면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

이 절차의 전반적인 목표는 정상 및 악성 근육을 준비하고 이식하는 방법을 보여주는 것입니다. 형질전환 기증자 얼룩말 물고기에서 헝겊 두 개의 면역 결핍 얼룩말 물고기 수용자로. 근육 이식은 먼저 등쪽 근육을 절개하여 형광 표지된 근육을 분리

제브라 피쉬의 균질화 후 근육 세포를 여과하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그런 다음 세포를 헝겊 2 개의 돌연변이 얼룩말 물고기 에피 형광 현미경으로 근육 내 이식 후 10 일 이내에 이식 동물의 조직 생착을 추적하는 데 사용됩니다. 마찬가지로, 원발성 배아 횡문근 근 육종을 채취하여 현탁액으로 만들고 복강내 래그 두 돌연변이 제브라피시에 이식할 수 있습니다.

그런 다음 현미경을 사용하여 조직 생착을 추적하고 전파된 종양 세포를 다운스트림 응용 분야에서 활용할 수 있습니다. 성체 면역이 손상된 제브라피시 세포 이식을 사용하는 주요 이점은 여러 조직 및 종양 유형의 동종 이식을 위한 보편적인 플랫폼을 제공한다는 것입니다. 조직은 수용자 물고기에서 면역 억제 없이 다양한 기증자 유전적 배경에서 이식할 수 있습니다.

이 방법은 줄기세포 및 재생 생물학의 주요 질문(예: 전구세포의 자가 재생 능력)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 방법을 사용하여 헝겊 두 돌연변이 물고기에 종양을 새긴 다음 예를 들어 탄수화물 종양 성장과 같은 새로운 화학 물질을 식별할 수 있습니다. 정상 및 악성 근육 세포 준비 및 이식은 턱, 당김 및 아네스가 될 것입니다. LAL 실험실의 재능 있는 대학원생 10명에서 2명까지형광 표지된 근육을 가진 기증자 제브라 피쉬를 희생하는 것으로 시작합니다. 1.

일반적인 성인 알파 연기 RFP 기증자 물고기는 500, 000에서 200만 개의 근육 세포를 생산합니다. 이 예시 실험에서는 30마리의 기증자 물고기를 사용하여 각각 100만 개의 세포가 있는 20마리의 수용 물고기에 이식합니다. 기증자를 안락사시킨 후, 물고기는 일회용 종이 타월 위에 올려 동물을 말린다.

면도날을 사용하여 등쪽 근육을 채취합니다. 절단은 뼈와 피부 조직을 포함하여 항문 부위 뒤쪽으로 45도 각도로 이루어져야 하며, 수확한 10개의 등쪽 근육 부분을 깨끗한 페트리 접시로 옮겨야 합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 냉각된 0.9 XPBS 5%FBS 현탁액 버퍼를 추가합니다.

다음으로, 5 밀리리터 혈청 파이펫을 사용하여 조직을 완전히 균질화하여 균일 한 현탁액이 얻어질 때까지 조직을 다지고, 균질액에 2 밀리리터의 현탁액 완충액을 첨가 한 다음 파이펫을 통해 현탁액을 20 회 테이트합니다. 다음으로, 40미크론 스트레이너를 사용하여 현탁액을 여과하고 얼음 위의 50ml 원추형 튜브에 세포를 수집합니다. 절차의 나머지 부분 동안 세포를 차갑게 유지하십시오.

스트레이너에 남아 있는 조직을 2.5ml의 현탁액, 완충액으로 세척하고 50ml 원추형 튜브에 변형시킵니다. 이제 trian blue를 사용하여 생존 가능한 세포의 총 수를 계산하고 섭씨 4도에서 10분 동안 1000G에서 원심분리하여 농축합니다. 다음 333에 5%FBS를 가진 0.9 XPBS에 있는 세포를 resuspend, 마이크로리터 당 000의 세포.

기증자 세포 수가 50개 정도로 제한되는 경우, 000개의 주입된 세포도 성공적인 생착으로 이어질 수 있습니다. 2-4개월 된 헝겊, 트리카가 부족한 두 마리의 생선을 마취시키는 것으로 시작하십시오. 파마의 움직임이 느리고 물고기가 여전히 움직이고 있을 때, 물고기의 왼쪽이 위를 향하도록 젖은 수건으로 물고기를 움직입니다.

이제 미리 세척 된 10 마이크로 리터 26 게이지 마이크로 주사기를 사용하여 준비된 근육 세포 3 마이크로 리터를 주입하고 45도 각도로 현탁액 주사를 완료하고 수용 물고기의 배측 근육 조직에 직접 주입해야합니다. 근육 이식을 수행할 때 총 3마이크로리터 미만의 부피를 수용 물고기에 주입해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그런 다음 받은 물고기를 깨끗한 물고기 시스템 물이 들어 있는 회수 탱크로 조심스럽게 옮깁니다.

