Name: 지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 지방 조직에 열 발생 세포를 캡슐화하여 이식하는 방법으로, 비만 치료 연구에 활용할 수 있습니다. 이 기술은 에너지 소비를 촉진하는 새로운 치료 전략을 제시합니다.

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우리는 편집 도움 제니퍼 Petrosino 다윗 DiSilvestro에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국의 계란 이사회와 노보 노 디스크 제약에서 상 번호 10040042에서뿐만 아니라 OSU에서 식품 혁신 센터, 사무실 국제 문제에 대한 고급 기능 식품 연구 센터 및 기업가 정신에 의해뿐만 아니라 같은 상 번호 20020728에 의해 지원되었다 국립 과학 재단 (National Science Foundation)은 EEC-0914790 (LJL)을 부여합니다. 의료 연구에 대한 NIH 로드맵에 의해 건강 (OD)의 이사, 국립 연구소의 사무실에 의해 투자 및 지원 연구 자원을위한 국가 센터에서 수상 번호 R21OD017244 (OZ)과 UL1RR025755 (OSUCCC)에 의해 지원되었다 기술 프로젝트, NCI P30CA16058. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 연구 자원을위한 국가 센터 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

연구 프로토콜은 오하이오 주립 대학 윤리위원회에 의해 승인되었다. 동물 실험은 IACUC 프로토콜에 의해 승인되었다. 모든 절차는 층류와 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에서 수행 하였다. 우리는 모든 표준 안전 요구 사항 및 절차를 따랐다. 마이크로 캡슐의 제조를위한 마이크로 캡슐화 기술은, (18) (17) 기재된 바와 같이 수행되었다. 재료 1. 준비 <ol><li> 멸균 생리 식염수 (물 중 0.9 % 염화나트륨)에 2 %의 알긴산 나트륨 용액 10 ㎖를 준비한다. 생리 식염수 0.05 % PLL 솔루션을 준비합니다. 전날 이러한 솔루션을 준비하고 밤새 교반. 사용하기 전에 0.22 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 50 mM의 시트르산 나트륨 0.9 % 염화나트륨 용액에 100 mM의 CaCl2를 준비하고이를 오토 클레이브. </li><li> 모든 솔루션, 바늘, 전극 및 비커를 압력솥. 막힘 방지하기 와이어 철저히 바늘. </li><li> (102 마이크로 캡슐이 아니라 모든 CM이 필요한 캡슐 (18) 당 500 세포가 약가된다) 캡슐에 사용할 세포의 적절한 양을 결정합니다. 이백만 세포 당 알긴산 나트륨 1 ㎖를 사용합니다. </li><li> 높은 혈당에 &#39;섬유 아세포 성장 보통&#39;포함 10 % 혈청, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 준비 (4,500 ㎎ / ℓ의 포도당) 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM). <ol><li> DMEM에서 10 % 소 태아 혈청, 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 1 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 0.5 mM의 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 &#39;분화 중간 I&#39;를 준비한다. </li><li> DMEM에서 &#39;분화 중간 II&#39;함유 10 % 소 태아 혈청, 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 준비한다. </li></ol></li><li> (RI를 10 ml의 라​​디오 - 면역 침전 분석 완충액 당 프로테아제 억제제 정제를 함유하는 용해 버퍼를 준비PA 버퍼). </li></ol> 2. 알긴산 마이크로 비드 준비 (그림 1A) <ol><li> 세포 배양 플라스크에서 오래된 매체를 제거합니다. PBS의 10 ㎖로 세포를 씻어. 0.25 % 트립신 - EDTA (일 합류 T175 플라스크 당 2 ml)로 서스펜션에 세포를 가져와. </li><li> 혈구를 사용하여 세포 현탁액에서 세포를 계산합니다. 세포 현탁액에서 10 ml의 나누어지는을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포를 계산합니다. 