Name: 세포 내 칼슘의 두 광자 이미징 2 + 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 고립된 쥐 대동맥에서 두 광자 현미경을 이용한 세포 내 칼슘 및 산화 질소 측정 방법을. 이 기술은 혈관 세포의 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 심혈관 생리학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 영상 검사에 대한 도움말 박사 윌리엄 Cashdollar, 위스콘신의 혈액 연구소의 노스 웨스턴 뮤추얼 재단 이미징 센터 감사합니다. 우리는 또한이 원고과 도움이 토론의 중요한 읽기 박사 다리아 Ilatovskaya 감사합니다. 이 연구는 (AS에) 건강 보조금 HL108880의 국립 연구소 및 (AMG에) DP2-OD008396에 의해 지원되었다.

아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 쥐 대동맥 1. 분리 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지 보수) 또는 다른 IACUC로 쥐를 마취는 방법을 승인했다. </li><li> 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부 장기를 노출하기 위하여, 피부와 피하 조직을 통하여 복부 작은 복부 정중선을 절개. 도 1에 도시 된 바와 같이 사용 거즈 패드는 부드럽게 대동맥과 대정맥을 노출 창자 편향. </li><li> 간단히, 결합 조직에서와 대정맥에서 대동맥을 해부 무딘. 신장에 가능한 한 가까운 대동맥을 묶는, 봉합사를 사용하여. 대동맥 2cm과 15 ML 원뿔 TU에 배치 - 1을 해부하다정상적인 생리 소금 솔루션 포함 할 (PSS를, mM의에 : (140)의 NaCl, 1.2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2, 4.5 KCl을, 6 포도당, 10 HEPES) 얼음에. </li><li> 대동맥 단리되면, 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사. 모든 비 생존 완료시 절차는 동물의 인간 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. (3) </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 집게를 뾰족한 및 microscissors은 대동맥 떨어져 지방과 결합 조직을 해부하다. 대동맥이 깨끗하면, 길이 방향으로 대동맥을 절단하고 나중에 얼음에 PSS에 넣습니다. </li></ol> 2. 염료로드 및 배양 <ol><li> 피펫 알루미늄 호일로 피복 된 각각의 500 μL를 튜브에, DMSO 기반 솔루션에 공급된다 1mM의 FLUO-4 오전 염료, 7 μL. 시간이 지남에 따라 염료의 특성을 유지하기 위해 -20 ℃에서 냉동실에 보관합니다. 참고 :이 너무 분주lutions은 6 개월 이상 안정해야한다. </li><li> 사용하기 전에 염료 솔루션을 열기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. 바로 사용하기 전에 작업 솔루션을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 희석 시약을 보관하지 마십시오. </li><li> 더 칼슘을 포함하지 않는 PSS 450 UL에 DMSO 용액에 용해 기성품 1 mM의 FLUO-4 오전 염료의 7 μl를 추가합니다. 아세 (AM) 에스테르를 분산 도와 칼슘 염료 로딩을 향상시키기 위해 로딩 칵테일 비 기반 DMSO 10 % 플루 믹산 용액 40 μL를 추가한다. </li><li> 1 시간 동안 (2.3에서 설명)로드 칵테일이 포함 된 500 μL 튜브로 해부 대동맥를 놓습니다. 실온에서 회전하는 통에 호일과 장소 모든 튜브를 커버. </li><li> 혈관에서 NO 생성을 모니터링하지 않으려면, DAF-FM 디 아세테이트 염료를 사용합니다. 