Name: 패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 패치 클램프와 라이브 형광 현미경을 사용하여 쥐 다낭성 신장 질환 모델에서 고립된 낭포 상피 세포의 이온 채널 활성과 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 신장 생리학 및 질병 병리 연구에 중요한 데이터를 제공합니다.

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저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트 Inc의)에 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는 (AS에) R01 HL108880 (OPO에) R01 DK095029과 (TSP에) K99 HL116603 (TSP에) 국립 신장 재단 IG1724 (OPO에) 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13GRNT16220002 및 부여 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다 (DVI에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동.

아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 휴스턴 텍사스 건강 과학 센터의 대학의 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 도 1은 조직의 분리 및 처리 과정의 주요 단계를 설명한다. 간단히, PCK 또는 SD 쥐에서 신장 건강이 아닌 다이얼 세관 또는 낭종에서 하나 덕트를 수집 상피 단일 층의 수동 분리를 위해 사용된다. 여기에서 우리는 4-16 주 된 PCK 쥐 10,13에서 신장을 공부했다. 1. 신장 낭종과 연결 세관 (CNT) /의 분리 수집 덕트 (CD) 세그먼트 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. 동물은 계속적으로 적절한 제작을 위해 모니터링되어야마취의 VEL. 안정적인 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 개복술을 수행하고 복부 대동맥 (17)를 통해 인산염 완충 식염수 (PBS)와 신장을 세척하십시오. <ol><li> 폴리에틸렌 튜브 카테터 (PE50)을 준비하고 PBS로 가득 주사기 펌프에 연결합니다. 측면 및 장간막과 복강 동맥 분기와 하행 대동맥에 액세스하려면 면봉으로 복부 장기를 이동하는 측면에서 복부에 걸쳐 가로 복부 절개를 한 후, 원격 교육 알바를 따라 피부와 복부 벽을 잘라. 자신의 건조를 방지하기 위해 추가 과정에서 따뜻한 식염수와 내부 장기를 적셔. </li><li> 하나 장간막과 복강 동맥 주위에 합자 (# 1)과 다른 합자 (# 2) 다이어프램에서 대동맥 주위 (넥타이를하지 않는)을 놓습니다. 조심스럽게 분리. 얇은 집게로 주위 결합 조직을 해부하고 두 합자를 배치 무디게하여 abdominalis ~ 3왼쪽 신장 동맥 아래 MM (# 3)과 장골 동맥의 분기점 위 (# 4). </li><li> 합자 # 4 타이 왼쪽 신장 동맥과 합자 # 3 사이의 대동맥 주위 혈관 클램프를 연결합니다. 단단히 카테터를 해결하기 위해 합자 # 3를 사용, 클램프 및 대동맥을 카테 테르를 꽂다하는 합자 # 4 사이에 절개를합니다. </li><li> 클램프를 풀고 혈액 펄스가 올바른 설치를 위해 카테터에 볼 수 있는지 확인하십시오. 6 mL의 속도로 관류 시작 / 분, 합자 # 1, # 2를 묶어, 좌측 신장의 혈관을 절단. 장기가 완전히 희게 될 때까지 1 ~ 2 분 동안 세척을 계속합니다. </li><li> 가위 신장 혈관, 요도 주변 결합과 지방 조직을 절단하는 것은 신장을 수집. 그리고 신장 캡슐에서 짧은 눈물을하고이를 디 캡슐하기 위해 신장을 떼어. 얼음처럼 차가운 PBS로 신장을 놓습니다. 안락사는 개흉술에 의해 확인된다. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 코팅 5 × 5mm 커버 유리 칩을 준비합니다. 커버 GLA를 잘라다이아몬드 연필과 장소 각 유리 칩에 0.01 % 멸균 여과 폴리 -L- 라이신 솔루션의 약 20 μL와 SS. 생리 및 해부 용 시계 포셉 두 쌍을 준비합니다. </li><li> 1-2mm 두께 ~의 조각으로 정면 평면을 따라 면도날과 신장을 잘라. 실체 현미경에서 조각 중 하나를 놓습니다. 조직의 분리 빙냉 염수에서 수행되어야한다. </li><li> 둥근 모양의 캐비티 (그림 2A)와 같은 실체 현미경 하에서 낭종을 찾습니다; 그 벽은 자주 증식 혈관의 저명한 네트워크를 포함하고있다. 사용 뾰족한 집게 단층 영역을 얻기 위해 가능한 한 얇은 낭종 내부 상피층 해부. 폴리 -L- 라이신으로 덮여 유리 칩에 연결합니다. 스티커 폴리 -L- 라이신 표면은 연구자가 단단히 유리의 내부 낭종 층을 배치 할 수 있습니다. 