췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

다음 절차의 전반적인 목표는 앵커리지 독립 배양 기술을 사용하여 체외에서 암 줄기세포를 확장한 다음 새로운 암 줄기세포 표적 요법의 대사 효과를 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 인간 췌장 선암 조직 샘플을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 종양 조직을 효소로 추가로 소화한 다음 젤라틴 플레이트에 파종하여 섬유아세포 집단을 제거하고, 분리된 암세포를 초저 부착 멀티 웰 플레이트에 파종하고 관심 약물로 처리하여 대사 활성 및 종양 구체의 형성을 평가합니다.

궁극적으로, 관심 약물은 in vivo에서 약물의 효과를 검증하기 위해 환자 유래 이종이식편을 지닌 면역이 저하된 마우스에 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 암 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구이며 새로운 암 줄기세포 표적 치료법을 개발하기 위한 첫 번째 단계 역할을 합니다. 유방암 연구소(Breast Cancer Institute)의 암 및 노화 줄기세포 센터(Center for Stem Cells in Cancer and Aging)의 주니어 연구원인 저와 제 연구실의 박사 과정 학생인 티니 크루즈(Tini Cruz)가 멸균된 생물 안전 캐비닛에서 췌관 선암종에서 암 줄기세포를 분리하는 절차를 시연할 것입니다.

멸균 메스와 겸자를 사용하여 1ml의 멸균 PBS가 들어 있는 60 x 15mm 배양 접시에 인간 종양을 다진 다음 조직이 완전히 해리될 때까지 필요에 따라 3-4ml의 PBS를 추가합니다. 조직 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS를 최종 부피 5ml에 추가합니다. 그런 다음 해리 원심분리기로 샘플을 기계적으로 균질화하고 섭씨 37도에서 콜라겐분해효소로 균질화된 조직을 분해합니다.

한 시간의 원심 분리기 후, 세포는 10 밀리리터의 완전한 배지에 펠릿을 현탁시켜 다시 활성화합니다. 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 세포를 다시 스핀다운합니다. 이번에는 펠릿을 5 밀리리터의 CK에 현탁시켜 실온에서 5분 후 원심분리로 적혈구 용해 완충액을 제거하고 펠렛을 암 줄기세포 배지에 재현탁

그런 다음 젤라틴으로 코팅된 접시에 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 빠르게 부착되는 섬유아세포 대부분을 제거합니다. 1시간 후, 상층액을 회수하고 생존 가능한 췌장암 세포의 수를 정량화하여 암의 종양 구체 형성을 촉진합니다. 줄기세포 농축은 암 줄기세포 배지의 적절한 부피에 세포를 10배의 최종 농도로 10배의 최종 농도로 희석하여 1밀리리터당 3개의 세포로 희석한 후 얼음에 몇 분 동안 냉각시킵니다.

그런 다음 24개의 초저 부착 세포 플레이트의 첫 번째 및 마지막 열에 500마이크로리터의 PBS를 추가한 후 피펫으로 세포를 다시 현탁시키고 플레이트의 빈 웰에 웰당 1ml의 셀을 시딩합니다. 4개의 세포 웰을 관심 약물로 처리하고 최소 4개의 음성 대조군 웰을 비히클로 처리합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 일주일 동안 배양합니다.

격일로 각 우물에 차량에 새로운 치료를 추가하십시오. 5일차 또는 7일차에는 종양 구체의 연속 포장을 위한 더 큰 구조를 식별할 수 있는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 형성된 종양 구체의 수를 평가합니다. 7일째에는 40마이크로미터 세포 여과기를 사용하여 구체를 수확합니다.

다음으로, 구체를 스핀다운하고 섭씨 37도에서 20분 동안 1ml의 트립신으로 배양하여 펠릿을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 그런 다음 방금 시연된 것처럼 세포를 다시 7일 동안 확장하여 방금 시연한 대로 해리 후 활성 산소 종 또는 ROS 생산을 측정하기 위해 구체를 준비하고, 구체를 스핀다운하고 적절한 프로브를 포함하는 HBSS에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도의 어둠 속에서 20분 동안 배양한 후, 유세포 분석법으로 분석할 때까지 세포를 얼음 위에 올려 놓고 산소 소비량을 측정하기 위해 구체를 준비합니다.

먼저 실온에서 최소 20분 동안 96웰 세포 배양 플레이트를 세포 및 조직 접착제로 코팅합니다. 다음으로, 시연된 대로 구체와 트립신을 해리합니다. 그런 다음 플레이트를 물로 2-3회 세척하여 여분의 접착 플레이트를 제거하고, 단일 셀은 3배 10에서 웰당 5번째 셀을 제거합니다.

150마이크로리터의 산소 소비량 분석에서 포도당과 피루브산 나트륨을 함유한 배지는 G의 100배에 도달할 때까지 원심분리를 통해 세포를 웰 바닥에 부착합니다. 분리와 함께 원심분리기를 멈춥니다. 그런 다음 플레이트의 방향을 바꾸고 스핀을 반복합니다.

이제 이산화탄소없이 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 한편, 분석 카트리지 가져오기를 로드합니다. A, B 및 C. 관심 약물의 3, 6 및 9 밀리 몰 농도의 25 마이크로 리터를 각각 주입하고 미토콘드리아 억제제 론의 1 마이크로 몰 농도의 25 마이크로 리터에서 D를 가져옵니다.

세포가 준비되면 카트리지를 보정하고 세포 배양 플레이트를 로드합니다. 마지막으로 혼합 및 측정의 표준 프로토콜로 분석을 실행합니다.이러한 대표적인 실험에서 췌장암 줄기세포를 메트포르민으로 처리하면 종양 구체의 크기와 수가 크게 감소했습니다. 또한, 이러한 감소는 2차 및 3차 영역 문화에 의해 나타났습니다.

1차 구체 배양액만 메트포르민으로 처리한 경우에도 메트포르민은 미토콘드리아 억제제로 작용하는 것으로 알려졌습니다. 실제로, 이 실험에서 이 약물은 ROS 생산을 유도하는 능력과 상관관계가 있는 종양 세포의 산소 소비량을 급격히 용량 의존적으로 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 중요한 것은 메트포르민을 투여한 마우스가 대조군에 비해 단기적이지만 췌장 선암 진행이 현저히 감소

이 비디오를 시청한 후에는 새로운 인간 종양을 해리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 원발암세포를 분리하여 구체 형성 배양으로 설정하고 췌장암 줄기세포의 대사 활성을 평가합니다.