450 μL의 PSS 40 μL 플루 오닉 산 및 10 mM의 DAF-FM 디 아세테이트 5 μl를 함유하는 용액에서 대동맥 부화. (2.3에서 설명) 칼슘 배양 프로토콜과 유사하게, 배치 대동맥RT에서 30 분 다음이어서 4 ℃에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 호 및 장소에 덮여 NO-염료 용액을 함유하는 500 μL 튜브. </li><li> NO 생산이 측정되지 않을 때,도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조군으로 NO 생산을 차단하지 위해, 내피 NO 합성 효소 억제제, L-NAME을 사용하지 않는다. 그 절차는 (실온에서) 배양의 마지막 30 분 동안 (2.5에서 설명) 칵테일 100 나노 미터 L-NAME에 추가​​ 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 레이저 스캐닝 두 광자 현미경 프로토콜 <ol><li> 세포 외 염료를 제거하기 위해 깨끗한 PSS 3 번 - 1 시간 배양 후, 대동맥 2 씻는다. </li><li> 정상 PSS 또는 칼슘 - 무료 버퍼 (실험 프로토콜에 따라 다름)를 포함하는 실리콘 코팅 접시에 대동맥을 전송합니다. 실리콘과 접촉 외막 내려 실리콘 코팅 상 대동맥 핀 (즉, 접시 개구에 노출 된 내피 루멘) μ 형상 핀을 사용. 다르게는, 조각 앵커를 사용그리드 또는 접착제 조직을 해결하기 위해. 참고 : 스트레스와 기계적인 유물, 전송을 줄이고 캘리포니아 2+ - 무료 솔루션을 대동맥를 수정하고 5 기다릴 - 실험을 시작하기 전에 10 분. </li><li> 연동 펌프 또는 약물의 자동 또는 수동 응용 프로그램 또는 세포 외 솔루션을 변경하기위한 실리콘 코팅 된 플레이트에 주사기를 연결합니다. </li><li> 수직 두 광자 현미경의 노즈 피스 아래에 접시를 놓고 설치하고 시료 위의 25 × (NA 1.05 및 작동 거리 2mm) 물에 침수 대물 렌즈의 위치. 참고 :이 특정 렌즈를 사용할 수없는 경우는 일반 목적에 비해 극적으로 신호의 해상도를 증가시킬 수 있기 때문에, 특히 두 개의 광자 이미징 제조 목적을 사용합니다. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 두 개의 광자 레이저를 활성화 (레이저는 펌프에 설정하기 시작합니다). 튠 820 nm의 레이저 여기. </li><li> 표면 형광을 사용하여 대동맥을 찾아에 대물 초점거친 조정을 사용하여 내피 세포의 표면. </li><li> 여기 레이저가 모드 잠금, 비 descanned 감지기가 결합되고, 예상되는 방출 스펙트럼에 적합한 배출 필터가 설치되는 것을 보장하는, 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 모드로 전환. 참고 : 여기에, FV10-MRL / R (495 nm의 540)을 사용 하였다. </li><li> 약 5 %의 레이저 파워를 이용하여 실시간 스캐닝을 시작하고 미세 혈관 내피 세포를 시각화하기 위해 대물 초점. 주 : PSS 정상 배양 때 내피 세포 강한 형광 신호를 나타낼 것이다. 혈관이 칼슘 무료 버퍼에 배양 할 때이 눈에 띄게 약화 될 것이다. 내피 세포는 열린 대동맥의 상부 및 평활근 세포는 단지 내피 세포 (도 2 참조) 아래에서 볼 수있을 것이다. 혈관이나 매끄러운에도, 평활근 세포 및 내피 세포가 모두 존재하는 곳에있을 것이다도 때문이다. &lt;/ 리&gt; <li> 셀에 포커스가되면 현미경 소프트웨어 프로그램은 고속 스캔 모드에서 순차적 이미지 (래스터 스캔, 1.1 초의 프레임 컬렉션 주파수 512 X 512 픽셀의 윈도우)를 수집한다. FLUO-4 오전 형광과 병행하여, 혈관 수축의 변화를 감지하고 더 나은 실험 조건을 시각화하기 위해 빛의 이미지를 전달 수집합니다. </li><li> 기준 신호 이미지를 수집 한 후, 외부 용액에 칼슘 이온 농도를 변경하거나 천천히 연동 펌프 이미징 동안을 이용하여 약리 자극 에이전트를 적용합니다. 로드 된 세포 내 형광 신호 증가를 관찰한다. 참고 : 내피 세포는 흐름의 변화에 따라서는 칼슘 또는 NO 신호의 약리 활성제의 응용 프로그램을하기 전에 낮은 층류 응용 프로그램 및 차량 테스트를 사용하는 것이 좋습니다 반응한다. FLUO-4 (I FLUO-4에 대한 해리 상수 로케이션 혈관 nM의 농도 값에 세포 내 칼슘 재 계산S 345 ㎚), 형광 강도는 기준선 및 이오 노마 이신과 MnCl 2 첨가 한 후 기록 될 수있다. (4) </li></ol> 4. 