Name: 인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 학습하세요 HIV-1 복제 피트니스 측정을 위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석법입니다. DNA 플라스미드를 이용한 바이러스 클론 구축, 이중 감염 실험, 실시간 PCR 및 Sanger 시퀀싱을 통한 바이러스 비율 분석 방법을 익히세요.

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이 연구는 미국 공중 보건 서비스 보조금 P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 및 워싱턴 대학교 에이즈 연구 센터의 기능 프로파일링 및 컴퓨터 생물학 핵심(P30 AI027757)의 지원을 받았습니다.

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<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
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<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 표현 의견은 여기에 저자의 견해이며 공식 또는 미 국방부 또는 육군의 부서의 의견을 나타내는 것은 아니다.

재조합 HIV-1 분자 클론 및 성장 경쟁 분석의 건설 : 제시된 프로토콜은 두 가지 주요 부분으로 구성되어있다. 이중 감염된 세포 배양 물에서 두 바이러스와 구별하기 위해, 경쟁 분자 클론을 RT-qPCR에 프라이머 - 프로브 분석으로 또는 생거 시퀀싱에 의해 검출 될 수있는 서열 태그를 포함하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 HIV-1의 NL4-3 VIF 동일한 영역을 점유하고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하지만 여섯 동의어 돌연변이 차이 VIFA 및 VIFB 태그를 사용한다. 이러한 돌연변이는 영향을주지 나타냈다 바이러스 복제의 적합성 (20). 이 프로토콜에서 사용하는 PCR 계 클로닝 방법은 제한 부위 기반 복제에 비해 클로닝 사이트를 선택하는데 더 많은 유연성을 제공한다. 그러나, PCR 클로닝의 효율은 인서트의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 인서트 크기의 전류 제한은 ~ 5킬로바이트 (34)이다. PCR 기반의 복제 및 사이트 감독 mutagenesi 들어S, 고 충실도 DNA 중합 효소의 사용은 추가적인 돌연변이 가능성을 줄이기 위해 매우 중요하다. 제품의 충분한 양을 산출하기 위해 필요한 PCR 사이클의 최소 수의 사용은 권장된다. 우리의 경험에서, 우리는 여기에 설명 된 PCR 기반의 복제 및 부위 특이 적 변이 단계 후 여분의 돌연변이를 검출하지 않았다. 그럼에도 불구하고 PCR 제품은 원치 않는 돌연변이를 확인하기 위해 서열화한다. 이상적으로, 전체 HIV 코딩 영역을 resequenced해야합니다. 적어도 세 개의 샘플링 시점은 지수 적 성장 단계 9에서 검토되어야한다. 바이러스의 성장 동역학을 먼저 성장 경쟁을위한 적절한 배양 시간 및 샘플링 시간의 포인트를 결정하기 위해 매일 샘플링을 사용하여 설정되어야한다. 바이러스 성 성장 반응 속도에 영향을 미치는 하나의 요인은 감염 (MOI)의 다양성이다. 그것은 더 RO을 수득 하였다 나타낸 바와 같이이 프로토콜은, monoinfection 성장 경쟁 모두 0.005 총 MOI를 사용낮은 MOIs 9보다 흉상 결과. 