시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

이 동영상은 타임 랩스 이미징을 사용하여 실체 현미경에서 조직 복구 역학을 캡처하는 방법을 보여줍니다. 이것은 먼저 꼬리 지느러미가 절단을 쉽게 수행할 수 있는 크기로 충분히 발달했을 때 제브라피시 배아를 유충 단계로 들어 올림으로써 수행됩니다. 이것은 일반적으로 부화 후에 달성됩니다.

두 번째 단계는 주사기 바늘을 사용하여 꼬리 지느러미를 절단하는 것입니다. 세 번째 단계는 유충을 이미징 챔버에 장착하고 실체 현미경으로 타임랩스 동영상을 캡처하는 것입니다. 마지막 단계는 Bit Plains S와 같은 이미징 분석 소프트웨어 또는 제브라피시를 모델로 사용하여 상처 복구 및 조직 재생을 연구하는 오픈 소스 소프트웨어 이미지 J.Hi.My 사용하여 꼬리 지느러미 재생을 정량화

오늘 우리는 명시야 입체 현미경을 사용하여 이러한 프로세스의 역학을 실시간으로 캡처하는 방법을 시연할 것입니다. 오늘 우리는 제브라피시 유충 꼬리 지느러미를 사용하여 조직 재생의 초기 과정을 포착하는 방법을 시연할 것입니다. 제시된 이미징 방법은 간단한 현미경 환경에서 전체 조직 규모 거동을 관찰하고 분석할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 타임 랩스 기능이 있는 모든 실체 현미경에 쉽게 적용할 수 있습니다.

시작하겠습니다. 제브라 피쉬의 사육 애벌레 단계에. 꼬리 지느러미의 상처 복구는 이때까지 꼬리 지느러미가 충분히 발달했기 때문에 부화 단계 후에 가장 잘 관찰할 수 있으며 척수나 다른 조직을 손상시키지 않고 절단을 쉽게 수행할 수 있습니다.

가까운 곳에서 알을 모아 섭씨 28도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 부화시킵니다. 다음날 아침, 죽은 배아를 제거하고 0.03%인스턴트 해양 수족관 소금 용액이 함유된 배아 배지로 헹굽니다. 필요한 경우 유충의 색소 침착을 방지하기 위해 갑상선이 0.003%인 배아 배지를 접시에 추가합니다.

이 시연을 위해 우리는 인큐베이터에서 수정 후 이틀 후 유충이 이미징 챔버의 콘 준비에서 부화할 때까지 배아가 발달하도록 했습니다. 이 단계에서는 이미징 챔버를 구성하기 위한 두 가지 방법을 제공합니다. 방법 1은 모든 철물점에서 구할 수 있는 음용수 등급 PVC 또는 테프론 튜브로 만든 이미징 챔버로 구성됩니다.

커버 슬립 부착에 적합한 크기이므로 외부 직경이 25mm이고 내부 직경이 20mm인 튜브를 사용하십시오. 튜브를 잘라 10mm 두께의 고리를 최대한 만듭니다. 사포를 사용하여 가장자리를 매끄럽게 하고 물과 에탄올로 헹굽니다.

챔버를 공기 건조시키십시오. 방법 2는 사전 제조된 무광 기술 유리 바닥, 유리 상단 이미징 챔버를 사용하거나 작은 페트리 접시에서 이미징 챔버를 만드는 것으로 구성됩니다. 자신만의 이미징 챔버를 만들려면 35mm 또는 50mm 페트리 접시를 사용하고 뚜껑에 10mm 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 커버 슬립 외부에 실리콘 그리스를 바르고 깨끗한 피펫 팁으로 25 x 25mm 정사각형 또는 원형 커버 슬립을 외부에 부착하여 장착 아그로스가 단단히 부착되도록 합니다. 이미징 절차 중에 커버 슬립 내부에 미세한 플라스틱 메쉬를 부착합니다. 이것은 메쉬를 내부 링 직경 크기로 절단한 다음 유충 크기의 약 3배인 작은 직사각형을 메쉬 중앙으로 절단하여 수행할 수 있습니다.

부상 전 유충의 장착 및 이미징. 이 단계는 나중에 핀 재생의 정량화에 적합합니다. 먼저, 마취된 유충을 섭씨 42도로 유지된 aro 용액으로 옮기는 표본의 고정을 위해 배아 배지에서 0.5% 저용융 농업 용액을 준비합니다.

가열 블록에서 아그로스 한 방울이 있는 유충을 작은 페트리 접시에 옮기고 유충을 옆으로 눕힙니다. 뚜껑이 있는 마이크로 로더 팁을 사용하여 aros가 응고되고 trica 용액을 추가하도록 합니다. 나중에 사용할 실체 현미경으로 진행합니다.