이미지 처리 및 계산 <ol><li> 다운로드 및 피지를 이미지 처리 패키지를 설치합니다. </li><li> 피지에서 이미지 파일을 엽니 다. 메시지가 표시되면 파일을 가져 오기하면, 채널 (투과광 및 형광 신호)를 분할합니다. 데이터 분석에만 형광 신호를 사용한다. </li><li> 피지 프로그램 내에서 분석 탭을 클릭하고 도구 옵션을 아래로 스크롤합니다. 도구 옵션에서 투자 수익 (ROI) 관리자를 말한다 탭을 찾아서 클릭; 새 창이 나타납니다. </li><li> 이 후, 분석 탭에서 설정 한 측정을 클릭합니다. 관심의 특정 측정을 선택합니다. 칼슘 과도 측정을 위해 평균 회색 값 옵션을 사용합니다. </li><li> 원형 추적 도구를, 관심 영역 (ROI)을 추적하고 모든 연구에 대한 투자 수익 (ROI) 관리자 화면에서 &quot;추가&quot;를 클릭하기 시작OI. 일단 관심의 모든 세포는 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 &quot;추가&quot;탭에서 다중 측정을 선택, 추적하고있다. 스프레드 시트로 이러한 측정을 모두 직접 측정 값을 저장하거나 복사 및 붙여 넣기하는 중 기억하십시오. </li><li> 열기 * .txt 인 파일이나 Excel 스프레드 시트 피지에서 새 원본 워크 시트에 숫자를 전송합니다. 참고 : 또한, 추가 분석을 위해 시그마 플롯 또는 프리즘과 같은 어떤 프로그램을 사용합니다. </li><li> 원산지 프로그램 내에서 모든 과도 응답의 개요를 관찰 할 줄 + 기호 메뉴 → 플롯을 사용합니다. 응답하지 않는 세포의 선택을 취소합니다. </li><li> 시간 척도 (X 축)에 대한 추적 번호를 다시 계산, 열 → 설정 열 값을 사용하고 (우리의 경우 1.1s에서) 이미지 모음 주파수로 추적 번호 열을 곱합니다. </li><li> 평균 (Y 축) 및 표준 오류 추적을 계산하기 위해 선택한 모든 레코딩을위한 행에 분석 → 통계를 사용합니다. 세포의 현재 그룹이 라인 + 기호 → 플롯에 대한 최종 그래프를 플롯. </li><li> MEA다음으로 N 칼슘 과도 계산이 설명되어 있습니다. <ol><li> 원산지 프로그램 내 총 칼슘 릴리스, 다음, 그래프를 클릭 메뉴 분석 → 미적분을 사용 → 통합 할 수 있습니다. 곡선 아래 영역의 총 적분 결과 로그에 나타납니다. </li><li> (X 축이 과도 응답 끝으로 최대 범위 선택) 분석 → 비선형 커브 피팅 → 선택 데이터 세트 : 과도 반응 속도를 들어, 그래프를 클릭 한 다음 메뉴를 사용합니다. 완료 → 지수 감쇄 1 → 기능 선택 → 피팅 시작합니다. 지수 피팅 그래프 창에 표시 및 로그 결과 :합니다. 획득 한 데이터 (값)는 칼슘의 방출 총량을 나타내고, 채널의 동력학은 과도 응답을 매개. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li>
<li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H%282%29O%282%29+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIlatovskaya%2C+DV+%22J+Vis.+Exp%22">J Vis. Exp</a>. In Press, (2015).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2%2B+signaling+and+NO+production+in+rat+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li>
<li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+network%3A+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li>
<li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li>