그럼에도 불구하고, 낮은 MOIs 필요하다면 장기간의 지수 성장기를 얻기 위해 사용되지만, 결과의 일관성을 희생 할 수있다. 이 프로토콜은 바이러스의 체력 차이가 미리 일반적으로 알려지지 않은 것으로 가정하여, 50:50의 초기 감염 비율을 의미한다. 바이러스 복제 속도론에 상당한 차이점을 시사 예비 데이터가있는 경우에는, 동일하지 않은 입력 비율의 사용이 적합하다. 이러한 경우에는, 70:30의 비율은 감염 바이러스가 덜 맞는 초과 9에 배치 큰 차이 니스의 검출을 허용하도록 권장한다. 바이러스 성장 속도론 및 HIV-1 서브 타입 B를 사용하여 경쟁 분석 최적화 된 성장을 수행하기위한 TCID 50을 결정하기위한 프로토콜은, PBMC를 하나의 기증자로부터 NL4-3 COTB-P24 및 PBMC를이 HIV-하는 일관된 감수성을 증명하고있다 체외에서 1 감염. 배양 기간이 프로토콜에서 제공 샘플링 시점에 인간 PBMC를 HIV-1 바이러스 M 군을 연구에 적합한 것으로 보인다. 단일 소스에서 PBMC를 사용하는 것은 매우 바이러스 복제가 다른 공여 세포 (35)에 따라 다릅니다 수있는 일관성있는 결과를 얻을 것을 권장합니다. 교체는 동일한 풀 모든 실험에 걸쳐 사용되는 것을 규정 덜 바람직하지만, 복수의 공여체로부터 풀링 된 PBMC를 사용할 수있다. 또 다른 대안은 세포주의 사용이다. 여기에 제시된 프로토콜 T 세포주 CEMx174 23,36 성공적으로 사용되었다. 그러나, 세포의 파종 번호 재 최적화 일관된 세포 성장을 달성하는 것이 중요하다. 그것이 성장 경쟁 단계에 적절한 샘플링 시점을 결정하기 위해, 상이한 세포주에서 다를 가능성이 바이러스 성 성장 동역학은 또한 재 확립되어야한다. 체력을 계산하는 바이러스 성 비율을 결정하는 두 가지 방법이 protoc에 포함되어 있습니다OL. 첫째는 각 샘플링 시점에서 바이러스의 cDNA 카피 수를 측정하기 위해 RT-qPCR에 사용. 바이러스 복제 적당이어서 cDNA의 사본 번호에 기초하여, 바이러스의 비로부터 계산 하였다. 대안으로, 바이러스 성 비 VifAB 태그 사이트의 크로마토 그램의 피크 높이의 비율에 기초하여 결정될 수있다. 두 가지 방법이 유사한 결과 (도 4)을 수득 하였다. 크로마토 그램의 피크 높이 방법은 서열 태그 조작없이 다른 HIV-1 균주에 적용될 수있다. RT-qPCR의 바이러스 변이체를 구별하기위한 프라이머 또는 프로브의 사용은 제 신중하게 평가되어야 들어 (20 참조). 그럼에도 불구하고, RT-qPCR에 같은 지수 성장기 내의 제 시점에서 그와 같은 바이러스 성 RNA의 소량의 샘플과 더 나은 민감도를 제공한다. 바이러스 cDNA를 직접 측정은 또한 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 발생할 수있는 기술적 인 문제를 감지 할 수 있습니다. 서열 태그 분자 클론을 사용하는 것은 비용 효율적인 솔루션을 제공 tRT-qPCR에 방법 O를, 같은 프라이머 및 프로브의 두 쌍은 여러 바이러스를 연구하기 위해 필요하다. 이 전략은 또한 시퀀싱이 연구에서 모든 바이러스에서 동일한 사이트에서 수행되는 것처럼 순서로 피크 높이 변화의 문제, 이웃 기지 (37)에 의한 크로마토 그램 방지 할 수 있습니다. RT-qPCR에와 생거 시퀀싱 생성 된 PCR 제품은 다른 방법과 함께 사용은 개별 클론 12, 13의 대량 순서, HTA 4,7,17,19, 또는 올리고 뉴클레오티드 결찰 분석 (OLA) (38) 바이러스 성 비율을 결정하기 위해 할 수 있습니다 .

