면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형질 전환 공여체 제브라피시에서 rag2 면역 결핍 제브라피시 수용체로 정상 및 악성 근육을 준비하고 이식하는 방법을 시연하는 것입니다. 근육 이식은 먼저 등쪽 근육의 해부를 통해 형광 표지된 근육을 분리하는 과정이 포함됩니다.

제브라피시 근육 세포를 균질화한 후 여과하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그 다음, 이 세포들을 rag2 돌연변이 제브라피시의 근육 내에 이식합니다. 이식 후 이르면 10일째부터 에피 형광 현미경을 사용하여 수용 동물 내의 조직 생착 여부를 추적합니다. 이와 유사하게, 일차 배아 횡문근육종을 수확하여 현탁액으로 만든 후 rag2 돌연변이 제브라피시의 복강 내에 이식할 수 있습니다.

그 후 현미경을 사용하여 조직 생착을 추적하며, 증식된 종양 세포는 후속 응용 연구에 활용할 수 있습니다. 성체 면역 결핍 제브라피쉬 세포 이식을 사용하는 주요 장점은 여러 조직과 종양 유형의 동종 이식을 위한 보편적 플랫폼을 제공한다는 점입니다. 수신어(recipient fish)에 면역 억제 처리를 할 필요 없이 다양한 공여자 유전적 배경의 조직을 이식할 수 있습니다.

이 방법은 전구세포의 자가 재생 능력과 같은 줄기세포 및 재생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이러한 방법을 사용하여 rag2 변이 물고기에 종양을 이식한 후, 예를 들어 종양 성장을 억제하는 새로운 화학 물질을 식별할 수도 있습니다. 정상 및 악성 근육 세포의 준비와 이식을 시연할 사람은 chin, tang, anes입니다. LAL 실험실의 우수한 대학원생 2명과 함께 진행하십시오. 형광 표지된 근육을 가진 공여체 제브라피시를 희생시키는 것으로 시작하십시오. One.

일반적인 성체 alpha acting RFP 공여어에서는 500,000개에서 200만 개의 근육 세포를 얻을 수 있습니다. 본 예시 실험에서는 30마리의 공여어를 사용하여 20마리의 수용어에 각각 100만 개의 세포를 이식합니다. 공여어를 안락사시킨 후, 일회용 페이퍼 타월 위에 올려 동물을 건조시킵니다.

면도날을 사용하여 등 근육을 채취합니다. 절개는 항문 부위 뒤쪽으로 45도 각도로 수행하며, 이때 뼈와 피부 조직을 포함해야 합니다. 채취한 등 근육 절편 10개를 깨끗한 Petri dish로 옮깁니다. 그 다음 냉각된 0.9 XPBS 5%FBS 현탁 완충액 500 µL를 첨가합니다.

다음으로, 5 mL serological pipette을 사용하여 조직을 완전히 균질화하여 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 조직을 잘게 다집니다. 균질물에 2 mL의 suspension buffer를 추가한 후, pipette을 사용하여 현탁액을 20회 반복하여 옮깁니다. 그 후, 40 micron strainer를 사용하여 현탁액을 여과하고, 얼음 위에 놓인 50 mL conical tube에 세포를 수집합니다. 이후의 모든 과정 동안 세포를 차갑게 유지하십시오.

체에 남은 조직을 2.5 mL의 현탁액 완충제로 세척하고 50 mL 원심분리관에 걸러 넣습니다. 이제 트라이판 블루를 사용하여 생존 세포의 총 수를 측정하고, 4°C에서 1000 G로 10분 동안 원심분리하여 세포를 농축합니다. 그 다음 5% FBS가 포함된 0.9 X PBS에 세포를 µL당 333,000개 농도로 재현탁합니다.

공여 세포의 수가 제한적일 경우, 50,000개의 주입 세포만으로도 성공적인 생착을 유도할 수 있습니다. 2~4개월 된 rag2 결핍 물고기를 trica로 마취시키는 것으로 시작합니다. 지느러미의 움직임이 느려지고 물고기가 정지되면, 물고기의 왼쪽 면이 위로 향하게 하여 젖은 수건 위로 옮깁니다.

이제 미리 세척된 10 µL 26 G 마이크로 시린지를 사용하여 준비된 근육 세포 현탁액 3 µL를 주입합니다. 주입은 45도 각도로 수 recipient fish의 배외측 근육에 직접 수행해야 합니다. 근육 내 이식을 수행할 때, 수 recipient fish에 주입되는 총 부피가 3 µL를 초과하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 그 후 recipient fish를 깨끗한 어류 시스템 용수가 담긴 회복 수조로 조심스럽게 옮깁니다.