타임 랩스 이미징의 경우 zes discovery V 12 실체 현미경과 Axio 비전 소프트웨어를 사용하여 시연합니다. 먼저, 이미징에 적합한 대물렌즈와 배율을 선택하여 현미경 설정을 조정합니다. 그런 다음 alvis 소프트웨어의 현미경에서 카메라 감지 모드를 선택합니다.

라이브 모드를 선택하여 view 화면에서 애벌레. properties 창을 열어 밝기를 자동으로 감지하고, 현미경 투과 조명 베이스에서 대비를 수동으로 조정합니다. 유충을 시야 밖으로 이동하고 음영 보정 기능을 선택합니다.

배경 소음을 최소화하려면 유충을 시야에 다시 배치하고 스냅샷을 찍습니다. 상처에 대비하기 위해 이미지를 저장합니다. 먼저 머리에서 에어로를 긁어내어 aros에서 유충을 제거하십시오.

이를 통해 유충은 나머지 에어로 절단 분석에서 머리를 부드럽게 당겨 에어로에서 빠져나올 수 있습니다. 인스턴트 해양 소금 용액을 사용하여 1.5% 에어로스 플레이트를 준비합니다. 실체 현미경으로 유충을 응고된 아로스 위에 옆으로 놓고 23게이지 주사기 바늘로 꼬리 지느러미의 원위 부분을 절단합니다.

타임랩스 이미징을 위해 유충을 장착합니다. 두 가지 타임랩스 이미징 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법에서는 유충을 장착한 후 챔버 링에서 유충을 이미지화하는 방법을 보여줍니다.

뚜껑이 있는 마이크로 로더 피펫 팁으로 말단 꼬리 지느러미를 둘러싸고 있는 응고된 아그로스를 조심스럽게 긁어냅니다. 이를 통해 적절한 상처 치유 또는 조직 재생이 가능합니다 조직을 구속하지 않고 지느러미를 반복적으로 손상시키지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 기존 용액을 교체하여 챔버에서 이미징 절차를 방해하는 원치 않는 파편을 제거합니다.

새 Trica 용액으로 챔버 상단에 실리콘 그리스를 바르고 챔버 링에 새 trica 용액을 채웁니다. 챔버 방법 2를 밀봉하기 위해 상단에 유리 슬라이드를 적용합니다. 이 방법에서는 유리 상단 페트리 접시에서 유충을 이미지화하는 방법을 보여줍니다.

유충을 뚜껑에 장착하고 뚜껑을 덮고 뚜껑을 채웁니다. trica 해결책으로. 꼬리 지느러미에서 아그로스를 긁어냅니다.

다음으로, 하단 챔버의 상단 가장자리에 실리콘 그리스를 바르고 챔버를 trica 용액으로 채웁니다. 뚜껑에서 트리카 용액을 조심스럽게 기울이고 뚜껑을 뒤집어 유충이 바닥 챔버의 트리카 용액에 잠기도록 합니다. 이는 약간의 각도로 수행할 수 있습니다. 에어 포켓을 피하기 위해 챔버는 실리콘 그리스 타임랩스 이미징으로 밀봉되어 섭씨 28도의 적절한 온도가 유지되도록 합니다.

단열을 위해 판지 버블 랩으로 만든 가열된 배양 챔버와 닭고기 달걀 부화에 사용되는 와이어 돔을 열원으로 조립합니다. 현미경 주위에 배양실을 놓고 온도를 섭씨 28도로 조정합니다. 약 10-20분 동안 또는 온도가 안정될 때까지 가열된 배양 챔버의 전면을 열고 이미징 챔버를 현미경에 놓습니다.

커버 슬립이 목표물 쪽으로 위쪽을 향하도록 서 있습니다. 이미징 절차 과정에서 지느러미의 성장과 재생을 포착할 수 있도록 시야의 2/3가 비어 있는 방식으로 유충 지느러미를 배치합니다. 소프트웨어의 60 다차원 획득 창에서 유충을 재배치할 필요 없이 Zack 탭과 슬라이스 모드에서 Z 스택 및 타임랩스 옵션을 선택합니다.

슬라이스 두께를 선택한 다음 시작 정지 모드를 선택합니다. 타임랩스 테이블에서 스택의 위쪽 및 아래쪽 위치를 정의합니다. 동영상의 간격과 재생 시간을 선택한 다음 시작 버튼을 눌러 녹화를 시작합니다.

처음 한 시간 이내에 유충의 와 Zack 경계를 확인하십시오. 필요한 경우, 아그로스 구성의 성장 또는 차이로 인해 이동했을 수 있으므로 시간이 지남에 따라 유충의 위치를 변경합니다. 타임랩스 기록이 끝날 때 파일을 저장하고 후처리 및 정량화 단계 데이터 분석을 진행합니다.

이 섹션에서는 데이터 생성 방법 one imas를 분석하는 몇 가지 방법에 대해 설명합니다. 먼저 imas 소프트웨어로 핀 성장을 결정하는 방법에 대해 설명합니다. Amaris 소프트웨어에서 타임랩스 동영상을 열고 MRS 파일 형식으로 파일을 저장합니다.