피펫 (그림 2B)에 대한 액세스를 제공하기 위해 혀끝의면을 위로하여 낭종을 노출. </li><li> PCK 또는 SD 쥐 아이를 사용하여비 팽창 된 탄소 나노 튜브 / CCDsegments 18 ~ 21의 분리를위한 유두를 포함 네이 중앙 조각. 참고 : 유두 조직이 피질 이상과 집게로 유두 관 밴드를 잡고 슬라이스가 얇은 분야로 절단 할 수있다 축 반경 방향을 따라 찢어보다 내구성이 있습니다. 개별 세관은 볼 수 있으며 커버 유리 칩 상에 배치 될 인출 할 수있다. </li><li> , 분기점으로 근위 세뇨관과 큰 눈에 띄게 보이는 세포 (그림 2C)보다 높은 투명성을 탄소 나노 튜브 / CCD 세분을 확인하십시오. 마이크로 피펫을 구동하기에 적합한 미세 조작기를 구비 한 현미경을 첨부 tubules와 커버 유리 칩을 배치했다. 유리 가장자리를 선명 가능한 Micropipette에게 분할 오픈 세관를 사용하여 연결하면 (그림 2D) 혀끝의 표면에 액세스 할 수 있도록합니다. </li></ol> 2. 단일 채널 패치 클램프 전기 생리학 <ol><li> 욕 용액 패치 - 클램프 챔버를 채우고 커버 유리 칩을 전송할실에 격리 된 조직과. 패치 클램프 Micropipette과 신뢰성에 셀 (세포 부착) 측정을 위해 7 ~ 10 MΩ의 저항이 있는지 확인합니다. </li><li> 세포 부착 측정을 위해 20 배 증폭기 이득 비율을 설정하고 여덟 폴 베셀 필터가 300 Hz에서 전류를 저역 통과. ENAC 채널 모니터링의 경우, 밀리미터에서 목욕 솔루션, 사용 : 150의 NaCl, CaCl2를 1, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4); 피펫 : (140)의 LiCl, 2의 MgCl 2, 10 HEPES (PH 7.4). </li><li> 세포 부착 모드 (10)에 기존의 패치 클램프 실험을 실시한다. 상피 단층의 셀을 선택하고 혀끝 막에 피펫을 접근. 부드러운 흡입을 적용하여 피펫 및 세포막 사이에 고 저항 시일을 형성한다. 고 저항 기가 옴 시일이 형성되면, 유지 전위에서 갭이없는 프로토콜은 관심 채널의 모니터링 활동을 시작한다. </li><li> 기가의 저장 간격이없는 단일 채널 현재 데이터이후 분석을위한 옴 씰. 일반적으로 패치 - 클램프 (18)로 공급되는 셋업 소프트웨어 패키지를 사용하여 상기 채널 이벤트를 분석. 채널의 평균 열린 확률 N이 패치 P O 활성 채널의 개수를 의미 여기서 NPO 같은 채널 활성을 계산한다. 참고 : 30 분 동안 패치 클램프 실험에 고립 된 낭종 또는 세관을 사용합니다. </li></ol> 상피 세포에서 세포 내 칼슘 농도의 3 비례 표면 형광 측정 <ol><li> DMSO에 용해 5 밀리미터의 Fura - 오전 2시을 사용합니다. 각각 500 μL 원뿔 튜브로 나누어지는 원액 (약 10 μL). 최대 6 개월 -20 ℃에서 냉장고에 빛과 상점에서 보호합니다. </li><li> PSS에 30 ~ 40 분 동안 고립 된 낭종 및 분할 오픈 세관을 품어 (MM의 : (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2의 pH 7.35에서 10 HEPES) 5 μM의 Fura-2 오전 염료 0.0을 포함5 % 플루로 닉 산은 아세 톡시 메틸 에스테르를 분산 도움이됩니다. 이를 위해, 로딩 칵테일을 함유하는 3.5 cm 접시 장소 조직, 빛으로부터 보호하고, 실온에서 천천히 진탕 배양한다. </li><li> 부화 후 PSS를 청소하고 더​​ 표면 형광 이미징을 수행하기 위해 현미경으로 조직을 배치하는 미디어를 포함하는의 Fura-2 오전 변경합니다. </li><li> CCD 카메라와 필터 휠을 갖추고 안정적​​인 광원 (단색화 장치)를 켜고 (각 필터의​​ 위치는 필터가 호출 될 때마다 선택된 자체 감쇠 레벨과 연관 될 수있다). </li><li> 밝은 분야에서 조직을 찾을 수 있습니다. 형광 신호의 검출에 전환 신호의 포화를 피하기 위해 감광 필터 및 램프 전력을 이용하여, 광원의 강도를 조정한다. </li><li> 0.125 Hz의 이상의 주파수 380분의 340 nm에서 비율 계량 여기에 조직 샘플에서의 Fura-2 오전 형광을 모니터링합니다. 적절한 resolu위한 40 × / NA 1.3 또는 유사한는 대물 렌즈를 사용하여기 이미지입니다. </li><li> 화상 처리 및 계산 이미지 시퀀스를 가져. 채널을 분할하고 hyperstack 그레이 스케일 모드를 사용하십시오. 여러 관심 지역 (단일 낭종 세포 또는 낭성 조직의 선택 영역)를 선택하고 원하는 데이터 분석 소프트웨어로 각 채널 (340 및 380 ㎚)에 대한 강도 값을 계산; 각 데이터 포인트에서 빼기 배경 강도 값. </li><li> 각 시점의 Fura-들어 오전 2시 340-380 채널의 세기의 비율을 계산한다. 플롯 분산 / 각 지역의 칼슘 과도의 라인 포인트 - 시간의 변화와 계산 평균 / SE 값. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

