시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

본 영상에서는 타임랩스 이미징을 통해 스테레오 현미경으로 조직 복구 역학을 포착하는 방법을 시연합니다. 이를 위해 먼저 제브라피시 배아를 꼬리지느러미가 절단 수술을 용이하게 수행할 수 있을 만큼 충분히 발달한 유생 단계까지 성장시킵니다. 이는 일반적으로 부화 후에 이루어집니다.

두 번째 단계는 주사바늘을 사용하여 꼬리지느러미를 절단하는 것입니다. 세 번째 단계는 유생을 이미징 챔버에 고정하고 실체 현미경으로 타임랩스 영상을 촬영하는 것입니다. 마지막 단계는 Bit Plains S 또는 오픈 소스 소프트웨어인 Image J와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 꼬리지느러미 재생 정도를 정량화하는 것입니다. 안녕하세요. 저희 연구실에서는 제브라피시를 모델로 하여 상처 치유와 조직 재생을 연구하고 있습니다.

오늘은 명시야 스테레오 현미경을 사용하여 이러한 과정의 역동성을 실시간으로 포착하는 방법을 시연하겠습니다. 제브라피시 유생의 꼬리 지느러미를 이용하여 조직 재생의 초기 과정을 포착하는 방법을 보여드리겠습니다. 본 영상 기법은 단순한 현미경 설정에서도 전체 조직 규모의 거동을 관찰하고 분석할 수 있는 기회를 제공하며, 타임랩스 기능이 갖춰진 모든 스테레오 현미경에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 제브라피쉬를 유생 단계까지 사육합니다. 꼬리 지느러미의 상처 치유는 부화 이후 단계에서 가장 잘 관찰할 수 있는데, 이 시기에는 꼬리 지느러미가 충분히 발달하여 척수나 다른 조직을 손상시키지 않고도 쉽게 절단술을 수행할 수 있기 때문입니다.

인접한 곳에서 알을 수집하여 28 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 죽은 배아를 제거하고 0.03% instant ocean aquarium salt 용액이 포함된 배아 배지로 헹굽니다. 필요한 경우, 유생의 색소 침착을 방지하기 위해 0.003% pheno thyroid가 포함된 배아 배지를 디쉬에 추가합니다.

본 시연에서는 배아가 인큐베이터 내에서 수정 후 2일까지 발달하여 유충이 난막에서 부화할 때까지 기다린 후 이미징 챔버를 준비합니다. 이 단계에서는 이미징 챔버를 제작하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 일반 철물점에서 구입할 수 있는 음용수 등급의 PVC 또는 테플론 튜브로 이미징 챔버를 제작하는 것입니다.

커버슬립 부착에 적합한 크기인 외경 25 millimeter 및 내경 20 millimeter의 튜빙을 사용하십시오. 튜빙을 가급적 균일하게 10 millimeter 두께의 링 모양으로 자릅니다. 사포를 사용하여 가장자리를 매끄럽게 다듬은 후, 물과 에탄올로 헹굽니다.

챔버를 공기 중에서 건조시키십시오. 두 번째 방법은 기성품인 매트 테크(matte tech) 유리 바닥 및 유리 상단 이미징 챔버를 사용하거나, 작은 페트리 접시로 이미징 챔버를 직접 제작하는 것입니다. 이미징 챔버를 직접 제작하려면 35 또는 50 mm 페트리 접시를 사용하고 뚜껑에 10 mm 구멍을 뚫으십시오.

다음으로 커버슬립 외부에 실리콘 그리스를 바르고, 마운팅 아가로스가 단단히 부착되어 있도록 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 25 by 25 millimeter 크기의 정사각형 또는 원형 커버슬립을 외부에 부착합니다. 이미징 과정 중에 커버슬립 내부에 미세 플라스틱 메시를 부착합니다. 이는 메시를 내부 링 직경 크기로 자른 후, 메시 중앙에 유충 크기의 약 3배 정도 되는 작은 직사각형 모양으로 절개하여 수행할 수 있습니다.

손상 전 유충의 마운팅 및 이미징 단계입니다. 이 단계는 추후 지느러미 재생 정도를 정량화하는 데 적합합니다. 먼저, 표본 고정을 위해 배아 배지(embryo medium)에 0.5% low melt agarose 용액을 준비하고, 42 °C로 유지된 agarose 용액에 마취된 유충을 옮깁니다.

가열 블록 내에서, 애벌레를 agros 한 방울과 함께 작은 페트리 접시에 옮기고 애벌레를 옆으로 눕혀 배치합니다. 캡이 씌워진 마이크로 로더 팁을 사용하여 agros를 응고시킨 후 trica 용액을 추가합니다. 이후에 사용할 실체 현미경으로 이동합니다.

타임랩스 이미징을 위해, 본 시연에서는 zeiss discovery V 12 실체 현미경과 Axio vision 소프트웨어를 사용합니다. 먼저, 이미징에 적합한 대물렌즈와 배율을 선택하여 현미경 설정을 조정하십시오. 그런 다음 Axio vision 소프트웨어 내 현미경 설정에서 카메라 검출 모드를 선택하십시오.

