지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

본 절차의 전반적인 목표는 열발생 이화작용 세포주의 캡슐화와 이를 이용한 in vitro 및 잠재적인 in vivo 응용법을 입증하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 알긴산나트륨 세포 현탁액을 준비하여 5 mL 주사기에 옮기십시오. 다음 단계는 캡슐화 장치를 사용하여 알긴산 마이크로비드를 제조하는 것입니다.

그 다음 마이크로비드를 폴리 양이온성 poly L lysine 용액으로 코팅하고, 이후 알긴산 코어를 제거하여 세포 현탁액 주위에 반투과성 막을 형성합니다. 마지막 단계는 캡슐화된 세포를 다른 세포주와 공동 배양하거나 마우스의 지방 조직에 주입하는 것입니다. 최종적으로 면역 혈액 분석 결과, aldehyde dehydrogenase가 결핍된 지방세포를 포함하는 마이크로캡슐과 공동 배양된 지방세포에서 더 높은 지방 분해 활성이 나타남을 알 수 있습니다.

면역조직화학 염색을 통해 캡슐화된 세포가 마우스의 지방 조직으로 성공적으로 이식되었음을 확인할 수 있으며, 이 방법은 열발생 및 갈색 지방 조직에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 다른 기존 동물 모델에도 적용 가능하여, 생체 내(in vivo)에서 세포 하위 집단을 테스트하기 위한 저비용 실험 모델 시스템을 제공할 수 있습니다. 생의학적 발견을 위해, 모든 절차는 층류 형성 장치가 있는 2단계 생물 안전 작업대 내에서 수행되어야 합니다.

먼저, 세포 배양 플라스크에서 기존 배지를 제거하고 전지방세포를 10 milliliters의 PBS로 헹굽니다. PBS를 제거하고 세포를 2 milliliters의 0.25%tripsin EDTA에 재부유시킵니다. 세포 현탁액에서 10 microliter의 분주액을 취하여 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다.

제조사의 지침에 따라, 남은 세포에 DMEM을 첨가하여 적정 세포 수를 맞춘 후 실온에서 480 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 프로토콜 본문의 지침에 따라 필요한 세포 수를 결정한 후, 세포 펠릿을 적절한 부피의 2% 알긴산 나트륨(sodium alginate) 망 용액에 현탁합니다. 알긴산 나트륨 세포 용액을 5 mL 주사기에 옮깁니다.

용액 내의 기포를 모두 제거하고 주사기를 뒤집어 1 mL의 공기층을 만듭니다. 캡슐화를 준비하기 위해 100 mM 염화칼슘 용액 144 mL가 담긴 소형 비커를 준비합니다. 캡슐화 장치의 바늘 입구 아래에 전극을 캡슐화 대상물에 연결하고, 팁의 끝단이 염화칼슘 용액 표면으로부터 약 2.5 cm 위에 오도록 위치시킵니다.

알긴산나트륨 세포 용액이 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 단단히 고정하십시오. 고무 튜브를 주사기 입구에 연결하십시오. 알긴산나트륨 세포 용액이 튜브의 절반 정도까지 들어갈 때까지 플런저를 누르십시오.

전압을 5.4 kilovolts로 조정하고, 시린지 펌프의 직경을 12.06 millimeters로 설정하십시오. 속도를 시간당 3 milliliters로 조정하십시오. 펌프를 작동시키고 캡슐화 장치를 켠 다음, 전압을 5.4 kilovolts로 유지하십시오.

후드의 창을 닫고 알긴산 마이크로비즈의 형성이 완료될 때까지 불필요한 진동이 발생하지 않도록 합니다. 용액이 바늘을 통해 모두 통과하면, 폴리음이온성 폴리리신(PLL)으로 코팅하기 전, 염화칼슘 용액 내에서 구형의 알긴산 마이크로비즈를 20분 동안 추가로 경화시킵니다. 알긴산 나트륨 세포 구형 마이크로비즈가 경화되면, 마이크로비즈가 담긴 비커를 캡슐화 장치에서 제거합니다.