바이러스 복제의 니스는 주어진 환경에서 한 감염성 자손을 생산하는 바이러스의 능력으로 정의하고 2 시간 이상 인구 수준에서 바이러스 변이체의 유병률을 결정하는 중요한 요인이다. 생체으로 피트니스 연구는 HIV-1과 같은 병원성 인간 바이러스, 다양한 vitro와 in와 가능하지 않은 생체 복제 피트니스 분석 약제 내성과 면역 탈출 돌연변이, 상위 성 및 진화에서 발생하는 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 개발되었다 바이러스 성 인구 3-6. 다른 피트니스 분석 중 성장 경쟁 분석은 생체 -1,7,8,8- 발생으로 두 개 이상의 바이러스 변종, 정확하게 동일한 환경 조건 하에서 동일한 세포 인구를위한 경쟁으로, 피트니스 차이에 더 민감하고 유효한 조치를 얻을에 인식하고 있습니다. 성장 경쟁 실험을 시작, 여러 variab 전레 감염의 다양한 다중성 (MOI), 바이러스의 입력 비율 및 분석을위한 샘플링 타이밍의 사용을 포함하여 결정되어야한다. 우리는 바이러스 성 성장 속도론에 경쟁 실험의 결과에 이러한 매개 변수의 효과를 공부하고, 세포 배양 9 HIV-1의 적합성에 강력한 측정에 필요한 핵심 요소를 확인했다. 분석 변수 외에도, 성장 경쟁 실험에서 바이러스 변이체를 정량을위한 다양한 방법이있다. 10,11 또는 벌크 클론 시퀀싱 12,13은 관심 부위 (들)에서 뉴클레오티드 주파수에 기초하여 상기 경쟁 바이러스의 비율을 결정하기 위해 사용되어왔다. 상대 체력은 시간이 지남에 따라이 비율의 변화에​​서 파생됩니다. DNA 시퀀싱 서비스를 광범위하게 사용할 수있는이 방법은 편리하다. 병렬 대립 유전자 특정 염기 서열 (PASS) 방법은 여러 사이트에서 시퀀싱 및 재조합 (14)의 검출을 가능하게 </sup&gt;뿐만 아니라 특별히 개발 시약 및 탐지 시스템을 필요로한다. 본질적으로,이 방법은 관심 영역의 뉴클레오티드 차이의 소수의 바이러스 균주를 개발하기 위해 연구 하였다. 다른 방법은 작은 리포터 유전자를 시퀀싱하여 경쟁 바이러스 heteroduplex를 추적 분석 (HTA) 4,7,17,19 구별 또는 전사 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 반대로 태그 15 또는 돌연변이 4,16-18 동의어를 사용 에 관계없이 서열 유사성의 균주 경쟁 연구에 적용 할 수 모두 (RT-qPCR에) 15,16,18,20. 추가 단계는 바이러스의 게놈에 태그를 도입하는 데 필요한 및 RT-qPCR에 분석은 특정 시약 및 장비를 필요로한다. 발명자들은 대량 생거 시퀀싱 수익률 비교 결과 (9). 성장 경쟁에 이어, 바이러스 복제 피트니스는 상대의 적합성, 또는 T 사이의 피트니스 비율로 제공됩니다바이러스 변종 하시다. 바이러스의 상대적인 니스는 접종의 초기 비율에 의해 또는 두 바이러스 간의 경쟁 순 성장 속도 차이로 규격화 바이러스 변이체의 최종 비율로 정의 할 수있다. 우리는 후자의 방법은, 단지 지수 성장기 내에 길이 데이터 포인트를 이용하여, 가장 견고한 결과 9,20 생산하였습니다. 체외에서 피트니스 분석은 생물학적 클론 6-8과 HIV-1 감염 분자 클론을 연구하기 위해 주로 사용된다. 후자는, 유전자 조작 의무가되고, 종종 특정 돌연변이 또는 관심 3-5,21,22의 특정 시퀀스에서 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해 사용된다. 다음 프로토콜은 바이러스 성 성장 속도론을, 일련의 태그를 포함하는 HIV-1 벡터를 사용하여 새로운 전체 길이 감염성 HIV-1 분자 클론을 구성하는 관심의 돌연변이를 도입, 바이러스 성 주식을 만들고 구축의 관점에서 워크 플로를 설명상대 체력을 성장 경쟁 분석을 수행하고 계산하는 (그림 1). 우리의 최적화 된 절차를 사용하여, 우리는 세 가지 재조합 HIV-1 돌연변이를 만들어 자신의 복제 체력을 결정했다. 재조합 분자 복제가 먼저 합성 COTB (센터 외과, pNL4-3, HIV-1 실험실 변형 NL4-3의 전체 길이 감염 유전자를 포함하는 플라스미드의 HIV-1 개그-P24 유전자 영역을 대체하여 건설되었다 나무, 서브 타입 B) 개그-P24 시퀀스 (23)는 프로토 타입의 변형을 만들 수 있습니다. 단일 아미노산 변경 (T186M은 T242N 및 I256V는) 다음 세 가지 돌연변이 클론을 생성하기 위해 도입되었다. 각각의 돌연변이는 주어진 유전 적 배경에서 각 돌연변이의 체력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 프로토 타입 바이러스에 대해 경쟁했다. 세 가지 돌연변이 프로토 타입 바이러스보다 약간 크게 낮은에서 복제 fsitness 다양한 수준의 보여 주었다. T242N 돌연변이는 이전에 적당한 fitne이보고되었다SS는이 연구에 나타낸 결과와 유사한 24-26, 비용. 다른 두 변이의 피트니스 비용은 이전에보고되지 않았다.