<li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Multiphoton+Microscopy%3A+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li>
<li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li>
<li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li>
<li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li>
<li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 2 +] 나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는 것이 중요하다. 플루로 닉 산 2) 칼슘 라벨 염료의 보육 또는 NO-라벨 염료는 다른 선박 유형, 다른 플루로 닉 산 및 배양 시간을 테스트 할 필요가있다, 그러나 중요하다. 그리드 핀 실리콘 코팅 접시 대동맥 3)는 적당한 고정 이광자 현미경 영상 중에 안정한 모습을 제공한다. 혈관이 수축과 팽창 것 때문에 선박이 prope이 있는지 확인하는 것이 중요하다RLY 발생하는 움직임 아티팩트를 피하기 위해 접시에 고정. 결과 4) 정량. 과도 진폭이 항상 세포의 생리 학적 특성을 비교하는 가장 좋은 매개...

칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다. 이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. 1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 2+] i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 - 대 - 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &마이크로; l DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 직립 현미경</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>스펙트럼 물리학</td><td></td><td>Ti:사파이어 레이저 690nm & 1040nm</td></tr><tr><td>필터</td><td>올림푸스</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>495에서 540 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>25&times; 물에 잠기는 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 및 작동 거리 2mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&nbsp;</td><td>워너 인스트루먼트&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>기타 기본 시약&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 2 +] 난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.

생리 정확하게 혈관 (혈관 확장 및 혈관 수축) 칼슘의 기여도를 평가하기 위해, 프로토콜은 내피 세포 및 절연 그대로 대동맥 평활근 세포에 모두 칼슘 염료를로드하기 위해 설계되었다. 그림 1에 묘사 된 설정 일반적인 실험은 고립과 이미징 전에 용기의 제조를위한 기본 전략을 보여줍니다. 간략하게, 래트 대동맥의 분리 후, 지방 및 결합 조직의 세정되어야하며, 길이 방향 슬릿. 열린 대동맥이어서 광 락으로 1 시간 동안 RT에서 및 프로토콜에 기재된 바와 같이 배양 전에 준비된 로딩 칵테일을 함유하는 호일 덮인 500 μL를 튜브에 배치한다. 배양 후, 대동맥은 위쪽으로 실리콘과 루멘 가까운 외막과 실리콘 커버 플레이트에 내려 고정, 세척해야하며, 이미징을위한 수직 두 광자 현미경으로 전송. ONC전자 대동맥이 현미경에 배치되어 있으며, 선박의 초점이, ​​내피 세포는 강한 형광 방출 (그림 2A)에</s...