5 분 동안 실온에서 480 XG에서 원심 분리 배지에 남아있는 세포를 원심 분리기. </li><li> 단계 1.4에 기재된 바와 같이 알긴산 나트륨의 세포 펠렛을 일시. 5 mL의 주사기에 알긴산 나트륨 용액 세포 이동. </li><li> 23 게이지 바늘을 추가, 용액의 기포를 제거하고 공기의 1 ml의 포켓을 만들 주사기를 반전. </li><li> 캡슐의 바늘 주둥이에서 100 mM의 염화칼슘 2 용액 144 ml의를 포함하는 작은 비커 (180 ml)에 놓습니다. 팁 approxim로 캡슐에 전극을 부착100 mM의 CaCl2를 용액의 표면 위 ately 2.5 cm. </li><li> 단단히 주사기 펌프에 알긴산 나트륨을 세포를 포함하는 용액을 주사기 놓는다. 주사기의 구멍에 고무 튜브를 연결합니다. 알긴산 나트륨 셀 솔루션은 튜브를 통해 중간에 들어갈 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 5.4 kV의에 전압을 조정합니다. 주사기 펌프에 12.06 mm 직경을 설정합니다. 3 ㎖ / 시간에 속도를 조정합니다. 펌프를 시작합니다. 캡슐의 전원을 켜고 5.4 kV로의 전압을 유지한다. </li><li> 후드의 창을 닫고 알긴산 마이크로 비드의 형성 끝날 때까지 불필요한 진동을 피하십시오. 모든 용액이 바늘을 통과 한 후, PLL로 코팅하기 전에 추가로 20 분 동안 100 mM의 CaCl2를 용액에 알긴산 공 모양의 마이크로 비드를 고화. </li></ol> PLL 3. 코팅 마이크로 비드 (그림 1B) <ol><li> 알긴산 나트륨 셀 볼 형상 마이크로 비드를 함유하는 비이커를 제거하고 이들 microb 전송할50 ㎖ 원심 분리 튜브에 EADS. 마이크로 비드 펠렛에서 염화칼슘 2 용액을 제거합니다. </li><li> 0.9 %의 NaCl 30 ㎖를 첨가하여 알긴산 세포 공 모양의 마이크로 비드를 씻는다. 부드럽게 손으로 튜브를 흔들어. 마이크로 비드가 중력에 의해 침전 한 후 25 mL를 피펫으로 0.9 %의 NaCl을 제거합니다. 3 세척 총 두 번 더 반복합니다. </li><li> 알긴산 나트륨 수용액의 각 1 ml를 0.05 %의 PLL 용액 10 ㎖을 사용한다. 10 분 동안 분당 1,000 회전에서 0.05 % PLL과 소용돌이를 추가합니다. 주 : 일반적으로, 10 분 PLL 코팅 충분하다. </li><li> PLL 코팅이 형성된 후에, PLL 용액을 제거하고, 3.2에 기재된 바와 같이 캡슐을 3 회 세척 하였다. </li></ol> 알긴산 코어 4. 제거 (그림 1C) <ol><li> 50 mM 시트르산 나트륨 용액 30 ㎖를 추가한다. 5 분 또는 모든 알긴산 나트륨이 용해 될 때까지 기다립니다. 단계 3.1.1에 기재된 바와 같이 세척 세 번 캡슐. </li><li> , 0.9 % NaCl을 제거 50 ML 튜브에 배지 20 ㎖를 추가및 세포 배양 용 플라스크에 세포를 포함하는 모든 캡슐을 전송. 표준 세포 배양 조건 18 세 미만의 캡슐화 된 세포를 처리합니다. </li></ol> 체외 응용 프로그램 5. 세포 사이의 이종 이식 및 숙주 세포의 상호 작용이나 대사 물질 유입의 속도론 / 유출을 연구하기 위해 (그림 2) <ol><li> 공동 문화에 대한 합류 할 때까지 24 웰 플레이트에 문화 숙주 세포. 배양 preadipocytes의 &#39;섬유 아세포 성장 매체&#39;를 사용합니다. </li><li> 24 웰 플레이트 함유 합류 숙주 세포 내로 전송 마이크로 캡슐. 단층을 달성하기 위해 마이크로 캡슐 (102 마이크로 캡슐 / 웰의 CM 2)를 추가합니다. </li><li> 육일에 대한 차별화 중간 II에 전 지방 세포의 분화 중간 I.와 차별화마다 48 시간, 변화 미디어를 유도한다. RIPA 완충액으로 세포를 Lyse. 웨스턴 블롯을 사용하여 단백질 발현을 분석 조건 당 50 μg의 단백질을 사용합니다. </li></ol> Treatm에 대한 생체 응용 프로그램 6.비만의 ENT (그림 3) <ol><li> 마취의 유지 보수를 위해 산소와 마취 2 % 이소 플루 란의 유도를위한 산소와 4 % 이소 플루 란을 섞는다. 발가락 핀치에 의한 적절한 마취 깊이를 확인합니다. <ol><li> 건조로부터 각막을 보호하기 위해 눈에 안티 가려움 연고를 적용합니다. </li></ol></li><li> 이러한 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 영구적 인공 형광 단백질로 표시되어 캡슐화 된 세포를 사용합니다. </li><li> 3 ML의 주사기 및 캡슐화 된 세포를 주입하는 20 게이지 바늘을 사용합니다. <ol><li> 0.5 × 10 6 세포가도 3에 도시 된 바와 같이, 생식선 및 신장 사이 복강 지역에있는 각 IAB 지방 저장소 내로 PBS 0.2 ㎖에 현탁 분사.의 평균 중량 생쥐이 PBS의 부피와 세포 수를 사용 40g. 다른 중량 용량 의존적 효과의 측정을 위해이 생쥐의 세포 수와 볼륨을 조정합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