라이브 모드를 선택하여 화면에서 유충을 확인합니다. 속성 창을 열어 밝기를 자동으로 감지하거나 현미경 투과조명 베이스에서 대비를 수동으로 조절하십시오. 유충을 시야 밖으로 이동시킨 후 쉐이딩 보정 기능을 선택합니다.

배경 소음을 최소화하기 위해 유충을 다시 시야 내에 배치하고 스냅샷을 촬영하십시오. 상처를 입히는 준비를 위해 이미지를 저장하십시오. 먼저 머리에서 에어로졸을 긁어내어 에어로졸로부터 유충을 제거하십시오.

이렇게 하면 머리 부분을 나머지 aeros 절단 분석법에서 부드럽게 당겨 유충이 aeros에서 빠져나올 수 있게 됩니다. instant ocean 염수 용액을 사용하여 1.5% aeros 플레이트를 준비합니다. 실체 현미경 하에서 유충을 굳어진 aros 위에 옆으로 놓은 다음, 23 gauge 주사 바늘을 사용하여 꼬리 지느러미의 원위부를 절단합니다.

타임랩스 이미징을 위한 유충 고정. 두 가지 타임랩스 이미징 방법을 제시하겠습니다. 첫 번째 방법에서는 유충을 고정한 후 챔버 링(chamber ring) 내에서 유충을 이미징하는 방법을 보여드리겠습니다.

캡이 씌워진 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 원위 꼬리 지느러미 주변에 응고된 아가로스를 조심스럽게 긁어냅니다. 이는 적절한 상처 치유 또는 조직 재생을 가능하게 합니다. 조직을 고정하지 않은 상태에서 지느러미에 반복적으로 손상을 주지 않도록 주의하십시오. 이 과정 중에 오래된 용액을 교체하여 이미징 절차를 방해하는 불필요한 잔해물을 챔버에서 제거하십시오.

새로운 Trica 용액을 사용하여 챔버 상단에 실리콘 그리스를 도포하고, 챔버 링을 새로운 Trica 용액으로 채웁니다. 유리 슬라이드를 상단에 덮어 챔버를 밀폐하는 방법 두 가지를 적용합니다. 이 방법에서는 유리 덮개가 있는 페트리 접시에서 유충을 이미징하는 방법을 보여드리겠습니다.

유충을 커버 슬립이 있는 뚜껑 위에 고정하고, 뚜껑을 trica 용액으로 채웁니다. 꼬리지느러미에서 agros를 긁어냅니다.

다음으로, 하단 챔버의 상단 테두리에 실리콘 그리스를 바르고 챔버를 trica 용액으로 채웁니다. 뚜껑에 있는 trica 용액을 조심스럽게 따라낸 후, 뚜껑을 뒤집어 유충을 하단 챔버의 trica 용액에 담급니다. 이때 약간의 각도를 주어 진행할 수 있습니다. 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 챔버를 실리콘 그리스로 밀봉하며, 28 °C의 적정 온도가 유지되는지 확인하기 위해 타임랩스 이미징을 수행합니다.

단열을 위한 판지 에어캡으로 만든 가열 배양 챔버와 열원으로 사용하는 닭알 부화용 유선 돔을 조립합니다. 현미경 주변에 배양 챔버를 배치하고 온도를 28 °C로 조절합니다. 약 10~20분 동안 또는 온도가 안정될 때까지 가열 배양 챔버의 앞면을 열고 이미징 챔버를 현미경 위에 배치합니다.

커버 슬립이 대물렌즈를 향해 위쪽을 보도록 세웁니다. 촬영 과정 동안 지느러미의 성장과 재생 과정을 포착할 수 있도록, 시야의 3분의 2가 비어 있는 상태가 되게끔 유생의 지느러미를 배치합니다. 소프트웨어의 60 다차원 획득(multi-dimensional acquisition) 창에서 유생의 위치를 다시 조정할 필요 없이, Zack 탭의 슬라이스 모드에서 Z stack 및 타임랩스(time-lapse) 옵션을 선택합니다.

슬라이스 두께를 선택한 다음 시작/정지 모드를 선택하십시오. 타임랩스 표에서 스택의 상단 및 하단 위치를 정의하십시오. 간격과 동영상 길이를 선택한 후 시작 버튼을 눌러 녹화를 시작하십시오.

첫 1시간 이내에 유충의 X축 및 Z축 경계를 확인하십시오. 성장이나 아가로스 조성의 차이로 인해 유충의 위치가 변했을 수 있으므로, 필요한 경우 시간이 지남에 따라 유충의 위치를 다시 조정하십시오. 타임랩스 녹화가 끝나면 파일을 저장하고 후처리 및 정량화 단계의 데이터 분석을 진행하십시오.

이 섹션에서는 imas 방법 1을 통해 생성된 데이터를 분석하는 몇 가지 방법에 대해 논의합니다. 먼저, imas 소프트웨어를 사용하여 지느러미 성장을 결정하는 방법에 대해 설명하겠습니다. Amaris 소프트웨어에서 타임랩스 영상을 열고 파일을 MRS 파일 형식으로 저장하십시오.