<table><tbody><tr><td>재조합 클론</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>키메라 프라이머/돌연변이화효소/염기서열분석 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>맞춤형 DNA 올리고</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA 및 pNL4-3VifB 플라스미드</td><td></td><td></td> 구성 <td>James I Mullins 박사에게 문의하십시오. (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg; 제네Amp&reg; PCR System 9700</td></tr><tr><td>DNA 로딩 염료</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 화학적으로 유능한 Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth base powder</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfection 시약</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.atcc.org/ 0.22 &#956; m 필터 상단 튜브</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s 수정된 Dulbecco&prime; s 매체 (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플랫 바닥 플레이트</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 라운드 바닥 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 튜브(O-링 포함</td>) <td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr> 소 태아 <tr><td>혈청(FBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>토끼 항-HIV-1 SF2 p24 항혈청</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB Microwell Peroxidase Substrate</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>모든 노출 경로에서 심각한 화상을 입힙니다. 개인 보호 장비를 사용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서만 사용하십시오. 즉시 다량의 물로 최소 15분 동안 씻어내십시오.</td></tr><tr><td>HIV p24 표준</td><td>AIDS 및 암 바이러스 프로그램(NCI-Frederick)</td><td></td><td>주문 세부 정보는 Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov)에 문의하십시오. http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td></tr><tr><td>RNA isolation cDNA synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>첫 번째 가닥 완충액&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 억제제</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-time qPCR 기계</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>포워드, 리버스 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>맞춤형 주문</td></tr><tr><td>프로브</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>맞춤형 주문</td></tr><tr><td>광학 96웰 반응 플레이트</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+염기서열분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소(Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4 완충액&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>DNA 염기서열분석 서비스 제공업체</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRC 웹 도구</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChromatQuan 웹 도구</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

체외 적합성 분석은 HIV-1과 같은 바이러스에 대한 바이러스 복제 적합성을 결정하기 위한 필수 도구입니다. 바이러스 복제 적합성을 추정하기 위해 감염 단위당 바이러스 입자 수, 세포 배양에서의 성장률, 다중 주기 성장 경쟁 분석에서 파생된 상대적 적합성에 이르기까지 다양한 측정이 사용되었습니다. 성장 경쟁 분석은 바이러스가 동일한 성장 조건에서 세포 표적을 놓고 경쟁하기 때문에 특히 민감한 적합성 측정을 제공합니다. 성장 경쟁 분석을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 실험 요소가 있으며, 여기에는 감염의 다양성(MOI), 샘플링 시간, 바이러스 검출 및 적합성 계산 방법이 포함됩니다. 각 요인은 최종 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 실험 설계 중에 신중하게 고려해야 합니다. 여기에 제시된 프로토콜에는 새로운 재조합 HIV-1 클론 구축부터 성장 경쟁 분석 수행 및 실험 결과 분석에 이르는 단계가 포함됩니다. 이 프로토콜은 일관되고 강력한 결과를 산출하기 위해 이전에 표시된 실험적 매개변수 값을 활용합니다. 연구 중인 세포 유형과 바이러스에 따라 일부 매개변수를 조정해야 하므로 대안에 대해 논의합니다. 이 프로토콜에는 두 가지 대체 바이러스 검출 방법이 포함되어 있어 기기, 시약 및 전문 지식의 가용성이 실험실마다 다르기 때문에 유연성을 제공합니다.