우리는 ARPKD의 쥐의 유전자 모델에서 파생 된 담낭 상피 단층 여기에 기존의 패치 클램프 기술과 표면 형광 칼슘 이미징의 응용 프로그램을 설명했다. 프로토콜은 가장 관심 낭종 (프로토콜 부의 단계 1.5)의 단리 및 전기 생리 학적 연구에 지불되어야하는 세 단계로 구성된다. 이러한 주요 절차는 광범위한 훈련과 인내를 필요로하고, 독자는 한 번에 좌절해서는 안됩니다. 우선, 가장 관심 낭종 단층의 절연 처리를 기울여야한다. 준비의이 부분은 세포의 가시성 중요하다 유리 칩의 표본과도 첨부의 두께가 상당히 매뉴얼 기술과 영향 추가 작업을 필요로한다. 격리 된 낭종 벽의 두께는 시편의 다른 부분에서 변화, 그것은 법과 편리 큰 단층 지역에 큰 낭종에 집중하는 것이 좋습니다K. 시편을 청소 도움이 단층에 액세스하려면, 주변 조직은 실체 현미경에서 집게로 벗겨해야합니다. 이는 기술 분야의 상당한 깊이 절개 동안 다양한 크기의 객체를 수용하기 위해 다양한 배율을 변경하는 능력을 특징으...

