높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

이 절차의 전반적인 목표는 1형 및 3형 인터페론 아형과 같은 고도의 상동성 유전자 그룹의 고처리량 분석을 위해 384웰 분석 플레이트를 준비하고 실행하는 것입니다. 이는 먼저 분석 플레이트를 실행하는 데 사용되는 표준 직렬 희석을 준비하여 수행됩니다. 다음으로, 프라이머 프로브와 플레이트를 만드는 데 사용되는 무 템플릿 제어 작업 재고 혼합물이 준비됩니다.

그런 다음 384웰 분석 플레이트를 자동화된 다중 채널 피펫터를 사용하여 준비하고 보관을 위해 건조합니다. 마지막으로, 384개의 웰 분석 플레이트를 실행하고 분석합니다. 궁극적으로 고처리량 정량적 real-time RT PCR R 분석은 조직 배양 모델, 병원체 연구 또는 감염성 또는 자가염증성 질환과 관련된 임상 샘플에서 인터페론 발현 시그니처를 정의하는 데 사용됩니다.

표준 선형 프로브 또는 사이버 그린을 사용하는 정량적 R 2 PCR과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분자 비콘 및 잠금 핵산 형광 프로브를 사용하여 표준 및 연어 정자 또는 S-S-D-N-A를 해동, 볼텍싱 및 간단히 원심분리 후 매우 유사한 염기서열 간의 단일 염기쌍 차이를 구별하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 51마이크로리터의 S-S-D-N-A를 20.3ml의 물과 혼합하여 17개의 표준 희석 세트에 대한 SSD NA 물 혼합물을 준비합니다. 190마이크로리터의 SS DNA 물 혼합물을 8개 튜브 PCR 스트립의 첫 번째 튜브에 분배하고 180마이크로리터를 다음 5개 튜브에 분배합니다.

50 Picomolar 표준 스톡에서 10 마이크로 리터를 190 마이크로 리터의 S-S-D-N-A 물 혼합 와류와 빠르게 원심 분리하는 튜브로 이동하여 1-20 희석을 수행합니다. PCR 스트립은 가장 최근에 희석된 튜브에서 시리즈 와류의 다음 튜브로 20마이크로리터를 이동시켜 1-10 희석을 수행하고 PCR 스트립을 빠르게 원심분리합니다. 시리즈의 마지막 튜브가 표준물질을 받을 때까지 1에서 10 희석을 반복합니다.

최대 17개의 2밀리리터 튜브를 라벨링한 후 12.5마이크로리터 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 프라이머와 프로브를 사용하여 모든 튜브에 2마이크로리터의 S-S-D-N-A를 추가합니다. 각 프라이머에 적절한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브를 추가합니다. 프로브 세트 작업 스톡 튜브는 템플릿 제어 또는 NTC 작업 재고 믹스를 준비합니다.

이 표에 따라 각 프라이머 프로브 세트의 14.3마이크로리터를 적절한 NTC 작업 스톡 혼합 튜브로 이동합니다. NTC 작업 스톡 세트의 Eloqua를 제거한 후 1.5ml의 물에서 혼합하여 각 프라이머 프로브 세트 작업 스톡 튜브의 최종 부피를 1.7ml로 만듭니다. 프라이머 프로브 세트와 NTC 혼합물의 96웰 소스 플레이트를 준비합니다.

새로운 96웰 플레이트를 냉각된 96웰 냉각 블록에 놓고 250마이크로리터 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 올바른 프라이머 프로브 세트 또는 NTC 혼합물로 웰을 지정합니다. 모든 프라이머 프로브 세트에 66마이크로리터의 물을 추가합니다. 우물은 82.5마이크로리터의 물을 4개의 대상 17개의 우물에 분배합니다.

모든 안티 C 믹스에 27.5마이크로리터의 물을 분배합니다. 다음으로, 작업 재고에 있는 올바른 프라이머 프로브 54마이크로리터를 웰 디스펜스 시 지정된 프라이머 프로브에 추가합니다. 67.5 마이크로리터의 타겟 17 프라이머 프로브 작업 세트 재고를 웰에서 지정된 타겟 17 프라이머 프로브에 공급합니다.

22.5마이크로리터의 올바른 NTC 작업 원료 혼합물을 지정된 웰에 추가합니다. 그런 다음 접착 플레이트 씰을 사용하여 96웰 플레이트와 원심분리기를 700Gs로 1분 동안 밀봉하여 내용물이 96웰 어댑터로 웰 바닥에 있는지 확인합니다. 플레이트를 볼텍스 믹서에 넣고 1분 동안 1000RP로 믹싱합니다.