다양한 건조 방법, 압출, 및 에멀젼을 포함하여 19 세포를 캡슐화하는데 사용되어왔다. 이 방법에서는, 알기 네이트 비드는 PLL로 코팅 및 알지네이트 코어 캡슐화를 완료 용해되고, 바늘 통해 압출된다. 이 방법이 수년 동안 사용되었지만, 원하는 크기와 형상으로 구형 비드의 형성은 여전히​​ 도전. 캡슐의 크기는 알긴산 나트륨 용액, 압출기는 직경 바늘 끝과 CaCl2를 용액 (20) 사이의 거리의 점도에 크게 의존한다. 니들 팁과 CaCl2를 용액의 표면 사이에 더 짧은 거리가 작은 구슬 일어난다된다. 설명 프로토콜은 기공 (&lt;32 kD의)와 APL의 생산 효율을 높일 수있다. 기공 크기는 실험적으로 미리 18 바와 같이 형광 면역 글로불린 (&gt; 32 kD의) 형광 작은 펩티드를 사용하여 테스트 할 수있다. 이이야기공의이지는 2 주 동안 적어도 팔십일 18 지방 조직으로 주입 한 후 생체 내...

만성 질환 1의 증가 빈도는 치료 세포 인구 2의 이식에 대한 연구를 자극했다. Syngenic 동종 또는 줄기 세포는 이러한 애플리케이션 2에 대한 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이다. 그러나 이러한 치료는 이식 후 분화 줄기 세포의 이동의 제어를 허용하지 않는 효율적인 비용이되지 않습니다. 유익한 기능을 가진 유전자 변형 세포의 이식은 많은 질병의 치료 개선을 기대하고있다. 그러나, 유전자 세포 변형이 호스트의 면역 시스템에 의해 인식되고, 따라서, 이러한 치료는 면역 3이 필요합니다. 인슐린 생성 세포의 캡슐화 박사 창 (4)에 의해 개발되었다. 기술은 염화칼슘 수용액에 침지 알긴산 방울 세포의 캡슐화에 기초한다. 알긴산 분자 (G) (M) 만누 및 guluronic 산 구성 및 CA로 연결 될 수 2+. 겔화 후, 비드를 폴리 -L- 라이신 (PLL) 용액에 현탁된다. 이 단계에서, PLL은 캡슐의 멤브레인을 설정 알지네이트 분자에 G와 M에 결합한다. 캡슐의 막의 다공성은 M 및 PLL 농도, 인큐베이션 시간, 온도 변화에 의해 조절 될 수있다. PLL의 결합도 유형과 알긴산의 농도에 따라 달라집니다. 칼슘 이온과 가교 알긴산 행렬, 생리 학적 환경이나 인산과 구연산 이온의 농도가 높은 일반적인 버퍼 솔루션의 불안정하다. 이 버퍼는 알긴산에서 칼슘을 추출하고 핵심을 녹일 수 있습니다. 알지네이트 코어의 액화는 세포 이동과 성장을위한 캡슐 내부에 공간을 제공합니다. 폴리 양이온 폴리 -L- 라이신 (APL)와 음이온 알지네이트에 캡슐화 된 세포는 면역 글로불린에 대한 침투하지만 독소의 영양소의 유입과 유출이 있습니다. 이 APL의 특성은 장기 SU 가능유 전적으로 서로 다른 호스트로 이식 후 캡슐화 된 세포의 rvival. 엘리엇 등 알. 구년 주입 후 5 인간의 환자에서 캡슐 돼지의 췌장 세포 기능의 생존을보고했다. 