조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 퇴행 및 재생 및 암 연구 연구를 위해 생체 내 및 체외에서 두 개의 쥐 유도 mase 노킹 대립유전자를 조작하는 것입니다. 이는 하이드록시 타목시펜 정제를 동물에 이식하여 생체 내에서 메이스를 재활성화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 동물에서 신경 줄기세포를 분리한 다음 하이드록시 타목시펜으로 처리하여 시험관 내에서 MAS를 재활성화합니다.

다음으로, C, 2, 혼성화 또는 물고기의 텔로미어 형광은 mase의 활성을 확인하기 위해 배양된 세포와 형성 및 고정 파라핀 내장 뇌 조직 모두에서 수행됩니다. 그 결과, 하이드록시 타목시펜 치료는 마제 활성을 강력하게 재활성화할 수 있으며, 이는 노화 표현형을 완화하고 조직병리학적 검사를 기반으로 종양 형성을 촉진할 수 있음을 보여주었습니다. 이 방법은 TH 외상 활동을 조절하여 노화 과정을 늦출 수 있는지 여부 또는 암을 치료하기 위해 Thomas를 구체적으로 표적으로 삼는 방법과 같은 노화 및 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 강사 Dr.Takashi Shingu와 기술자 April Un이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Turt ER 및 Lock Stop Lock Turt 대립유전자의 생성으로 이 절차를 시작하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취하기 위해 주입을 진행하기 전에 모든 수술 도구를 살균합니다. 깊은 마취에 도달한 후 마취된 동물을 유도실에서 제거하고 이소 불소 챔버에 연결된 튜브 안에 머리를 유지합니다.

쥐의 발 패드를 꼬집어 동물이 깊이 마취되었는지 확인합니다. 또한 양쪽 눈에 연고를 바르고 눈이 빠지는 것을 방지하기 위해 포비돈 요오드 용액으로 쥐의 등을 닦습니다. 다음으로, 천천히 방출되는 하이드록시 타목시펜 펠릿을 등 피부 아래에 정밀 투관침으로 주입합니다.

그리고 펠릿을 두 어깨 사이의 정중선까지 끝까지 밀어 넣습니다. 상처 클립 애플라이어로 절개 부위를 밀봉하고 마우스의 회복을 모니터링합니다. 마취를 위해.

하루 동안 쥐의 뇌를 꺼내고 후각구와 소뇌를 제거하여 4개의 뇌를 유지합니다. 4개의 뇌 조직을 1밀리리터의 저온 배양 배지에 보관하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 1시간 이내에 신경 조직을 처리해야 합니다.

조직의 무게를 측정하여 소화당 400mg 한도를 초과하지 않도록 합니다. 35mm 직경의 페트리 접시 뚜껑에 뇌를 놓고 메스로 뇌를 부수십시오. 1ml 피펫 팁을 사용하여 Hank's balance salt 용액 또는 HBSS 1ml를 추가합니다.

그런 다음 HBSS 원심분리기로 300배 G로 실온에서 2분 동안 헹군 후 조각을 15ml 튜브에 다시 피펫으로 넣습니다. 상등액을 조심스럽게 제거한 후 예열된 효소 1, 950마이크로리터를 첨가합니다. 최대 400mg의 티슈당 1개를 섞으십시오.

15ml 튜브에 시료를 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 튜브를 뒤집거나 흔들어 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 용액, 3-10 마이크로 리터의 용액 4를 추가하여 조직 샘플 당 2 개의 효소를 준비합니다.

그런 다음 샘플에 부드럽게 반전시켜 혼합하고 팁이 넓은 화재 광택 페이스트 피펫을 사용하여 기포 형성을 피하면서 천천히 위아래로 10회 피펫팅하여 조직을 기계적으로 해리합니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하고 3분마다 튜브를 뒤집습니다. 다음으로, 50 밀리리터 튜브에 놓인 70 미크론 세포 여과기에 세포 현탁액을 적용합니다.