이온 채널은 세포의 성장과 분화를 포함하여 많은 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 상 염색체 우성과 열성 다낭성 신장 질환 (각각 ADPKD과 ARPKD는) 관 상피 세포 기원의 신 유체로 채워진 낭종의 개발에 의해 특징 유전 질환이다. ADPKD는 polycystins 1 세포 증식 및 분화의 조절에 관여 2, 막 단백질을 코딩 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 발생된다. 그 자체로 또는 PKD1과 복잡한 PKD2 또한 칼슘 -permeable 양이온 채널 1로 작동합니다. PKHD1 유전자 부호화 fibrocystin (세뇨관 및 / 또는 상피의 극성의 유지에 관여 섬모 수용체 - 관련 단백질과 같은)의 돌연변이는 ARPKD 2 유전 자극이다. 낭종의 성장은 복잡한 현상을 방해 확산 3,4, 혈관 신생 (5), 탈분화 및 극성의 손실을 동반한다관 모양의 세포 6-8의 성만. 담낭 상피 세포에 결함이 재 흡수와 분비 증강은 루멘과 낭종 확장 ​​9,10 유체 축적에 기여한다. 손상된 흐름 의존성 [Ca를 2+] I 시그널링도 PKD 11-15 중 cystogenesis 연결되었다. 여기서, 우리는 하나의 채널 활동 및 PCK 래트로부터 단리 낭성 상피 세포 단층의 칼슘 농도의 패치 클램프 측정하기에 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 성공적으로 상피 나 + 채널 (ENAC) 10의 활동의 특성을 우리가 적용하고 [칼슘 2 +] 나는 칼슘 -permeable TRPV4 및 퓨린 신호 캐스케이드 (13)에 의해 유도되는 과정을 의존성. 이러한 연구에서 우리는 PCK 래트, PKHD1 유전자의 자연 돌연변이에 의한 ARPKD의 모델을 사용 하였다. PCK 변형은 originall의했다스프 라그 - 돌리 (SD) 래트 16함으로써 SD 래트 PCK 균주와 비교를위한 적절한 제어로 사용되는 Y로부터 유도. 그 결과, 동일한 PCK 래트로부터 단리 SD 래트 네프론 세그먼트 및 비 팽창 된 포집 관 모두 낭성 상피 실험 두 가지 비교 군으로 사용할 수.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68&nbsp;</td><td>용액</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>라이트 소스</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda</td><td>XL은 셔터/필터 휠 드라이버가 통합된</td></tr><tr><td>중립 밀도 필터</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp; &nbsp; 오일</td></tr><tr><td>카메라</td><td>Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&nbsp; 현미경 (반전)</td><td></td><td>Nikon Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 연필</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>이미지 획득 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td> <td>ND 유틸리티 플러그인을 사용하면 기본 Nikon Instruments .nd2 형식</td></tr><tr><td>녹음/관류 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템의</td> <td>이미지를 가져올 수 있습니다.분자 장치</td><td>Digidata 1440A</td><td>축삭 Digidata&reg; 시스템</td></tr><tr><td>로우 패스 필터</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>LPF-8</td><td>8 극 베셀</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>세계 정밀 기기</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기 Co</td><td>P-97</td><td>화염 / 갈색 형 마이크로 피펫 풀러</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>일본</td></tr><tr><td>전동 마이크로 매니퓰레이터</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>미세 진동 절연 테이블</td><td>TMC</td><td></td>, <td>패러데이 케이지가 장착된</td></tr><tr><td>다채널 밸브 관류 시스템</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>녹음/관류 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 수술 테이블&nbsp;</td><td>설치류용</td> <td>MCW 코어</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프 기반 관류 시스템</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane 마취</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a>911103</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다른 기본 시약</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 pkd 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