그런 다음 700Gs에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 384웰 분석 플레이트를 준비하려면 자동 멀티채널 피펫터를 켜고 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 플랫폼 설정을 위한 인터페론 분석 플레이트를 만들기 위한 프로토콜을 엽니다. 완전히 가득 찬 피펫 팁 상자를 플랫폼 위치 1에, 96웰 소스 플레이트를 위치 4에, 새 384웰 플레이트를 위치 6에 놓습니다.

실행이 완료되면 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다. 384웰 분석 플레이트를 평평한 표면에 부드럽게 두드려 유체가 웰 바닥에 있는지 확인하고 플레이트를 700Gs에서 1분 동안 회전시킨 후 접착 플레이트 씰을 적용합니다. 접착판 씰을 제거합니다.

384웰 분석 플레이트를 플레이트 건조기에 놓고 384웰 매니폴드를 웰 바로 위에 배치합니다. 384 웰 분석 플레이트 내용물이 건조되면 새 접착 플레이트 씰, 래피드 호일 라벨을 적용하고 분석 플레이트를 로드하고 실행하는 데 사용할 때까지 섭씨 4도의 어둠 속에 보관하십시오.

84.9 마이크로 리터의 물에 2 마이크로 리터의 S-S-D-N-A를 희석하여 2 개의 하우스 키핑 유전자 또는 HKG 웰 믹스를 준비합니다. 그런 다음 각 24 마이크로리터 샘플과 양성 대조 튜브에 78.8 마이크로리터의 마스터 믹스와 54.8 마이크로리터의 물에서 샘플과 양성 대조군 CDNA를 준비한 후 희석된 SSD NA 11.8 마이크로리터의 물, 23 마이크로리터의 마스터 믹스 및 9.2 마이크로리터의 올바른 20 XHKG 프라이머 프로브 세트를 추가합니다. 건조된 384 웰 분석 플레이트에 추가할 표준물질 및 NTC 웰 믹스를 준비하기 위해 1.5 밀리리터 튜브에 165 마이크로리터의 물에 165 마이크로리터의 마스터 믹스를 추가합니다.

미리 준비된 건조된 384웰 분석 플레이트를 섭씨 4도에서 제거하고 700GS에서 1분 동안 원심분리합니다. 30 마이크로리터 전동 멀티채널 피펫으로 7.5 마이크로리터의 NTC를 디스펜싱할 수 있습니다. 각 NTC에 잘 섞습니다.

우물은 각 표준에 대해 6 마이크로 리터의 표준 우물과 1.5 마이크로 리터의 표준을 분배합니다. 그런 다음 12.5 마이크로리터 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 7.5 마이크로리터의 샘플을 지정된 웰로 분주합니다. 광학 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 700Gs에서 1분 동안 원심융합한 후 HKG 프라이머 프로브 믹스 2.5마이크로리터를 지정된 웰에 분배하고, 2, 600RPM에서 2분 동안 와류 믹서에서 밀봉된 384웰 플레이트를 2분, 700 치즈에서 5분 동안 원심분리합니다.

마지막으로 밀봉된 분석 플레이트를 Q-R-T-P-C-R 기계에 놓습니다. 분석 레이아웃에 대한 템플릿을 열고 다음 반응 조건을 사용합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 실행을 시작하고, 데이터를 내보내고, 분석합니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 인간 유형 1 및 3 인터페론 발현 서명은 말초 혈액 단핵 세포 또는 톨 유사 수용체 리간드로 자극된 6개의 공여자로부터 p BMC에서 분석되었습니다.

데이터는 하우스키핑 유전자로 정규화된 절대 CQ 값과 총 RNA의 마이크로그램당 템플릿의 복제 수를 포함한 두 가지 분석 방법을 사용하여 로그 스케일의 레이더 차트로 표시됩니다. 이 데이터는 TLR 작용제에 의해 유도된 인간 인터페론 발현 시그니처가 Resus Maccas에서 유형 1 및 3 인터페론의 리간드 특이적 발현 시그니처임을 보여줍니다. 또한 이 실험에서 TLR 리간드 특이적이었으며, 3명의 공여자로부터의 PBMC를 3시간 동안 3개의 리간드로 자극하였다.

베이스라인에서 자극되지 않은 세포에서의 인터페론 아형 발현은 여기에서 볼 수 있듯이 낮았습니다. 제한된 수의 인터페론 알파 아형이 LPS 및 poly ic에 대한 반응으로 발현되었습니다. 대조적으로, 이미퀴모드(imiquimod)에 대한 반응으로 인터페론 발현은 높았고, 아형 발현은 인터페론 베타와 인터페론의 광범위한 발현이었다.

Lambda one은 세 가지 TLR 작용제 모두에 의해 향상되었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 1형 및 3형 인터페론 아형과 같은 매우 유사한 유전자 그룹의 고처리량 분석을 위해 4개의 웰 분석 플레이트를 준비, 실행 및 analyze. 3D하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.