남은 물고기를 계속 주입하고 하나의 회수 탱크에 넣으십시오. 그 후, 이식 후 10일, 20일 및 30일의 생착 속도를 명시야 및 에피 형광 현미경을 사용하여 평가합니다. 각 종양을 개별적으로 처리합니다.

배아 횡문근 육종을 가진 물고기를 희생하십시오. 물고기를 깨끗한 페트리 접시에 넣고 면도날과 가는 집게를 사용하여 악성이 없는 조직에서 종양을 해부하고, 종양 주위를 조심스럽게 해부하면 주변 근육 조직의 오염을 최소화하면서 세포 현탁액의 순도를 높일 수 있습니다. 절개된 종양을 새 접시로 옮기고 사전 냉각된 0.9 XPBS 5%FBS 현탁액 100마이크로리터, 완충액을 추가합니다.

그런 다음 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 면도날로 조직을 다집니다. 그런 다음 1ml 피펫을 사용하여 900마이크로리터의 버퍼를 추가한 다음 트리어를 추가합니다. 세포를 해리하기 위해 피펫을 통해 현탁액을 여러 번 평가합니다.

이제 40미크론 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다. 2-4ml의 현탁액을 추가로 첨가하여 플레이트를 헹구고, 동일한 셀 스트레이너를 통해 버퍼링하고 여과합니다. 이전과 같이 세포를 집중시킵니다.

세포를 얼음 위에 두십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 완충액에 세포를 재현탁하고 트리안 블루를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 세포 현탁액의 농도를 5, 마이크로리터당 000개의 세포로 조정하십시오.

다음으로, 헝겊 2 면역 저하 수혜자 제브라피시를 마취하고 복부 쪽이 위를 향하도록 깨끗한 종이 타월 위에 놓습니다. 세척된 26초 게이지 주사기 바늘을 사용합니다. 여기에서 수혜자 제브라피쉬의 복막강에 원하는 부피를 주입합니다.

25, 000 세포가 5 마이크로 리터에 주입됩니다. 그러나 최대 10 마이크로 리터를 성공적으로 주입 할 수 있습니다. 주입된 물고기를 주 시스템으로 되돌리기 전에 회수 탱크에서 회복하도록 하십시오.

그 후, epi 형광 현미경을 사용하여 생착을 위해 수용 물고기를 추적하고 다운스트림 연구를 위해 세포를 수확합니다. 설명된 절차를 사용하여 알파 액틴 RFP 형질전환 기증자의 골격근 세포를 면역이 손상된 동형접합 헝겊 두 마리의 돌연변이 얼룩말 물고기에 이식했습니다. 골격근 조직은 DPI 배제에 의해 평가된 바와 같이 84.3%의 생존 가능한 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을 생성했습니다.

유세포 분석 결과, RFP 양성 세포는 이 공여자 세포 현탁액의 35.3%를 차지했습니다. RAG 두 동형접합 돌연변이 수용 물고기인 RAG의 등쪽 골격근에 세포를 이식하면 일관되고 강한 이식편이 되었습니다. 이는 수혜자 물고기에서 다핵 형광 근육 섬유의 형성에 의해 확인되었는데, 야생형 수혜자 물고기는 근육 섬유를 생착하지 못했습니다.

그러나 이식 후 10일이 지났을 때 돌연변이 제브라 피쉬 14마리 중 9마리가 주사 부위 근처에 RFP 양성 근육 섬유를 함유하고 있었습니다. 중요한 것은 생착된 RFP 양성 근육이 이식 후 최소 30일까지 지속되었다는 것입니다. 유사하게, 배아 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma) 또는 ERMS를 가진 두 돌연변이 물고기의 RAG 이식 후 강력한 생착이 이루어졌습니다.

생착된 ERMS는 일차 ERMS 종양 세포와 조직학적 특징을 공유하여 형광 분석에 의해 평가된 바와 같이 이질성을 유지했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수혜자 성인 면역 저하 물고기를 사용하여 정상 및 악성 조직의 근육 이식 및 복강 내 이식을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이에 따라 형광 활성화 세포 분류, 제한 희석 이식 분석 및 Real-Time PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 서로 다른 종양 하위 집단 간의 기능적 및 분자적 차이를 평가할 수 있습니다.

전반적으로, 우리의 접근 방식은 형광 근육과 악성 조직을 면역이 손상된 RAG 두 돌연변이 물고기에 강력하고 장기적인 생착을 허용합니다. 이 접근법의 이점은 수용 어류에 대한 사전 면역 억제가 없을 때 생착이 발생하고 기증자와 수용 동물의 면역 일치가 필요하지 않다는 것입니다.