소프트웨어 성능을 향상시키려면 직교 보기를 선택하여 동영상을 프로젝션으로 표시합니다. 핀 길이를 측정하려면 왼쪽 상단 도구 모음에서 새 측정 점 추가 옵션을 선택합니다. configure list of visible statistics value(보이는 통계 값 목록 구성)에서 라인 모드에 표시할 통계 값을 선택합니다.

설정 탭의 레이블 속성에서 쌍을 선택하고, 이름 및 거리를 선택하여 측정 선 옆에 점 A와 B 사이의 거리를 표시하고, 편집 모드로 전환한 다음 Shift 버튼을 누른 상태에서 원위 핀의 첫 번째 점을 선택합니다. 그런 다음 동일한 구성을 사용하여 no accord의 말단 끝에 있는 두 번째 점을 선택합니다. 거리는 이미지에 표시되며 통계 탭에서 내보낼 수 있습니다.

디스크 버튼을 선택하면 오른쪽 하단에서 모두 내보냅니다. 측정 포인트 옵션 대신 슬라이스 뷰어를 사용하여 슬라이스 보기 모드에서 거리를 측정할 수 있습니다. 원하는 위치로 스크롤하고 마우스 왼쪽 버튼으로 첫 번째와 두 번째 위치를 클릭하면 거리가 표시됩니다.

그러나 이 옵션은 데이터 내보내기를 허용하지 않습니다. 이제 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 핀 영역을 결정하는 방법에 대해 간략하게 설명합니다. 이미지 J.Zeiss Axio vision 파일 형식을 인식하는 플러그인을 사용하여 이미지 J의 타임랩스 동영상을 엽니다.

또는 압축되지 않은 TIFF 시퀀스를 로드합니다. 이렇게 하면 파일 정보가 분석 선택 세트 스케일에 저장되어 거리에 픽셀과 알려진 거리(파일에 보존되지 않은 경우)를 정의할 수 있습니다. 또한 단위 길이를 마이크로미터로 설정합니다.

도구 모음에서. 자유 손 선택 도구를 선택하고 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 상처의 윤곽을 그립니다. 상처 가장자리를 따라 그리면서.

analyze(분석) 아래의 측정 옵션을 클릭하여 상처 대표 결과의 영역을 표시합니다. 지느러미를 절단하면 절단 후 36시간 동안 부분적인 재생이 이루어집니다. 지느러미의 면적 측정은 지느러미 절단이 절단 후 약 14시간까지 지느러미 조직의 감소를 유발한다는 것을 보여주는데, 이는 아마도 세포가 사멸하고 그 후 얇은 재생 길이가 뒤따르기 때문인 것으로 보입니다.

절단된 지느러미와 재생된 지느러미를 비교하면 36시간 이내에 지느러미 길이가 2.48배 증가한 것으로 나타났습니다. 절단은 초기에 촉발되며, 지느러미 주름 세포에 존재하는 액틴 미오신 케이블을 통한 수축을 특징으로 하는 지갑 끈 효과를 유발하고, 절단 상처에서 돌출된 후 제거됩니다. 몸 길이는 처음에 증가하지만 지느러미는 재생되지 않습니다.

초기 단계에서. 절단 후 약 14시간이 지나면 지느러미가 근위부에서 원위부로 자라기 시작합니다. 요약하면, 본 연구 결과는 절단이 상처 수축을 유발하며, 이는 세포 압출을 촉진하는 데 필수적일 수 있음을 보여줍니다.

이 과정이 완료되면 지느러미가 재생되기 시작합니다. 발달 지느러미 성장이 발생하는 것으로 보입니다. 이 과정과는 별개로, 우리는 살아있는 제브라피시 유충을 사용하여 조직 복구의 역동적인 과정을 관찰할 수 있는 방법을 제시했습니다.

이 절차에는 결과를 최적화하기 위해 테스트한 특정 측면이 필요합니다. 제시된 이미징 방법의 분명한 장점은 CCD 카메라와 TimeLapse 소프트웨어가 장착된 모든 실체 현미경에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 또한 더 비싼 컨포칼 이미징 시스템에 대한 저렴한 대안을 제공합니다.

이 방법은 형광이나 세포 검출을 사용하지 않지만, 산산 제어를 위한 자동화 시스템 및 사후 이미징 디콘볼루션 소프트웨어를 활용하여 세포 내 해상도로 상처 복구 및 재생 과정을 추가로 관찰함으로써 이러한 응용 분야로 확장할 수 있습니다. 이 방법은 학생들에게 기본적인 생물학적 과정, 근본적인 조직 복구 및 재생에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 광학적 선명도와 배아 및 유충 제브라피시를 쉽게 사용할 수 있으며 모든 실체 현미경에 대한 시스템의 적응성은 교실 환경에서 기본 척추 생물학을 가르치는 데 적합합니다.