남은 물고기들에게 계속해서 주입하고, 이들을 하나의 회복 탱크에 넣습니다. 이후 이식 후 10일, 20일, 30일에 명시야 및 에피 형광 현미경을 사용하여 생착률을 평가합니다. 각 종양은 개별적으로 처리합니다.

배아 횡문근육종이 있는 물고기를 희생시킵니다. 물고기를 깨끗한 페트리 접시에 넣고 면도날과 미세 핀셋을 사용하여 악성 종양을 비악성 조직으로부터 분리합니다. 종양 주변을 주의 깊게 절제해야 주변 근육 조직의 오염을 최소화하고 더 높은 순도의 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 절제한 종양을 새 접시로 옮기고, 미리 냉각시킨 100 µL의 0.9 XPBS 5% FBS 현탁액 완충액을 첨가합니다.

그 후 면도날을 사용하여 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 조직을 잘게 다집니다. 그런 다음 1mL 피펫을 사용하여 버퍼 900µL를 추가로 넣고 트리어(trier)를 사용합니다. 세포를 분리하기 위해 피펫으로 현탁액을 여러 번 통과시킵니다.

이제 40 micron 셀 스트레이너(cell strainer)를 통해 세포를 필터링합니다. 현탁액과 버퍼 2~4 mL를 추가로 넣어 플레이트를 헹군 뒤, 동일한 셀 스트레이너로 필터링합니다. 이전과 동일한 방법으로 세포를 농축합니다.

세포를 얼음에 보관하십시오. 그 다음, 100 µL의 버퍼에 세포를 재현탁하고 tripan blue를 사용하여 생존 세포 수를 측정하십시오. 세포 현탁액의 농도를 µL당 5, 000 cells로 조정하십시오.

다음으로, 면역 결핍 수혜 제브라피쉬 두 마리를 마취시킨 후 배면이 위로 향하도록 깨끗한 페이퍼 타월 위에 놓습니다. 세척된 26G 게이지 주사 바늘을 사용하여, 여기 수혜 제브라피쉬의 복강 내에 원하는 부피만큼 주입합니다.

5 µL의 부피로 25,000개의 세포를 주입합니다. 하지만 최대 10 µL까지 성공적으로 주입할 수 있습니다. 주입된 물고기는 메인 시스템으로 되돌리기 전 회복 수조에서 회복시키십시오.

이후, 형광 현미경을 사용하여 수용어의 생착 여부를 추적 관찰하고, 후속 연구를 위해 세포를 회수합니다. 설명된 절차를 사용하여 alpha actin RFP 형질전환 공여어의 골격근 세포를 면역 결핍 homozygous rag two 돌연변이 제브라피쉬에 이식했습니다. 골격근 조직을 통해 단일 세포 현탁액을 제조하였으며, DPI 배제법으로 평가한 결과 84.3%의 세포 생존율을 보였습니다.

유세포 분석 결과, RFP 양성 세포는 이 공여자 세포 현탁액의 35.3%를 차지했습니다. RAG2 동형접합 돌연변이 수용어의 배측 골격근에 세포를 이식한 결과, 일관되고 강력한 이식편 형성이 관찰되었습니다. 이는 수용어 내에서 다핵성 형광 근섬유가 형성된 것을 통해 확인되었으며, 야생형 수용어에서는 근섬유 이식이 이루어지지 않았습니다.

하지만 이식 후 10일째에, 14마리의 돌연변이 제브라피시 중 9마리의 주입 부위 근처에서 RFP 양성 근섬유가 확인되었습니다. 중요한 점은, 이식된 RFP 양성 근육이 이식 후 최소 30일까지 유지되었다는 것입니다. 마찬가지로, 배아 횡문근육종(ERMS)을 이식한 RAG2 돌연변이 제브라피시에서도 강력한 생착이 이루어졌습니다.

이식된 ERMS는 일차 ERMS 종양과 조직학적 특징을 공유했으며, 형광 분석을 통해 평가한 결과 종양 세포의 이질성이 유지되었음을 확인했습니다. 이 영상을 시청한 후, 성체 면역 결핍 제브라피쉬 수용체를 사용하여 정상 및 악성 조직의 근육 이식과 복강 내 이식을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이후 형광 활성 세포 분류(FACS), 한계 희석 이식 분석 및 실시간 PCR과 같은 다른 방법들을 통해 서로 다른 종양 하위 집단 간의 기능적 및 분자적 차이를 평가할 수 있습니다.

종합적으로, 우리의 접근 방식은 면역 결핍 RAG 2 돌연변이 물고기에 형광 근육 및 악성 조직을 견고하고 장기적으로 이식하는 것을 가능하게 합니다. 이 방식의 장점은 수용자 물고기에 대한 사전 면역 억제 없이도 이식이 이루어지며, 공여자 동물과 수용자 동물 간의 면역 일치가 필요하지 않다는 점입니다.