마이크로비즈를 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로비즈 펠릿에서 염화칼슘 용액을 제거합니다. 0.9% sodium chloride 용액 30 milliliters를 첨가하고 튜브를 손으로 부드럽게 흔들어 마이크로비즈를 세척합니다.

마이크로비즈가 중력에 의해 침전되도록 둡니다. 그런 다음 25 milliliter 피펫을 사용하여 염화나트륨 용액을 제거합니다. 마이크로비즈를 총 3회 세척합니다.

다음으로, 마이크로비드에 0.05% PLL 용액을 첨가합니다. 알긴산나트륨 용액 1 mL당 10 mL의 PLL 용액을 사용하십시오. 분당 1000회 회전 속도로 10분 동안 볼텍싱하며, 이는 일반적으로 PLL 코팅에 충분한 시간입니다.

PLL 코팅 형성을 확인한 후, PLL 용액을 제거하고 앞서 설명한 대로 0.9% 염화나트륨 용액으로 캡슐을 세 번 세척하십시오. 먼저 PLL 코팅된 마이크로비즈에서 대체 코어를 제거하기 위해, 50 mL 튜브에 50 mM 시트르산나트륨 용액 30 mL를 추가합니다. 5분 동안 또는 알긴산나트륨이 모두 용해될 때까지 기다리십시오. 이전과 같이 0.9% 염화나트륨 용액으로 캡슐을 세 번 세척하십시오.

배양액 20 milliliters로 세 번째 세척을 마친 후, 세포가 포함된 모든 캡슐을 세포 배양 플라스크로 옮겨 표준 세포 배양 조건에서 캡슐화된 세포를 처리합니다. 이 절차를 위한 숙주 세포는 24 웰 플레이트에서 합류(confluent)될 때까지 배양해야 합니다. 동반된 프로토콜에 기술된 대로 준비된 섬유아세포 성장 배지를 사용하십시오.

전지방세포 배양을 위한 텍스트입니다. 호스트 세포가 단층으로 가득 찬 24웰 플레이트에 마이크로캡슐을 옮깁니다. 각 웰에서 단층을 형성하도록 마이크로캡슐을 추가한 후, 분화 배지 1을 사용하여 전지방세포 분화를 유도합니다. 48시간 동안 배양하십시오.

48시간 후, 배지를 differentiation Medium Two로 교체합니다. 48시간마다 배지를 신선한 differentiation Medium Two로 교체합니다. 48시간마다 세포의 단백질을 western blot으로 분석합니다.

마이크로비드 제작의 각 단계는 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 20배 배율로 관찰한 알지네이트 마이크로비드의 모습입니다. PLL 코팅 전, PLL 코팅 후, 그리고 정량적 분석 연구에서 지넷 코어를 용해시킨 후, 무세포 야생형 또는 aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) 결핍 지방세포를 포함하는 마이크로캡슐과 공배양된 3T3-L1 지방세포 간의 adipose triglyceride lipase (ATGL) 발현량을 비교하였습니다.

L DH one A one 결핍 지방세포와 공배양된 지방세포에서 A TGL의 발현이 더 높게 나타난 것은 더 높은 지방 분해 활성을 나타냅니다. 인 비보(in vivo) 연구에서, GFP로 표지된 캡슐화 세포를 마우스의 복강 내 지방 저장소에 주입하였습니다. 80일 후, 주입된 지방 패드에서 캡슐화된 세포들의 변색된 클러스터가 확인되었습니다.

헤마톡실린, 토신 및 에오신으로 염색한 복강 내 지방 저장소의 파라핀 매립 절편에서 이식된 마이크로캡슐 캡슐화 세포 집단과 숙주 지방세포가 관찰됩니다. 동일한 절편을 형광광 아래에서 분석하면 원형의 온전한 캡슐 내부에 GFP로 표지된 이식 세포가 보입니다. GFP의 발현은 분화 후 세포 생존능력을 나타내는 지표이기도 합니다.

이 캡슐화 기술은 대사 질환 분야의 연구자들이 비만, 제2형 당뇨병의 인슐린 저항성, 염증, 암 및 모델 생물에 대한 가능한 치료법을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.