횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

이 절차의 전반적인 목표는 경추 척수의 횡격막 운동 뉴런에 의한 횡격막의 기능적 및 형태학적 신경 분포를 정량적으로 평가하는 것입니다. 이것은 동측 횡격막 신경의 상부 최대 자극에 따라 마취된 동물의 반쪽 횡격막에서 복합 근육 활동 전위 기록을 수행함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 개별 신경근 접합부의 신경 분포를 형태학적으로 평가하기 위해 전체 마운트 다이어프램 면역조직화학을 수행하는 것입니다.

궁극적으로, 복합 근육 활동 전위와 신경근 접합 분석을 결합하면 CNS 및 PNS 질환의 설치류 모델에서 횡격막 신경 분포를 정량적으로 연구할 수 있는 강력한 접근 방식을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 척수 손상 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 횡격막 기능을 성공적으로 회복하기 위해 치료 개입을 사용할 수 있습니까? 이 기술의 의미는 외상성 척수 손상 및 ILS와 같은 질병에 대한 치료로 확장되는데, 이는 횡격막 호흡 기능이 이 두 가지 쇠약해지는 상태 모두에서 환자의 결과에 중요한 역할을 하기 때문입니다.제 연구실의 박사후 연구원인 Kali 박사와 Wright 박사 연구실의 학부생인 Melanie Martin이 시연할 것입니다. 그리고 제 연구실의 연구 기술자인 Tamara holla입니다.

동물을 마취한 후 등쪽이 아래를 향하도록 수술 보드에 놓고 앞다리를 보드에 고정합니다. 그런 다음 두개골 기저부에서 정중선 양쪽의 복부 쪽으로 복부 표면을 면도합니다. 피부가 청소되면 전극을 배치하고 접지를 꼬리에 부착한 다음 기준 전극을 반대쪽 하복부에 피하로 배치합니다.

기록 전극은 자체 접착 부분에 전도성 젤을 준비한 다음 편측 늑골 가장자리를 따라 부착해야 합니다. 이제 경피적으로 반 센티미터 떨어진 기관(기관) 측면과 쇄골(clavicle)보다 위쪽에 있는 자극 전극을 놓습니다. 그들은 피부에 수직으로 들어가야 하며 약 1cm 깊이로 가야 합니다.

이러한 전극은 잘 고정되어야 하며 손으로 하는 것이 가장 좋습니다. 모든 전극을 적절한 자극기 및 증폭기에 부착하십시오. 수집된 데이터는 컴퓨터에 기록되어야 합니다.

분석을 위해 단극 자극의 자극 파라미터를 0.5밀리초, 1헤르츠 최고 최대 펄스로 설정합니다. 진폭은 6볼트에서 8볼트까지 다양할 수 있습니다. 흥미 유발 시간을 30초로 설정하고, 원하는 경우 일주일에 한 번 정도 각 동물의 기준선에서 최대 진폭 기록을 사용하여 10번의 연속 자극에 대한 반응의 평균을 구합니다.

동물 취급은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 주사 가능한 마취제를 과다 투여하여 동물을 안락사시킨 후 메스나 가위를 사용하여 개복술을 시행합니다. xiphoid process에서 정중선을 따라 조금씩 절개합니다.

그런 다음 메스와 겸자를 사용하여 피부와 결합 조직을 근육 조직에서 조심스럽게 분리하십시오. xiphoid process를 위로 당겨 횡격막을 제거하고 주변 뼈에서 횡격막을 잘라냅니다. 횡격막 근육이 손상되지 않도록 주의하십시오.

다이어프램 상측을 입체경 아래에서 PBS의 4% 파라폼 알데히드로 채워진 실리콘 라인 접시로 옮깁니다. 횡격막을 둘러싼 조직을 고정하여 횡격막을 팽팽하게 늘립니다. 그런 다음 집게와 가위를 사용하여 위쪽 표면에서 결합 조직을 제거합니다.

정착액이 20분 동안 작동하도록 한 다음 PBS에서 10분 동안 3회 세척하여 제거합니다. 다음으로, PBS에 0.1 몰 글리신과 2% BSA를 30분 동안 도포합니다. 그런 다음 다이어프램을 rod Domine conjugated alpha bungalow toin 용액에 15 분 동안 배양합니다.