HIV-1 개그-P24 단일 아미노산 변화의 체력에 미치는 영향을 연구하기 위해, 우리는 HIV-1 COTB-P24 유전자 23,32,33를 포함하는 pNL4-3 플라스미드에 돌연변이를 소개하는 올리고 뉴클레오티드 특이 적 변이를 사용했다. 바이러스 주식 293T 세포의 형질 감염에 의해 생성 된, 48 시간 후에 수거 하였다. 우리는 리드 - MUENCH 방법 (31)에 의해 각각의 바이러스 주식의 50 % 조직 배양 감염 용량 (TCID 50)을 추정했다. 프로토 타입의 TCID (50)와 돌연변이 바이러스는 104에서 105 IU / ㎖ (그림 3A)였다. 재조합 바이러스의 성장 반응 속도는 0.005의 MOI에서 단일 기증자 PBMC를 설립했다. RT-qPCR의 여섯 일 동안 매일 바이러스 cDNA의 사본 수를 측정 하였다. 모든 돌연변이 및 프로토 타입 바이러스는 &lt;바이러스 RNA의 카피 수 증가의 감소 기울기 (로 표시된 바와 같이 바이러스 성 성장이 둔화 하루 2, 4 일, 다음 사이에 기하 급수적으로 증가강한&gt; 그림 3b). cDNA의 감소는 (접종에 해당) 0 일 및 2 일 사이의 수는 세포에 바이러스의 흡수 하루 1 세척 (단계 5.1.6)에 의해 언 바운드 비리의 제거로 인한 복사합니다. 지수 적 성장 단계에서, 모든 세 돌연변이 바이러스 원형 (도 3c)보다 느린 성장 속도 (g)를 가졌다. 세 가지 돌연변이 0.005 총 MOI에서 성장 경쟁 분석에서 프로토 타입 바이러스에 대해 경쟁했다. 이중 감염된 문화 바이러스 성 성장 속도론은 monoinfection의 그것과 유사 하였다; 바이러스 성 지수 성장기는 2 일 및 4 사이이고, 바이러스 성장은 5 일 (도 4a)의 주위에 도달 고원. 바이러스 성장 속도의 차이는 시간에 따른 바이러스의 비율의 변화로부터 유래 하였다. 비 바이러스의 cDNA 복사본 참조 번호 및 RT-qPCR에를 사용하여 돌연변이 바이러스와 비교하여 피크의 높이에 의해 산출했다시퀀스에서 두 바이러스 (도 4B)를 구분하는 뉴클레오티드 부위에서 크로마토 그램. 피크 높이와 바이러스 RNA 카피 수의 방법을 이용하여 결정 성장 속도의 차이는 유사한 결과 (도 4C)을 수득 하였다. 세 가지 돌연변이가 가장 낮은 피트니스 (그림 4C)을 갖는 돌연변이 I256V와 프로토 타입 바이러스보다 낮은 복제 체력을 가지고 있었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> 그림 1 : 본 논문에서 제시 한 프로토콜의 흐름도 바이러스 주식의 바이러스 준비 프로토콜 우려 HIV-1 재조합 클론의 건설 및 생성.. 피트니스 분석 실험 프로토콜은 바이러스 성 성장 속도론을 수립하고 관련 바이러스의 적합성을 결정하기위한 것입니다. 점선은 프로토콜에 대한 다른 흐름을 나타냅니다. 예를 들어, 돌연변이 HIV-1 NL4-3로 직접 도입 될 수있다재조합 복제를 생성하지 않고 분자 클론. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> 그림 2 :. 오버랩 확장 PCR (A)를 사용하여 HIV-1 NL4-3 COTB 개그-P24 재조합 분자 클론의 건설 키메라 프라이머를 디자인합니다. 5 &#39;프라이머의 절반은 NL4-3 벡터 시퀀스를 포함하고 3&#39;반쪽 삽입 시퀀스의 끝을 포함한다. (B) 키메라 프라이머는 삽입 조각, COTB 개그-P24를 증폭하는 데 사용됩니다. (C) 삽입 단편은 재조합 플라스미드를 생성하기 위해 두 번째 PCR 용 프라이머로 사용된다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> 그림 3 :. PBMC를에서 바이러스 성 성장 특성 (A) 로그 (10) TCID (50) </sUB&gt; 바이러스 주식. (B) MOI = 0.005에서 시작 monoinfections에서 바이러스 성 성장 속도론. 