캡슐화 기술은 마이크로 캡슐화 (3-800 μm의) 및 macroencapsulation (1000 μm의보다 큰)로 분류 될 수있다. 마이크로 캡슐은 macrocapsules 6보다 더 내구성. 박사 장과 1964 년 동료의 발견 이후, 마이크로 캡슐화 널리 인슐린을 생산하는 근육 세포, 다른 호르몬 및 생리 활성 분자 (7)의 캡슐화를 위해 사용되어왔다. 이러한 치료는 섬유화 및 면역 반응 (8)를 포함하는 호스트 조직의 여러 도전에 직면했다. 우선, 생체 고분자의 품질과 관련된 부작용이 해결되었다. 그러나, 근육 세포의 이식은 여전히​​ 호르몬 overpr의 결과로서, 예컨대 섬유증과 같은 부작용을 개시전문 동맥의 외부 PREPARATION 기초 조작 ADVANCED. 최근 수십 년간, 비만과 제 2 형 당뇨병은 전염병 비율 9에 도달했습니다. 성인 사람들의 30 % 이상은 전 세계적으로 과체중과 비만 (10)이다. 증가 된 복강 (IAB) 지방 형성은 만성 염증의 발생 빈도를 증가시키고, 제 2 형 당뇨병, 심혈관 질환, 특정 암 및 기타 합병증 11-13을 촉진합니다. 증거의 여러 라인은 IAB 지방과 관련된 기전이 특정 지방 세포에 의해 피할 수 있음을 제안했다. 최근의 연구는 신진 대사를 개선하고 생체 (14) 설치류에서 비만과 인슐린 저항을 줄일 수 IAB 영역으로 피하 지방 세포의 이식을 보여 주었다. 비만과 인슐린 저항성의 효과적인 감소는 열 (15, 16)의 형태로 에너지를 방출 할 수있는 열 발생 지방 세포와 연결되었습니다. 지방 세포의 열 발생은 안정한 형질 변형함으로써 달성 될 수있다이러한 언 커플 링 단백질 1 (UCP1)로서 또는 다른 열 발생 및 UCP1 유전자 15,16의 발현을 조절하는 유전자의 미토콘드리아의 언 커플 링 프로톤, 참여 유전자. 우리의 최근의 연구는 알데히드 탈수소 효소 (1) A1 (Aldh1a1)의 결핍이 쥐 17, 18에서 비만과 인슐린 저항을 감소 IAB 지방의 열 발생 리모델링에 이르게 것으로 나타났다. 특히, 열 발생 Aldh1a1 결핍의 캡슐화 (Aldh1a1는 - / -) preadipocytes는 IAB 지방 (18)의 치료를위한 새로운 치료 기회를 제안, 비만 야생형 마우스에 IAB 지방에 같은 치료 효과를 매개한다. 실험 설정에서 캡슐화 된 세포는 비용 효과적인 방법으로 19에서 특정 세포 집단의 효과를 연구하기 위해 연구자 수 있습니다. 여기에서는 비만의 마우스 모델에서 열 발생 이화 세포주의 캡슐화 및 실험실 및 치료 적용 방법을 논의한다. 이 프로토콜은 T를 설명마이크로 캡슐의 제조 (도 1)에 대한하는 hree 단계 : 알지네이트 마이크로 비드 (도 1a), 폴리 양이온 성 폴리 -L- 라이신 (PLL) 마이크로 비드의 표면 (도 1b)에 멤브레인의 형성 및 제거의 형성 알지네이트 코어 (그림 1C).