세포 여과기를 통해 10ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 적용합니다. 그런 다음 세포 스트레이너를 버리고 세포 현탁액을 300배 G에서 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 완전히 흡인하여 실온을 설정합니다.

줄기 세포 배지로 세포를 필요한 부피로 재현탁시켜 잠금 장치의 텔레 어레이를 활성화하고 잠금을 중지합니다. 터트 신경 줄기 세포. 100마이크로몰의 하이드록시 타목시펜으로 세포를 2일 동안 처리하여 emase 및 turt er 신경 줄기 세포를 활성화합니다.

텔로미어 피쉬를 수행하기 위해 100 마이크로몰 하이드록시 타목시펜으로 세포를 배양 배지에 유지합니다. 먼저, 포르말린 고정 및 파라핀 포매 또는 FFPE 조직 절편에 대해 배양된 세포의 중기 염색체를 준비합니다. 샘플을 자일렌으로 분리하고 에탄올 시리즈에서 각각 5분, PBS에서 5분 동안 재수화합니다.

그런 다음 1-2시간 동안 메탄올과 아세트산의 3:1 비율로 섹션을 접미사합니다. 차가운 에탄올 시리즈로 섹션을 각각 5분 동안 탈수하고 섭씨 37도에서 5분 동안 하나의 XPBS로 자연 건조 세탁합니다. 다음은 자연에서 4%포름알데히드의 염색체를 섭씨 37도에서 2분 동안 노출시킵니다.

이전과 같이 차가운 에탄올 계열의 섹션을 탈수하고 건조되면 자연 건조하고 각 슬라이드에 펩타이드 핵산 혼성화 혼합물 12-25 마이크로 리터를 적용합니다. 고무 시멘트로 커버 슬립을 밀봉하고 자연 염색체 준비물과 조직 절편을 섭씨 80도에서 4분 동안 게시합니다. 그런 다음 습한 챔버에서 2-4시간 동안 실온 또는 섭씨 37도에서 혼성화합니다.

다음으로, 세척 버퍼를 사용하여 실온에서 샘플을 15분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS로 실온에서 5분 동안 세탁하고 트윈을 23회 세탁합니다. 마지막으로, 현미경 검사를 위해 DPI 또는 근적외선 형광으로 슬라이드를 대조 염색합니다.

텔로미어가 텔로미어 기능 장애 마우스에서 일시적으로 재활성화되었을 때, 텔로미어 재활성화가 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 뇌 및 고환과 같은 여러 기관에서 퇴행성 표현형을 개선할 수 있었습니다. 배양된 체외 신경 줄기세포는 후기 세대 G 4개의 잠금 정지 잠금, TURT 및 G 4개의 turt ER 마우스에서 분리되었습니다. 텔로미어가 기능 장애 신경 줄기세포에서 재활성화되었을 때, 자기 재생 능력이 크게 증가했다.

텔로미어 기능 장애의 맥락에서 종양 발생에 대한 mase 재활성화의 영향을 결정하기 위해 체외 신경 발생도 크게 향상되었으며, 전립선 종양 모델에서 타목시펜 치료에 의한 mase 재활성화를 수행했습니다. Endot thic T 세포 림프종 모델. 이 치료는 두 모델 모두에서 종양 발생을 크게 향상시키는 결과를 가져왔습니다.

마지막으로, 텔로미어 피쉬는 FFPE, 마우스 뇌 조직 및 중기 염색체에 대해 수행되었습니다. 이 이미지에서 빨간색은 DNA 녹색이 텔로미어 염색을 나타내고 청록색은 중심체가 염색되었음을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 mTOR ER에서 외상 활동을 활성화하고 정지 잠금 장치, mTOR 동물 및 세포주를 잠그는 방법, 그리고 이를 사용하여 암 및 병원체에 대한 질문을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.