패널 (B) 유래의 지수 성장기 (2-4 일) 등 6 일 (C) 바이러스 성장율. 도시 된 값들은 하나로부터 3 회 반복 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> 그림 4 : 바이러스 성 성장과 상대의 적합성 결정 (A) 이중으로 감염 PBMC 문화에서 바이러스 성 성장.. T242N 및 프로토 타입 바이러스 (B) 비는 RT-qPCR에 또는 시퀀싱 피크 높이 법을 사용하여 측정. (A)에 도시 된 바와 같이, (C) 및 이중 돌연변이 감염된 배양에서 프로토 타입 바이러스 간의 순수한 바이러스 성장율 차이 (d). D 값은 f를 계산했다(B)에 도시 된 비 바이러스 성 데이터를 ROM. 도시 된 값들은 하나로부터 3 회 반복 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다.

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

본 프로시저의 전반적인 목적은 관심 있는 HIV-1 균주들의 상대적인 복제 적응도(replication fitness)를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 HIV-1의 전체 길이 서열을 포함하는 바이러스 분자 클론 또는 DNA 플라스미드를 구축함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 DNA 트랜스펙션을 통해 각 분자 클론에 대한 바이러스 스톡을 생성하는 것입니다.다음으로, 단일 감염된 세포 배양물의 종단적 샘플링을 통해 각 HIV-1 균주의 성장 역학 및 지수 성장기가 확립됩니다. 마지막 단계는 세포 배양물에서 쌍별 성장 경쟁 또는 이중 감염을 수행하는 것입니다. 최종적으로 역전사, 정량적 실시간 PCR 및 Sanger DNA 시퀀싱으로 얻은 DNA 서열 크로마토그램의 피크 높이를 사용하여 바이러스 비율을 결정하며, 이를 통해 상대적 바이러스 복제 적응도를 계산합니다.para-mono 감염이나 두 시점 이중 감염과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 두 바이러스 균주 간의 복제 적응도 차이를 더 민감하고 견고하게 측정할 수 있다는 점입니다. 본 논문에서 제시하는 프로토콜에는 HIV-1 재조합 클론 구축, 부위 특이적 돌연변이 유발을 통한 관심 돌연변이 도입, 바이러스 스톡 제작, 그리고 바이러스 성장 역학 확립 및 상대적 바이러스 적응도 결정을 위한 적응도 분석 수행이 포함됩니다. 본 영상에서는 성장 경쟁 분석과 두 가지 서로 다른 방법을 시연할 것입니다.적응도를 계산하기 위한 바이러스 비율을 결정하려면, 다른 모든 절차에 대해 프로토콜 텍스트를 참조하십시오. 성장 경쟁 분석을 준비하려면, 48웰 평저 플레이트의 웰당 총 부피 500 µL에 3 × 10⁵개의 PHA 자극 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분주합니다. 접종 전까지 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 분위기에서 유지하십시오. 다음으로, 각 바이러스당 6,000 IU를 포함하는 3 mL의 접종액을 준비하십시오.일반적인 실험에서는 여러 개의 돌연변이체를 테스트하지만, 본 시연에서는 하나의 돌연변이체만을 프로토타입 바이러스와 대조하여 테스트합니다. 감염가가 매우 높은 바이러스 스톡의 경우 연속 희석이 필요할 수 있으므로, 바이러스 접종액을 적절하게 준비하는 것이 이 절차에서 매우 중요한 단계입니다. 이중 감염 접종액을 만들기 위해 각 바이러스 접종액 1.5 milliliters를 멸균 튜브로 옮깁니다.48-웰 플레이트의 각 웰에 있는 PHA-자극 PBMC에 500 µL의 이중 접종물을 추가합니다. 