<table><tbody><tr><td>캡슐화 장치 (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>없음</td></tr><tr><td>KD 과학 주사기 펌프</td><td>KD 과학</td><td>780100Y</td><td>없음</td></tr><tr><td>올림푸스 현미경&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>없음</td></tr><tr><td>알긴산 나트륨</td><td>시그마</td><td>MKBP8122V</td><td>없음</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로 브로마이드 (PLL)</td> <td>시그마</td><td>020M5006V</td><td>없음</td></tr><tr><td>염화칼슘</td> 시<td>그마</td><td>SLBJ2662V</td><td>없음</td></tr><tr><td>구연산 나트륨 삼염기 이수화물</td><td>시그마</td><td>030M0200</td><td>없음</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>SLBD2595V</td><td>없음</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>없음</td></tr><tr><td>ATGL 1차 항체(토끼에서)</td><td>Cell Signaling</td><td>2138S</td><td>없음</td></tr><tr><td>2차 항체(토끼 방지)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>없음</td></tr><tr><td>Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>None</td></tr><tr><td>Phosphate buffered 식염수 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>없음</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>없음</td></tr><tr><td>Cortizone 10 anti-itch ointment</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>없음</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>None</td></tr><tr><td>Newborn calf serum (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>None</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>없음</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>없음</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>없음</td></tr><tr><td>인슐린(소)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>없음 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>없음</td></tr></tbody></table>

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 preadipocytes

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

세포 캡슐화 반투막 내에 생존 세포를 포획하기 위해 개발되었다. 접목 캡슐화 된 세포를 장기 생존율을 달성하기 위해 처리 된 숙주의 조직에 저 분자량 대사를 교환 할 수있다. 반투막 면역계에 의해 거부를 피하기 위하여 캡슐화 된 세포를 접목 허용한다. 캡슐화 과정은 인슐린과 같은 생체 활성 화합물, 기타 호르몬, 사이토 카인의 방출을 제어 할 수 있도록 설계되었다. 여기서 우리는 비만 마우스의 복강 지방 조직에 열 발생과 에너지 손실 (열 발생)에 대한 지질 소비 이화 세포 캡슐화하는 방법을 설명한다. 열 발생 이화 세포의 캡슐화는 비만의 예방 및 치료에 잠재적으로 적용 가능하고 2 형 당뇨병있다. 이화 셀들의 또 다른 잠재적 인 애플리케이션은 알코올 대사 또는 기타 독성 및 환경 오염 물질의 해독을 포함 할 수있다.

도 1은 마이크로 비드 제조의 모든 단계가 현미경으로 제어 될 수 있음을 나타낸다.도 2a는 공동 배양하는 방법을 지방 세포를 캡슐화 된 세포의 단층으로 도시한다.도 2b는 지방 세포 / 마이크로 공동 배양을 이용하여 정량적 연구의 대표적인 예이며 그 지방 세포는 웨스턴 블롯을 이용하여 분석 하였다 제 5 해물에 설명했다. 캡슐화 된 세포는 본 실험에서 분석되지 않았다. 1,000 희석 차 ATGL와 β-액틴 항체는 1에서 사용되었다. ATGL의 비율은 β - 굴지의 정보는 다음의 제품에 3 개의 독립적 인 실험으로 평균 SD를 표시됩니다. 유사 공동 배양 방법은 공동 배양에 캡슐화 세포 및 지방 세포 상호 작용의 효과를 mRNA를 분석하고 연구하는데 사용될 수있다. - / - 지방 세포 encapsula에 비해 지방 세포에서 ATGL 리파제 및 지질 분해 (18)의 훨씬 높은 수준을 유도 열 발생 <...