다낭성 신장 질환 중 낭종 개시 및 확장은 관 모양의 세포 증식, 내강 유체 축적과 세포 외 기질 형성에 이상을 특징으로하는 복잡한 과정이다. 이온 채널 및 세포 내 칼슘 신호 전달의 활성은 관상 상피의 기능을 결정하는 중요한 생리적 파라미터이다. 우리는 갓 신장 낭종 분리 상피 단층 세포 내 칼슘 수준의 패치 - 클램프 기법 및 등록이 이온 채널 활성을 실시간으로 관찰하기에 적합한 방법을 개발 하였다. PCK 래트, 염색체 열성 다낭성 신장 질환 (ARPKD)의 유전 적 모델은, 이온 채널 및 칼슘 플럭스의 생체 외 분석을 위해 여기에 사용 하였다. 여기에 설명하는 하나의 채널 활동 및 세포 내 칼슘 역학을 낭성 단일 층 및 PCK 또는 일반 스프 라그 돌리 (SD) 쥐에서 비 넓혀 세관을 분리하고 모니터링하도록 설계 자세한 단계별 절차입니다.이 방법은 효소 처리를 필요로 갓 격리 상피 단층의 기본 설정에서 분석이 가능하지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 칼슘의 변화에​​ 매우 민감하고 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성한다. 마지막으로, 고립 된 낭성 상피 더 항체 또는 염료, 각종 생화학 적 분석을위한 차 문화의 준비 및 정제 염색에 사용할 수 있습니다.

cystogenesis 잠재적 ENAC 개입은 ARPKD 뮤린 모델 및 조직 배양 물에서 26-28 22-25 PKD 진행 비정상적인 나트륨 재 흡수에서 시그널링 중단 표피 성장 인자 (EGF)를 관찰 여러 연구에 의해 입증되었다. 예를 들어,은 등 Veizis. 아밀로 라이드 - 민감성 나트륨 + 흡수는 ARPKD (29)의 비 orthologous BPK 마우스 모델에서 CD 세포에서 감소되는 것으로 나타났다. 우리는 최근 낭종에 손상 나트륨과 수분 재 흡수가 cystogenesis 10 악화에 중요한 요소임을 보여 주었다. 특히, 우리는 전기 생리 및 면역 조직 화학적 분석을 고용 낭종이 무딘 나트륨 재 흡수를 발휘하는 것으로 나타났습니다. 약리학 적 접근 방식은 선택적 ENAC 봉쇄가 현저하게 낭종 진행 (10)을 악화 것을 보여 주었다. 우리는 추가로 O...