최종 배양 부피는 웰당 1 mL입니다. RNA 분리를 위해 두 개의 96-웰 플레이트에 이중 접종물을 웰당 200 µL씩 분주합니다. 한 개의 플레이트는 백업용으로 보관합니다. 접종된 세포를 37 °C, 5% CO2 분위기에서 16~24시간 동안 배양합니다. 접종 후 16~24시간이 지나면 배양물을 세척하고, 배양 상층액 750 µL를 제거하여 버린 후 750 µL의 신선한 완전 Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium 또는 cIMDM을 추가합니다.플레이트를 플라스틱 랩으로 감싸고 10분 동안 원심분리합니다. 300 g에서 원심분리한 후, 상층액 750 µL를 제거합니다. 신선한 cIMDM 750 µL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 분위기에서 배양합니다. 샘플링 시간은 바이러스의 지수 성장기 내에서 최소 3개의 시점이 포함되도록 선택해야 합니다.시료를 수집하려면, 배양 상층액 500 µL를 1.8 mL 원심분리 튜브로 옮기고 3000 g에서 1분간 원심분리합니다. 세포가 제거된 상층액 200 µL를 RNA 분리를 위해 두 개의 96웰 시료 플레이트에 옮깁니다. 이때 플레이트 하나는 백업용으로 보관합니다. RNA 분리 전까지 상층액을 -80 °C에서 보관하십시오.각 배양물에 신선한 cIMDM 500 µL를 추가하고 다음 샘플링 시간까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이후 샘플에서 RNA를 분리하고, 이어서 cDNA 합성을 진행합니다. 바이러스 비율을 결정하기 위한 두 가지 방법이 시연될 것입니다.첫 번째는 역전사 정량 실시간 PCR(RT-qPCR)을 사용하고, 두 번째는 크로마토그램 피크 높이를 사용합니다. qPCR의 경우, pNL4-3VifA 플라스미드를 각 단계마다 10배씩 희석하여 3 × 10⁶ copies/µL에서 30 copies/µL까지 3반복으로 표준 연속 희석 시리즈를 준비합니다. 96웰 qPCR 반응 플레이트를 준비합니다.각 플레이트에는 적어도 하나의 음성 대조군, 3회 반복 측정된 표준 희석 시리즈, 그리고 각 cDNA 샘플의 2회 반복 측정분이 포함되어야 합니다. 음성 대조군, 표준 희석 시리즈 및 cDNA 샘플의 반복 측정분 중 하나에서는 vFIA 프라이머 프로브를 사용하여 신호를 검출하십시오. cDNA 샘플의 나머지 반복 측정분에는 vIFB 프라이머 프로브를 사용하십시오. 각 qPCR 반응에는 12.5 µL의 qPCR 마스터 믹스, 0.2 µM의 qPCR 프로브, 각각 0.8 µM의 정방향 및 역방향 프라이머, 그리고 1 µL의 cDNA를 사용하십시오. 표준 희석 시리즈의 경우 cDNA 대신 pNL4-3VifA의 연속 희석액을 첨가하고, 음성 대조군의 경우 cDNA 대신 물 또는 버퍼를 사용하십시오. qPCR 기기 작동을 위한 제조사의 지침에 따라 PCR 사이클 매개변수를 설정하십시오. 표준 희석 시리즈의 증폭 데이터를 사용하여 표준 곡선을 계산하십시오.cDNA 샘플의 증폭 데이터를 표준 곡선과 비교하여 복제 수를 결정합니다. 바이러스 성장률 계산법 또는 GRC 웹 도구를 사용하여 상대적 바이러스 적응도를 계산합니다. RT qPCR 단계에서 얻은 cDNA 복제 수를 표시된 지정 형식으로 입력합니다. 'calculate'를 선택하면 경쟁하는 두 바이러스 간의 순 성장률 차이가 출력됩니다. 크로마토그램 피크 높이를 사용하여 바이러스 비율을 결정하려면, VIF forward 및 VIF reverse 프라이머를 사용하여 VIFAB 서열 태그를 포함하는 HIV-1 Vif 조각을 PCR 증폭합니다. 각 PCR 반응에는 1 µL의 cDNA, 1X NH-4 버퍼, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 2.5 U Taq polymerase 및 각 프라이머 0.45 µM을 사용합니다.