여기에서는 복강 내 지방 조직에서 열 생산을 위해 지질을 소비하고 비만 마우스의 에너지 소산을 증가시키는 이화 세포의 캡슐화 프로토콜을 제시합니다.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

본 절차의 전반적인 목표는 열발생 이화작용 세포주의 캡슐화와 이를 이용한 in vitro 및 잠재적인 in vivo 응용법을 입증하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 알긴산나트륨 세포 현탁액을 준비하여 5 mL 주사기에 옮기십시오. 다음 단계는 캡슐화 장치를 사용하여 알긴산 마이크로비드를 제조하는 것입니다.그 다음 마이크로비드를 폴리 양이온성 poly L lysine 용액으로 코팅하고, 이후 알긴산 코어를 제거하여 세포 현탁액 주위에 반투과성 막을 형성합니다. 마지막 단계는 캡슐화된 세포를 다른 세포주와 공동 배양하거나 마우스의 지방 조직에 주입하는 것입니다. 최종적으로 면역 혈액 분석 결과, aldehyde dehydrogenase가 결핍된 지방세포를 포함하는 마이크로캡슐과 공동 배양된 지방세포에서 더 높은 지방 분해 활성이 나타남을 알 수 있습니다.면역조직화학 염색을 통해 캡슐화된 세포가 마우스의 지방 조직으로 성공적으로 이식되었음을 확인할 수 있으며, 이 방법은 열발생 및 갈색 지방 조직에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 다른 기존 동물 모델에도 적용 가능하여, 생체 내(in vivo)에서 세포 하위 집단을 테스트하기 위한 저비용 실험 모델 시스템을 제공할 수 있습니다. 생의학적 발견을 위해, 모든 절차는 층류 형성 장치가 있는 2단계 생물 안전 작업대 내에서 수행되어야 합니다.먼저, 세포 배양 플라스크에서 기존 배지를 제거하고 전지방세포를 10 milliliters의 PBS로 헹굽니다. PBS를 제거하고 세포를 2 milliliters의 0.25%tripsin EDTA에 재부유시킵니다. 세포 현탁액에서 10 microliter의 분주액을 취하여 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다.제조사의 지침에 따라, 남은 세포에 DMEM을 첨가하여 적정 세포 수를 맞춘 후 실온에서 480 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 프로토콜 본문의 지침에 따라 필요한 세포 수를 결정한 후, 세포 펠릿을 적절한 부피의 2% 알긴산 나트륨(sodium alginate) 망 용액에 현탁합니다. 알긴산 나트륨 세포 용액을 5 mL 주사기에 옮깁니다.용액 내의 기포를 모두 제거하고 주사기를 뒤집어 1 mL의 공기층을 만듭니다. 캡슐화를 준비하기 위해 100 mM 염화칼슘 용액 144 mL가 담긴 소형 비커를 준비합니다. 캡슐화 장치의 바늘 입구 아래에 전극을 캡슐화 대상물에 연결하고, 팁의 끝단이 염화칼슘 용액 표면으로부터 약 2.5 cm 위에 오도록 위치시킵니다.알긴산나트륨 세포 용액이 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 단단히 고정하십시오. 고무 튜브를 주사기 입구에 연결하십시오. 알긴산나트륨 세포 용액이 튜브의 절반 정도까지 들어갈 때까지 플런저를 누르십시오.전압을 5.4 kilovolts로 조정하고, 시린지 펌프의 직경을 12.06 millimeters로 설정하십시오. 속도를 시간당 3 milliliters로 조정하십시오. 펌프를 작동시키고 캡슐화 장치를 켠 다음, 전압을 5.4 kilovolts로 유지하십시오.후드의 창을 닫고 알긴산 마이크로비즈의 형성이 완료될 때까지 불필요한 진동이 발생하지 않도록 합니다. 용액이 바늘을 통해 모두 통과하면, 폴리음이온성 폴리리신(PLL)으로 코팅하기 전, 염화칼슘 용액 내에서 구형의 알긴산 마이크로비즈를 20분 동안 추가로 경화시킵니다. 알긴산 나트륨 세포 구형 마이크로비즈가 경화되면, 마이크로비즈가 담긴 비커를 캡슐화 장치에서 제거합니다.마이크로비즈를 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로비즈 펠릿에서 염화칼슘 용액을 제거합니다. 