신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

본 절차의 전반적인 목적은 다낭성 신질환 설치류 모델에서 갓 분리한 낭종 단층의 단일 채널 활성을 기록하고 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 복부 대동맥을 통해 PCK rec 신장을 세척하여 신장 조직에서 혈액을 제거합니다. 두 번째 단계는 낭종의 상피 단층을 분리하는 것입니다.다음으로, 분리된 단층 세포층을 상피 세포 정단막의 이온 채널에 대한 일반적인 패치 클램프 기록에 사용할 수 있습니다. 분리된 조직은 칼슘 염료를 로딩하는 데에도 사용할 수 있으며, 이를 통해 상피 세포 내의 세포 내 칼슘 농도 변화를 정량화할 수 있습니다.낭종의 천연 환경에서 측정된 이러한 매개변수들을 건강한 세뇨관과 비교함으로써 낭종 형성 과정을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신장 낭종 내의 chi 채널 활성과 칼슘 유입을 연구할 수 있다는 점입니다. 이러한 분석은 신선하게 분리된 조직으로부터 얻은 생리학적으로 유의미한 데이터를 제공합니다.이러한 접근 방식을 통해, 갓 분리한 상피 세포에서 단일 채널 활성을 모니터링할 수 있습니다. 이 방법은 패치 클램프 기법의 다양한 변형을 사용하여 철 채널의 거동을 정밀하게 특성화할 수 있다는 점에서 독특합니다. 우리는 낭성 및 건강한 튜브에서 다양한 약물에 대한 채널의 반응을 테스트할 수 있습니다.신선하게 분리된 낭종 단층은 세포 내 칼슘 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 낭종 세포의 세포 내 칼슘 항상성에 대한 약리학적 스크리닝 및 기능 연구를 가능하게 하며, 이는 다낭성 신질환 예방을 위한 새로운 치료법을 발견하는 데 중요한 수단이 됩니다. 혈액 제거 과정에서는 신장에서 혈액을 제거하는 데 사용되는 외과적 접근법이 제시될 것입니다.먼저 신장과 낭종의 분리 절차를 보여드리겠습니다. 마취된 쥐의 복부 대동맥을 통해 PBS로 신장을 세척하며 개복 수술로 이 절차를 시작하십시오. 이를 위해 PBS가 채워진 시린지 펌프에 폴리에틸렌 튜브 카테터를 연결하십시오.복부 중앙선을 따라 피부와 복벽을 절개하고, 면봉을 사용하여 복강 내 장기들을 밀어내어 분지하는 장간막 동맥과 복강 동맥이 포함된 하행 대동맥에 접근합니다. 다음으로 첫 번째 결찰사를 장간막 동맥과 복강 동맥 주위에 배치하고, 두 번째 결찰사를 횡격막 아래의 대동맥 주위에 배치합니다.포셉을 사용하여 주변 결합 조직을 둔하게 박리함으로써 대동맥 ADOS를 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 세 번째 결찰사를 왼쪽 신동맥에서 약 3mm 아래에 배치하고, 네 번째 결찰사를 장골동맥 분기점 위에 배치합니다. 네 번째 결찰사를 묶고, 왼쪽 신동맥과 세 번째 결찰사 사이의 대동맥에 혈관 클램프를 장착합니다.대동맥에 카테터를 삽입하기 위해 클램프와 네 번째 결찰사 사이를 절개합니다. 그런 다음 세 번째 결찰사를 사용하여 카테터를 단단히 고정합니다. 이제 클램프를 제거합니다.카테터에서 혈액 맥동이 보이는지 확인하여 적절하게 설치되었는지 확인하십시오. 그런 다음 관류를 시작하고 첫 번째와 두 번째 결찰을 수행합니다. 그 후, 압력을 낮추기 위해 좌측 신정맥을 빠르게 절단하십시오.장기가 완전히 하얗게 변할 때까지 1~2분 동안 계속 세척하십시오. 그 후, 신장 혈관, 요도 및 주변 결합 조직과 지방 조직을 절단하십시오. 신장을 적출하려면 신장 캡슐에 짧은 절개선을 내어 신장을 벗겨내어 감싸십시오.그런 다음 신장을 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 다음으로, poly L lysine이 코팅된 5 by 5 millimeter 및 25 by 25 millimeter 크기의 커버 글라스 칩을 준비합니다.면도날을 사용하여 신장을 전두면을 따라 1~2mm 두께의 절편으로 자릅니다. 그런 다음 절편 하나를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 미세 팁 포셉을 사용하여 원형의 공동 형태로 나타나는 낭종의 위치를 찾습니다.단층 영역을 확보하기 위해 낭종의 내부 상피층을 가능한 한 얇게 박리합니다. 그 후, 폴리라이신이 코팅된 유리 칩에 부착하여 낭종의 정단면이 위를 향하도록 노출시킵니다. 전기생리학 측정을 위한 피펫 접근이 가능하도록 패치 클램프 챔버를 배양액으로 채웁니다. 그런 다음, 조직이 분리된 커버글라스 칩을 챔버로 옮깁니다.상피 단층에서 세포 하나를 선택하고 패치 파이펫으로 전형적인 세포막에 접근합니다. 그 후, cell-attached 모드에서 일반적인 패치 클램프 실험을 수행합니다. 이 과정에서, 분리된 낭종과 절단된 세뇨관을 PSS가 담긴 3.5 cm 디시에 넣고, 아세틸콜린 에스테라제 분산을 돕기 위해 5 µM flu, 8 HD 및 0.05% onic acid를 첨가합니다.그 다음 샘플을 빛으로부터 차단하고 실온의 저속 쉐이커에서 30분에서 40분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 깨끗한 PSS로 배양액을 씻어냅니다. 그 후 조직을 공초점 현미경 아래에 두고 형광 이미징을 추가로 수행합니다.공초점 획득 소프트웨어를 켭니다. 이어서 아르곤 레이저를 488 nm의 여기 파장으로 켜고, 방출 파장을 520 nm에서 25 nm 범위로 조정합니다. 그 후 명시야(bright field)에서 조직의 위치를 찾습니다.조직 샘플에서 flu oh eight H 형광을 0.25 Hz 이상의 빈도로 모니터링하십시오. TP 또는 기타 약리학적 조절제를 적용하여 세포 내 칼슘 농도의 증가를 유도합니다. 여기 제시된 것은 12주 동안 벤조일 및 음용수를 처리한 16주령 PCK 쥐에서 갓 분리한 낭종의 세포 부착 패치(cell attached patches)에서 측정한 상피성 나트륨 통로 활성의 대표적인 전류 흔적입니다.점선은 각각의 현재 상태를 나타내며, C와 op n은 각각 닫힌 상태와 열린 상태를 의미합니다. 이 그래프는 관찰된 상피성 나트륨 통로 활성을 요약한 것이며, 상피성 나트륨 통로의 선택적 억제제인 benzoyl이 상피성 나트륨 통로 활성을 유의하게 감소시켰음을 보여줍니다. 이 비디오는 10 µM ATP를 처리하기 전과 후의 Fluo-8 H가 로딩된 낭성 단층을 보여줍니다. ATP에 반응하여 세포 내 칼슘 농도가 상승할 때 녹색 형광 신호 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 그래프는 ATP가 세포 내 칼슘 수치에 미치는 영향을 요약한 것입니다.PCK 쥐의 단층 세포에 TP를 처리하면 세포 내 칼슘 수치가 급격히 증가하며, 이는 2~3분 이내에 기저 수준으로 돌아옵니다. 이 기술은 낭성 신장 내의 칼슘 플럭스 및 이온 채널 활성 변화를 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. PCK 쥐에서 세포 나트륨 채널의 활성과 칼슘 유입을 특성화하는 것 외에도, 이 접근 방식은 다양한 AR 및 A-D-P-K-D 모델의 다른 이온 채널을 분석하는 데 사용될 수 있습니다.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