최종 부피가 50 µL가 되도록 물을 추가합니다. PCR 사이클 파라미터를 94 °C에서 1분, 55 °C에서 1분, 70 °C에서 1분으로 3회 반복하고, 이어서 94 °C에서 15초, 58 °C에서 30초, 70 °C에서 1분으로 34회 반복하도록 설정합니다. 마지막으로 4 °C에서 보관합니다. 그 후, 시판 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 정제된 PCR 생성물을 DNA 시퀀싱 서비스 제공업체에 제출하여 Sanger 시퀀싱을 수행합니다.시퀀싱 서비스에서 제공한 평균 리드 품질 점수를 확인하십시오. 평균 염기 호출 정확도가 85% 미만인 경우, PCR 증폭, PCR 생성물 정제 및 Sanger 시퀀싱을 반복하십시오. Chromat 정량 웹 도구를 사용하여 각 시점의 바이러스 비율을 계산하십시오.필요한 입력값은 리더 서열과 .ab1 형식의 서열 크로마토그램 파일입니다. 이 도구는 지정된 부위의 피크 강도를 측정합니다.피크 강도의 비율은 두 바이러스의 비율에 해당합니다. 상대적 바이러스 적합도를 계산하려면 GRC 웹 도구를 사용하십시오. 입력 값은 표시된 지정 형식에 따라 Chromat quantitative 웹 도구를 사용하여 얻은 서열 크로마토그램 피크 높이입니다. GRC 웹 도구는 경쟁하는 두 바이러스 균주 간의 순 성장률 차이를 계산합니다. 프로토타입과 세 가지 HIV 돌연변이 바이러스를 제작하여 PBMC에서의 성장을 특성화하였습니다. TCID 50은 mL당 10⁴에서 10⁵ IU 범위였습니다. 모든 바이러스는 2일에서 4일 사이에 지수적으로 성장하였습니다.지수 성장기에서 세 가지 변이체 모두 프로토타입 바이러스보다 성장 속도가 느렸습니다. 총 MOI 0.005의 성장 경쟁 분석에서 각 변이체를 프로토타입 바이러스와 경쟁시킨 결과, 이중 감염 배양물에서의 바이러스 성장 역학은 단일 감염 시와 유사했습니다. 바이러스의 지수 성장기는 2일에서 4일 사이였으며, 바이러스 성장은 5일경에 정체기에 도달했습니다.바이러스 성장률의 차이는 시간에 따른 바이러스 비율의 변화로부터 도출되었습니다. 바이러스 비율은 RT-qPCR을 이용한 표준 바이러스와 변이 바이러스의 cDNA 복제수(copy number)를 기반으로 계산되었으며, 두 바이러스를 구별할 수 있는 뉴클레오타이드 부위의 시퀀스 크로마토그램 피크 높이를 비교함으로써 T242-N 변이주를 프로토타입과 비교하였습니다. 본 예시에서 두 가지 방법으로 결정된 성장률 차이는 유사한 결과로 나타났습니다.세 가지 변이주 모두 프로토타입 바이러스보다 복제 적응도가 낮았으며, 그중 I256-V 변이주의 적응도가 가장 낮았습니다. 이 영상을 시청한 후에는 HIV-1의 상대적 복제 적응도를 결정하기 위한 쌍별 성장 경쟁 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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하여 HIV - 1 V3 루프 크라운 R2 시퀀스 Immunologically 관련 동적 차 구조 기능의 평가 순이 론적 접는

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HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

학습하세요 HIV-1 복제 피트니스 측정을 위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석법입니다. DNA 플라스미드를 이용한 바이러스 클론 구축, 이중 감염 실험, 실시간 PCR 및 Sanger 시퀀싱을 통한 바이러스 비율 분석 방법을 익히세요.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

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