0.9% sodium chloride 용액 30 milliliters를 첨가하고 튜브를 손으로 부드럽게 흔들어 마이크로비즈를 세척합니다.마이크로비즈가 중력에 의해 침전되도록 둡니다. 그런 다음 25 milliliter 피펫을 사용하여 염화나트륨 용액을 제거합니다. 마이크로비즈를 총 3회 세척합니다.다음으로, 마이크로비드에 0.05% PLL 용액을 첨가합니다. 알긴산나트륨 용액 1 mL당 10 mL의 PLL 용액을 사용하십시오. 분당 1000회 회전 속도로 10분 동안 볼텍싱하며, 이는 일반적으로 PLL 코팅에 충분한 시간입니다.PLL 코팅 형성을 확인한 후, PLL 용액을 제거하고 앞서 설명한 대로 0.9% 염화나트륨 용액으로 캡슐을 세 번 세척하십시오. 먼저 PLL 코팅된 마이크로비즈에서 대체 코어를 제거하기 위해, 50 mL 튜브에 50 mM 시트르산나트륨 용액 30 mL를 추가합니다. 5분 동안 또는 알긴산나트륨이 모두 용해될 때까지 기다리십시오. 이전과 같이 0.9% 염화나트륨 용액으로 캡슐을 세 번 세척하십시오.배양액 20 milliliters로 세 번째 세척을 마친 후, 세포가 포함된 모든 캡슐을 세포 배양 플라스크로 옮겨 표준 세포 배양 조건에서 캡슐화된 세포를 처리합니다. 이 절차를 위한 숙주 세포는 24 웰 플레이트에서 합류(confluent)될 때까지 배양해야 합니다. 동반된 프로토콜에 기술된 대로 준비된 섬유아세포 성장 배지를 사용하십시오.전지방세포 배양을 위한 텍스트입니다. 호스트 세포가 단층으로 가득 찬 24웰 플레이트에 마이크로캡슐을 옮깁니다. 각 웰에서 단층을 형성하도록 마이크로캡슐을 추가한 후, 분화 배지 1을 사용하여 전지방세포 분화를 유도합니다. 48시간 동안 배양하십시오.48시간 후, 배지를 differentiation Medium Two로 교체합니다. 48시간마다 배지를 신선한 differentiation Medium Two로 교체합니다. 48시간마다 세포의 단백질을 western blot으로 분석합니다.마이크로비드 제작의 각 단계는 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 20배 배율로 관찰한 알지네이트 마이크로비드의 모습입니다. PLL 코팅 전, PLL 코팅 후, 그리고 정량적 분석 연구에서 지넷 코어를 용해시킨 후, 무세포 야생형 또는 aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) 결핍 지방세포를 포함하는 마이크로캡슐과 공배양된 3T3-L1 지방세포 간의 adipose triglyceride lipase (ATGL) 발현량을 비교하였습니다.L DH one A one 결핍 지방세포와 공배양된 지방세포에서 A TGL의 발현이 더 높게 나타난 것은 더 높은 지방 분해 활성을 나타냅니다. 인 비보(in vivo) 연구에서, GFP로 표지된 캡슐화 세포를 마우스의 복강 내 지방 저장소에 주입하였습니다. 80일 후, 주입된 지방 패드에서 캡슐화된 세포들의 변색된 클러스터가 확인되었습니다.헤마톡실린, 토신 및 에오신으로 염색한 복강 내 지방 저장소의 파라핀 매립 절편에서 이식된 마이크로캡슐 캡슐화 세포 집단과 숙주 지방세포가 관찰됩니다. 동일한 절편을 형광광 아래에서 분석하면 원형의 온전한 캡슐 내부에 GFP로 표지된 이식 세포가 보입니다. GFP의 발현은 분화 후 세포 생존능력을 나타내는 지표이기도 합니다.이 캡슐화 기술은 대사 질환 분야의 연구자들이 비만, 제2형 당뇨병의 인슐린 저항성, 염증, 암 및 모델 생물에 대한 가능한 치료법을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.

부고환 백색 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

배우세요 지방 조직에 열 발생 세포를 캡슐화하여 이식하는 방법으로, 비만 치료 연구에 활용할 수 있습니다. 이 기술은 에너지 소비를 촉진하는 새로운 치료 전략을 제시합니다.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

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