소프트웨어 성능을 향상시키려면, 직교 뷰(orthogonal view)를 선택하여 영상을 투영 방식으로 표시하십시오. 지느러미 길이를 측정하려면, 왼쪽 상단 툴바에서 새로운 측정 지점 추가(add new measurement points) 옵션을 선택하십시오. 표시할 통계 값 설정(configure list of visible statistics value) 목록에서, 라인 모드에서 표시할 통계 값을 선택하십시오.

설정 탭에서 라벨 속성의 쌍(pairs)을 선택하고, 측정선 옆에 점 A와 B 사이의 거리를 표시하기 위해 이름(name)과 거리(distance)를 선택하십시오. 편집 모드로 전환한 후 Shift 버튼을 누른 상태에서 원위부 지느러미의 첫 번째 점을 선택합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 노 어코드(no accord)의 원위단에 있는 두 번째 점을 선택하십시오. 거리가 이미지에 표시되며, 통계 탭에서 내보낼 수 있습니다.

우측 하단의 디스크 버튼 'export all'을 선택하여 모두 내보냅니다. 측정 지점 옵션 외에도, 슬라이스 뷰어의 슬라이스 뷰 모드를 사용하여 거리를 측정할 수 있습니다. 원하는 위치로 스크롤한 후 마우스 왼쪽 버튼으로 첫 번째 지점과 두 번째 지점을 클릭하면 거리가 표시됩니다.

하지만 이 옵션은 데이터 내보내기를 지원하지 않습니다. 이제 오픈 소스 소프트웨어인 Image J를 사용하여 지느러미 면적을 결정하는 방법을 간략하게 설명하겠습니다. Zeiss Axio vision 파일 형식을 인식하는 플러그인을 사용하여 Image J에서 타임랩스(TimeLapse) 영상을 엽니다.

또는 압축되지 않은 TIFF 시퀀스를 불러오십시오. 이렇게 하면 파일에 정보가 보존되어 있지 않더라도 'analyze select set scale'에서 거리와 픽셀 및 기지의 거리를 정의하여 파일 정보가 저장되도록 할 수 있습니다. 또한, 단위 길이를 micrometers로 설정하십시오.

툴바에서 자유 선택 도구(free hand selection tool)를 선택하고, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태로 상처의 외곽선을 따라 그립니다. 상처의 가장자리를 따라 그리는 동안

분석(analyze) 메뉴 아래의 측정(measure) 옵션을 클릭하여 상처 부위의 대표 결과 면적을 표시합니다. 지느러미 절단 후 36시간 동안 부분적인 재생이 일어납니다. 지느러미 면적 측정 결과, 절단 후 약 14시간까지는 세포 사멸로 인해 지느러미 조직이 감소하다가, 이후 얇은 재생 길이가 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.

절단된 지느러미와 재생된 지느러미를 비교하면 36시간 이내에 지느러미 길이가 2.48배 증가한 것을 볼 수 있습니다. 절단은 초기에 지느러미 주름 세포에서 유출되어 절단 상처 부위에 나타났다가 이후 사라지는 액틴-미오신 케이블의 수축을 특징으로 하는 퍼스스트링 효과(purse string effect)를 유발합니다. 초기에는 몸길이가 증가하지만 지느러미는 재생되지 않습니다.

초기 단계 동안, 절단 후 약 14시간이 지나면 지느러미가 근위부에서 원위부 방향으로 자라나기 시작합니다. 요약하자면, 본 연구 결과는 절단이 상처 수축을 유발하며, 이것이 세포 압출을 촉진하는 데 필수적일 수 있음을 보여줍니다.

과정이 완료되면 지느러미의 재생이 시작됩니다. 발달 단계의 지느러미 성장이 일어나는 것으로 보입니다. 이 과정과는 별개로, 본 연구에서는 살아있는 제브라피시 유생을 이용하여 조직 수복의 역동적인 과정을 관찰할 수 있는 방법을 제시하였습니다.

본 절차는 결과물을 최적화하기 위해 당사가 검증한 특정 요소들을 필요로 합니다. 제시된 이미징 방법의 분명한 장점은 CCD 카메라와 TimeLapse 소프트웨어가 장착된 모든 스테레오 현미경에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다. 또한, 이는 더 고가인 공초점 이미징 시스템을 대체할 수 있는 저비용의 대안을 제공합니다.

본 방법은 형광이나 세포 검출을 사용하지 않지만, 파쇄 제어 자동화 시스템과 이미지 획득 후 디컨볼루션(deconvolution) 소프트웨어를 활용함으로써 이러한 응용 분야로 확장할 수 있으며, 이를 통해 세포하 해상도로 상처 치유 및 재생 과정을 더욱 상세히 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 학생들에게 조직 수복 및 재생의 근간이 되는 기초 생물학적 과정에 대한 더 깊은 이해를 제공할 수 있습니다. 제브라피시 배아와 유어의 광학적 투명성, 사용의 용이성, 그리고 모든 실체 현미경에 적용 가능한 시스템의 적응성 덕분에 강의실 환경에서 기초 척추동물 생물학을 교육하기에 적합합니다.