고정액에 대해 한 것처럼 PBS로 방갈로 독소를 씻어냅니다. 다음으로, 수조를 차가운 메탄올로 바꾸고 조직을 섭씨 영하 20도에서 5분 동안 냉각합니다. 5 분 후에 즉시 메탄올을 제거하고 이전과 같이 PBS로 조직을 세척하십시오.

이제 0.2%TBP 용액을 사용하여 1시간 동안 블록을 적용합니다. 용액을 0.2%TBP에서 1차 항체로 변경하고 조직을 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 밤새 배양합니다. 다음날, 0.2%TBP에서 10분 3회 세척하여 1차 항체를 제거한 다음 2차 항체 용액에서 조직을 흔들면서 한 시간 동안 배양하고 나중에 어둠 속에서 PBS를 3회 세척하여 2차 항체를 제거하고 조직을 어두운 곳에 유지합니다.

그런 다음 입체경으로 근육의 상부 표면에 있는 더 많은 결합 조직을 제거합니다. 세척이 완료되면 직립 에피 형광 현미경으로 조직을 마운트하고 이미지화하여 염색된 반형 횡격막의 형태를 정량적으로 분석합니다. 20 배와 40 배 배율을 사용 하면 다이어프램이 마운트 전체로 분석되기 때문입니다.

대부분의 형광 염색은 초점이 맞지 않습니다. 표준 현미경을 사용하여 실시간으로 분석을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 개별 NM js의 형태를 적절하게 점수화하기 위해 척수의 지형적 신경 분포 패턴을 기반으로 분석을 위해 근육을 세 부분으로 나눕니다.

복부 가장 많은 영역에서 시작하여 항체 침투가 완료되지 않기 때문에 근육 섬유를 따라 보이는 모든 njs를 분석하고, 표면에서 처음 3-4 개의 섬유보다 더 깊게 분석하지 마십시오. 온전한 NMJ는 두껍고 신경 말단의 모든 영역이 기저 근육 아세틸콜린 수용체와 완전히 겹칩니다. 부분적으로 불안해진 NMJ는 기저 아세틸콜린 수용체의 일부 영역이 비어있을 것입니다.

완전히 탈신경화된 NMJ는 신경 말단의 아세틸콜린 수용체와 대응하지 않습니다. 이 지역의 다른 njs는 다른 형태를 보여야 하거나 항체의 성공 여부를 보여주어야 합니다: 하나 이상의 말단 전 축삭이 NMJ를 신경 분포시키는 경우 침투가 문제가 될 것입니다. NMJ는 곱셈입니다.

이 경우 신경 분포 제거가 발생했을 수 있으며, 그 후 재신경 분포가 발생했을 수 있습니다. 신경 말단에서 기저에 있는 아세틸콜린 수용체와 겹침이 있고 말단 전 축삭돌기가 매우 얇으면 NMJ가 얇게 신경이 분포되어 있습니다. 이것은 또한 reation의 표시입니다.

성체 spra와 관련된 실험에서 Dolly 쥐 대조군은 후판 절제술을 받았고 다른 대조군은 편측 반타 타박상 SCI를 받았습니다. C 4시. 5주 후, 반쪽 횡격막에서 동측측에서 후판 절제술 또는 부상 부위까지 최대 cmap 진폭이 기록되었습니다.

돌연변이된 인간을 발현하는 쥐와 관련된 다른 실험에서 후판 절제술만 대조군 쥐와 비교하여 SCI 쥐에서 크게 감소했기 때문에 D 하나의 단백질이 LS의 모델로 사용됩니다. 반쪽 횡격막의 NMJ 형태는 야생형 대조 동물에서 완전히 손상되지 않았습니다. 그러나 형질전환 쥐에서 njs는 상당한 병리학을 보였다. 일부는 화살촉으로 표시된 완전한 탈신경을 보여주었습니다.

다른 njs는 화살촉으로 표시된 대로 부분적으로 denervated 되었고, 오른쪽의 NMJ에서 볼 수 있듯이 다른 njs는 다중 신경이 분포되어 있었고 다른 것들은 화살촉 머리로 표시된 얇은 말단 전 축삭돌기를 가지고 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 횡격막 운동 뉴런에 의한 횡격막의 기능적 및 형태학적 신경 분포를 정량적으로 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 모든 실험에 행운을 빕니다.