을 발현하는 YFP의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

이 방법은 손상된 축삭돌기의 이식된 NPC 재수초화에 필요한 분자 및 세포 신호 신호는 무엇인지, 이러한 재수초 현상의 동역학은 무엇인지와 같은 신경 생성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 등쪽 척수를 이미지화하는 데만 사용할 수 있는 조간대 이광자 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 통해 척수의 복부 영역 깊숙이 이동한 이식된 NPC를 이미징할 수 있다는 것입니다. 척추 절개로 안락사를 확인한 후, 70% 에탄올로 마우스를 적신 다음 날카로운 가위를 사용하여 동물의 뒤쪽에서 털과 피부를 제거하고 경추 얇은 판 1 또는 C 1에서 천골 얇은 판 4 또는 S 4까지 척추를 노출시킵니다.

그런 다음 10번 칼날이 달린 메스를 사용하여 척추 좌우를 절개하여 주변 근육과 지방 조직과 분리하고 척추 주위와 척추 위쪽의 여분의 조직을 잘라냅니다. 이렇게 하면 척추뼈를 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 그런 다음 톱니 모양의 회색 집게로 척추 상단을 잡고 척수를 만지지 않도록 주의하면서 구부러진 면이 위로 향하게 하는 티타늄 곡선 밴 가위를 C 1의 노출된 척추에 삽입합니다.

가위를 오른쪽 끝까지 밀고 한 번 작게 자릅니다. 가위가 척추를 자를 때 바스락거리는 작은 소리가 들려야 합니다. 코드가 손상될 위험이 있으므로 너무 빨리 작업하거나 너무 크게 자르지 않도록 주의하면서 코드의 맨 왼쪽에서도 이 절단을 반복합니다.

척추뼈의 측면이 절단되면 집게로 단일 라미니를 들어 올릴 수 있어야 합니다. S 4에 도달할 때까지 각 층판에 대해 왼쪽 및 오른쪽 절단을 반복합니다. 척수 척추를 계속 잡고 뒤로 당깁니다.

이식 부위 위의 척추뼈는 척추가 이식 부위까지 잘리면 떨어져 나갈 수 있습니다. 척추뼈가 S 4로 절단되면 척추뼈를 내려놓아 이식 부위가 어디에 있는지 시각화하는 데 도움이 되도록 하고 이식 부위까지 약 20mm 높이를 자릅니다. 이제 11번 날이 달린 메스를 사용하여 척수 복부 쪽의 오른쪽과 왼쪽에 있는 신경절을 위쪽 끝에서 시작하여 조심스럽게 자릅니다.

그런 다음 척수가 아래를 향하도록 동물을 뒤집어 들고 닫힌 톱니 모양의 무덤 집게를 사용하여 새끼 끝에서 척수를 조심스럽게 떼어냅니다. 그런 다음 척수에 흠집을 내지 않고 척수가 손상되지 않은 한 조각으로 들어 올릴 수 있도록 남아 있는 신경절을 조심스럽게 자르고 척수를 얼음 위에 올려 놓고 영상을 위해 척수를 준비합니다. 신경 조직을 복부 쪽이 위를 향하도록 하여 파라마 시트로 옮깁니다.

그런 다음 갓 준비한 섭씨 37도, 5% 농용액 약 5밀리리터를 코드 위에 피펫으로 넣고 실온에서 응고시킵니다. 약 5분 후, 22mm 정사각형 커버 슬립에 조직 접착제를 가볍게 바르고 내장된 척수 복부 쪽을 새 퍼필 조각에 뒤집습니다. 커버 슬립을 노출된 등쪽에 부착하고 전체 제제를 새 매체에 담가 접착제를 응고시킵니다.

그런 다음 면도날을 사용하여 과도하게 응고된 아가 장미를 제거합니다. 다음으로, 튜빙 펌프에 연결된 튜빙을 섭씨 37도의 수퍼 퓨즈로 수조에 보관된 미디어 병에 삽입합니다. 분당 3밀리리터의 속도로 현미경 스테이지에서 맞춤형 이미징 웰을 통해 꽤 따뜻해진 매체.

