다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

이 절차의 전반적인 목표는 세포형광 분석을 통해 상주 면역 세포의 다양한 집단을 식별하기 위해 마우스 피부에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 피부 상주 면역 세포의 다양한 집단을 식별하고 격리합니다. 이 기술을 사용하여 연구원들은 관심 있는 면역 세포 표면 메이커에 손상을 주지 않고 마우스 피부의 다른 영역에서 샘플을 쉽게 소화할 수 있습니다.

쥐의 귀에서 피부 샘플을 얻으려면 귀에서 털이 없는 부분을 잘라내고 집게를 사용하여 장기의 등쪽과 배쪽을 분리하십시오. 그런 다음 내이를 부드럽게 긁어 남아 있는 연골을 제거합니다. 덩어리 피부 샘플을 얻으려면 한 쌍의 이발기로 동물의 모든 털을 면도한 다음 제모 로션을 바르십시오.

몇 분 후 로션을 닦아내고 마우스 등 중앙을 수직으로 자르고 마우스 본체 주변의 면도한 부위 경계를 따라 절개를 계속합니다. 겸자를 사용하여 피부를 제자리에 고정하는 동시에 수술용 가위 또는 메스의 닫힌 둥근 모서리 끝으로 샘플을 분리하고 복막과 등 근육에서 피부를 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 10ml가 들어 있는 100mm 세포 배양 플레이트에 피부를 담그고 집게를 사용하여 피하 지방을 긁어냅니다.

꼬리 피부 샘플을 얻으려면 꼬리를 자르고 수술용 가위를 사용하여 꼬리 바닥에서 시작하여 끝까지 수직으로 자릅니다. 집게를 사용하여 꼬리 밑부분의 절개 부위 가장자리를 잡고 다른 집게로 꼬리 몸통을 잡고 피부를 끝 쪽으로 부드럽게 당깁니다. 피부 샘플을 부드럽게 긁어 과도한 지방을 제거하십시오.

마우스의 발을 자른 다음 발 패드에서 피부 샘플을 얻으려면 수술 용 가위를 사용하여 발목에서 손가락 시작 부분까지 발의 피부를 세로로 자르고 머리카락을 자르지 않도록주의하십시오. 그런 다음 집게로 발목 뼈를 잡고 다른 손으로 피부를 잡고 장갑을 낀 것처럼 피부를 손가락 쪽으로 당깁니다. 피부 세포에 라벨을 붙이기 위해, 각 샘플에 대해 조직을 2밀리리터의 갓 준비된 소화 칵테일이 들어 있는 35mm 페트리 접시로 차례로 옮깁니다.

가위를 사용하여 샘플을 작은 조각으로 자르고 조직 조각을 섭씨 37도에서 90분 동안 배양하고 배양 기간 동안 한 두 번 부드럽게 흔듭니다. 다음으로, 소화된 피부 조직을 접시당 FBS가 보충된 1ml의 RPMI 1640이 들어 있는 66mm 페트리 접시에 담긴 70미크론 세포 여과기에 붓습니다. 5ml의 새 배지로 스트레이너를 세척한 다음 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너의 메쉬를 통해 샘플을 짜냅니다.

플런저, 접시 및 여과기를 20ml의 새 배지로 헹구고 조직 슬러리를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 샘플이 처리된 후 세포를 원심분리하고 PBS의 안티 CD16, CD32 차단 항체 밀리리터당 2마이크로그램, 1% FBS를 더한 샘플당 100마이크로리터의 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 15분 후 표에 표시된 대로 항체 100마이크로리터를 적절한 샘플에 첨가하고 섭씨 4도에서 빛으로부터 보호하여 30분 동안 추가합니다.

배양이 끝나면 1ml의 PBS와 FBS로 세포를 세척하고 300마이크로리터의 FBS PBS에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 10분 동안 밀리리터당 2마이크로그램의 DAPI를 세포에 표시합니다. 백혈구를 분리하려면 먼저 DAPI 양성 집단을 게이트하여 죽은 세포를 제거합니다.

그런 다음 전방 산란 폭 플롯에 의한 전방 산란 영역에서 싱글릿을 선택하고 관심 있는 백혈구의 크기와 입도를 기반으로 세포를 게이트합니다. 다음으로, CD45 양성 세포를 선택한 다음 각 샘플에 대해 CD11C 및 MHC class 2 발현으로 피부 수지상 세포 집단을 식별합니다. 대식세포는 CD64 및 F480 발현으로, B 세포는 CD19 및 MHC class 2 발현으로, T 세포는 CD4 또는 CD8 발현으로 확인할 수 있습니다.

방금 시연된 바와 같이 피부 면역 세포의 분리는 피부의 모든 영역에서 50% 이상의 생존 가능한 세포 집단을 산출하며, 그 중 평방 센티미터당 5, 000에서 15, 000 사이는 CD45 양성입니다. 또한 표시된 바와 같이 1제곱센티미터의 마우스 피부에서 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 수지상 세포, 대식세포, B 세포 및 T 세포를 얻을 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 염증이 없는 피부 조직을 소화하는 방법과 팩스 분석을 위해 백혈구를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.