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다. 여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

이 절차의 전반적인 목표는 이광자 현미경을 사용하여 갓 분리한 혈관 내의 칼슘 또는 일산화질소를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 혈관을 기계적으로 분리하고 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 혈관을 칼슘 표지 염료 또는 nitronic acid가 포함된 O 표지 염료 내에서 배양합니다.그 다음, 두 광자 이미징(two photon imaging) 동안 안정적인 시야를 확보하기 위해 그리드와 핀을 사용하여 용기를 실리콘 코팅 디시에 고정합니다. 마지막으로 두 광자 이미징을 수행하고 그 결과를 정량화합니다. 이 비디오는 세포 외 칼슘 농도 변화에 반응하여 분리된 혈관 내피세포의 세포 내 칼슘 신호 전달이 상승하는 모습을 보여줍니다.최종적으로 이 방법은 연구자가 갓 분리한 혈관의 내피세포 또는 평활근세포에서 칼슘 또는 산화질소의 변화를 모니터링할 수 있게 해줄 것입니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 혈관 조직 내 세포 내 과정에 대해 더 나은 신호 분해능과 정밀한 측정을 제공할 수 있다는 점입니다. 본 연구에서는 이 기술을 고전적인(기하학적 다이스가 아닌) 다이스와 결합하여 적용함으로써, 분리된 중공 기관의 개별 세포에서 칼슘 과도 현상과 산화질소 생성을 측정하였습니다.우리는 이 기술이 서로 다른 혈관 세포 유형 내에서 세포 내 칼슘 및 산화물 수준을 조절하는 메커니즘에 대한 지식을 발전시키는 데 도움이 될 것이라고 믿습니다. 살아있는 세포, 특히 혈관과 같은 온전한 조직의 이광자 여기 현미경 이미징은 고해상도 신호와 낮은 초점 외 배경 형광이라는 장점을 제공합니다. 이광자 여기의 좁은 국소화는 조직 내의 단일 초점 부피만을 조명하여, 초점 외 흡수를 크게 줄이고 빛 산란을 감소시킴으로써 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 포함하여 자가 형광이 강한 조직 내의 형광체 역동성을 이미징할 수 있게 합니다.해부 현미경 하에서 텍스트 프로토콜에 따라 쥐의 대동맥을 분리한 후, 미세 팁 핀셋과 미세 가위를 사용하여 대동맥에서 지방과 결합 조직을 제거합니다. 세척이 완료되면 장기를 세로로 절단하고, 나중에 사용하기 위해 생리식염수(PSS)로 옮깁니다. 로딩 칵테일을 준비하려면, 칼슘이 포함되지 않은 PSS 450 µL에 기성품 1 mM Fluo-4 AM 염료 및 DMSO 용액 7 µL를 첨가합니다.그 다음, 아세트 메틸 에스테르의 분산을 돕고 칼슘 염료의 로딩을 개선하기 위해 DMSO가 포함되지 않은 10%onic acid 용액 40 µL를 로딩 칵테일에 첨가합니다. 적출한 대동맥을 로딩 칵테일이 들어 있는 500 µL 튜브에 넣습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 상온의 회전 쉐이커에서 1시간 동안 반응시킵니다.텍스트 프로토콜에 따라 대동맥 조직을 실리콘 코팅 접시 표면에 고정한 후, 접시를 정립형 이광자 현미경의 노즈피스 아래에 배치하고 25배 수침 대물렌즈를 시료 위에 설치 및 정렬합니다. 현미경 포트에 해당하는 방출 필터를 설치하십시오. 소프트웨어를 사용하여 이광자 적외선 레이저를 활성화하고, 투과광 상태에서 레이저 여기 파장을 820 nanometers로 조정합니다. 대물렌즈의 조동나사를 사용하여 대동맥의 위치를 찾고 대물렌즈의 초점을 내피 세포 표면에 맞춥니다.현미경을 이광자 레이저 스캐닝 모드로 전환하고, 여기 레이저가 모드 잠금(mode locked) 상태인지 확인하십시오. 비 DS 스캔 검출기를 약 5~10%의 레이저 출력으로 작동시킵니다. 라이브 스캐닝을 시작하십시오.마지막으로, 대물렌즈를 조절하여 내피세포 또는 평활근 세포의 초점을 맞춥니다. 실험 프로토콜 텍스트에 따라 연속 이미지를 수집하십시오. 