그런 다음 척수 준비물을 복부 쪽이 25 x 담그는 대물렌즈를 향하도록 하여 우물에 넣습니다. 두 개의 광자 현미경으로 복부 척수를 이미지화하려면 표본에서 레이저 출력을 5% 미만으로 감쇠하여 광독성을 최소화하도록 900나노미터로 조정된 초티타늄 사파이어 레이저를 사용합니다. 그런 다음 접안렌즈와 명시야 광원을 사용하여 척수의 복부 가장자리에 침지 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

기준점을 설정하려면 주변 광원이 꺼져 있는지 확인합니다. 그런 다음 레이저 셔터를 열어 사용 가능한 경우 두 개의 포토닉 인용을 전환합니다. 조직에서 관심 영역을 검색할 때 더 낮은 해상도를 사용하고, 디지털 줌 없이 더 높은 볼륨을 설정하고, 최종 이미지를 획득할 때보다 더 높은 스캔 속도를 설정합니다.

세포를 찾으려면 먼저 이식 부위의 조직 가장자리에서 명시야 조명 아래에서 샘플에 초점을 맞춘 다음 형광으로 전환하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 해상도가 낮은 큰 X 및 Y 필드를 사용하여 초점이 조직 깊숙이 이동할 때 넓은 영역을 빠르게 볼 수 있습니다. 척수의 복부 가장자리 근처에서 EYFP 축삭을 관찰합니다.

여기에서 파란색으로 관찰된 콜라겐의 두 번째 조화 신호는 척수 조직 가장자리에서 가장 밝을 것입니다. 이제 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 2.5미크론 단위로 순차 초점면에서 최종 고해상도 이미지를 획득하여 Z 스택을 컴파일합니다. 이 표현에서, GFP NPC는 파란색으로 관찰되고 손상된 YFP 축삭은 노란색 의사 착색으로 관찰되며, 나중에 편집 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있으며, 척수 내의 모든 이동 물체의 신속한 정량화를 보장하기 위해 적절한 인터레이 오프셋으로 양방향 스캔을 수행하여 척수 내의 세포 속도를 결정하기 위한 이상적인 획득 프레임 속도가 초당 약 1.7프레임으로 설정되도록 합니다.

마지막으로, 적절한 소프트웨어로 이미지 파일의 자르기 매끄럽고 의사 색상을 분석하고 자동화된 프로세스를 사용하여 최종 타임랩스 비디오를 제작하기 위해 연속적인 이미징 볼륨을 빗질합니다. 이 이식된 척수 이미징 프로토콜은 척수 내의 모든 형광을 시각화하는 데 사용할 수 있지만, 이러한 이미지는 배쪽 척수 내의 단일 Z 스택에서 EYFP 축삭돌기와 대표적인 EGFP 신경 전구 세포 상호 작용을 보여줍니다. 그런 다음 연속적인 Zacks의 획득을 컴파일하여 온전한 조직 내의 실시간 세포 역학을 분석하기 위한 타임 랩스 비디오를 제작할 수 있습니다.

실제로 520 나노미터 단일 에지 이색성 및 560 나노미터 단일 에지 이색성 빔 스플리터를 사용하면 EGFP 및 EYFP 신호를 분리할 수 있으며, 여기에 설명된 대로 이미징 소프트웨어를 사용하여 녹색 및 노란색의 개별 채널을 의사 착색할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 과도한 스트레칭 없이 마우스에서 척수를 적절하게 제거하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 신경 조직의 압박 또는 우발적인 절단. 이 절차를 통해 형광 표지된 세포 또는 축삭돌기의 모든 조합을 실시간으로 이미지화하여 다양한 약물 치료 또는 조건에서 이동 또는 재수초화의 동역학이 무엇인지 포함한 추가 질문에 답할 수 있습니다.