이미지 처리 및 계산을 수행할 수 있도록 메타데이터가 포함된 형식으로 이미지를 저장하고, GNU 일반 공중 사용 허가서(GPL) 하에 배포되는 Fiji 이미지 처리 패키지를 다운로드하여 설치하십시오.소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 프롬프트가 나타나면, Fiji 프로그램 내에서 데이터 분석을 위해 형광 채널만 사용하도록 투과광과 형광 채널을 분리하십시오. 분석(analyze) 탭을 클릭하고 도구(tools) 옵션까지 스크롤하여 내려갑니다.그런 다음 ROI 매니저 탭을 클릭하면 새 창이 나타납니다. 다음으로, 분석 탭 아래에서 측정 항목 설정(set measurements)을 클릭하고 관심 있는 특정 측정 항목을 선택합니다. 이는 칼슘 과도 현상(calcium transient) 측정을 위한 것입니다.평균 회색조 값(mean gray value) 옵션을 사용하십시오. 그다지 원형 트레이스 도구로 관심 영역을 트레이스하기 시작하고, ROI 매니저에서 선택한 각 ROI마다 추가(add)를 클릭하십시오. 관심 있는 모든 세포의 트레이스가 완료되면, ROI 매니저의 more 탭에서 다중 측정(multi mesure)을 선택하십시오.마지막으로, 측정값을 직접 저장하거나 스프레드시트에 복사하여 붙여넣은 후 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행하십시오. 이 비디오에서 설명한 프로토콜을 사용하면 대동맥의 내피세포는 그 형태와 강한 형광 신호 덕분에 쉽게 찾을 수 있습니다. 내피세포와 동일한 시야에서 평활근세포 또한 관찰될 것이며, 이는 두 세포 유형이 서로 다르면서도 공동으로 다양한 작용제 및 자극에 어떻게 반응하는지를 더 잘 이해하게 하여 본 방법의 유용성을 입증해 줄 것입니다.아세틸콜린 또는 내피의 강력한 칼슘 의존성 혈관 확장제인 CHA에 대한 반응 측정은 여기에서 보여주는 바와 같이 수행되었습니다. CHA를 첨가하면 PSS만 처리한 세포와 비교하여 내피세포의 형광이 증가하며, 이는 세포 내 칼슘 함량이 빠르게 증가했다가 서서히 기저선으로 돌아오는 것을 나타냅니다. 이 프로토콜은 내피의 산화질소 생성 검출에도 적합합니다. 본 실험에서는 대동맥 내피세포에 DAF FM DA를 로딩하였습니다.Dye ENO 생성은 CH 자극에 반응하여 칼슘 의존적 방식으로 증가하였으며, 이러한 반응은 혈관 내피 OCH 합성효소 억제제인 L name에 의해 차단되었습니다. 이 방법은 심혈관 생리학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 설명된 실험 절차를 가용한 여러 유전자 변형 동물 모델과 함께 사용함으로써, 기초 및 중개 연구에서 두 광자 현미경의 FAR FSA 응용에 대한 새로운 관점을 제공합니다.이 접근법을 사용하면 혈관 세포 내의 특정 세포 내 신호 전달 경로에 대한 심층적인 이해와 기전적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 갓 분리한 혈관의 개별 세포 내 칼슘 및 일산화질소 수치를 실시간으로 모니터링하기 위해 이 기술을 적용하는 방법을 배우게 될 것입니다.

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

여기에서는 2차원 타임랩스 이미지 시퀀스 내에서 양의 신호 영역에 할당된 최적의 타원 정렬을 기반으로 하는 새로운 관심 영역 분석 프로토콜이 시연됩니다. 이 알고리즘을 통해 연구자는 최소한의 사용자 입력 및 바이어스로 생리학적 Ca2+ 신호를 종합적으로 분석할 수 있습니다.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

배우세요 고립된 쥐 대동맥에서 두 광자 현미경을 이용한 세포 내 칼슘 및 산화 질소 측정 방법을. 이 기술은 혈관 세포의 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 심혈관 생리학 연구에 활용됩니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

더 많은 동영상 탐색