이 비디오에서는, 우리는 찬란 태그 PKCS을 사용하여 살아있는 세포에서 PKC translocation의 시각화를 보여줍니다.

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

이 비디오에서는 형광 리포터와 융합된 광 의존성 이온 채널 단백질을 발현하는 배아 신장 세포 배양이 이온 이동에 대한 빛의 영향을 보여줍니다. 전체 세포 패치 클램프는 이온의 움직임을 모니터링하는 데 사용됩니다.

광유전학적 전기생리학: 빛에 의존하는 이온 채널을 가진 세포의 기록

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

podocytes 내 세포 내 칼슘 수치의 변화는 사구체의 여과 기능을 제어하는 가장 중요한 수단 중 하나입니다. 여기에서는 갓 분리된 사구체의 podocytes에서 실시간 칼슘 처리 및 단일 이온 채널 활성을 검출할 수 있는 high-throughput 접근법에 대해 설명합니다.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

유기 반도체 폴리머의 사용을 기반으로 가시광선으로 체외 세포 배양 전기 활성을 자극하는 방법이 설명됩니다.

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

이 기사에서는 HEK293 세포를 사용한 전기생리학적 전체 세포 패치 클램프 기록으로 채널로돕신의 이온 선택도를 측정하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 음이온 선택성 채널로돕신의 염화물 선택성을 조사하기 위한 실험 절차를 설명합니다. 그러나 이 절차는 뚜렷한 선택성을 가진 다른 채널로돕신으로 이전할 수 있습니다.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

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부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

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이 프로토콜의 목표는 진동 절면을 사용하여 마우스 신장 골반의 그대로 심박 동기 영역을 분리하는 것입니다. 이러한 섹션은 시투 Ca2+ 이미징에서G박 조정기 세포 및 진동 성 슬라이스의 다른 중간 세포의 일시적인 특성을 해명하는 데 사용할 수 있습니다.

진동 및 이미징 라이브, 진동 절제에 의해 마우스 신장 골반의 그대로 페이스 메이커 영역

배우세요 패치 클램프와 라이브 형광 현미경을 사용하여 쥐 다낭성 신장 질환 모델에서 고립된 낭포 상피 세포의 이온 채널 활성과 세포내 칼슘 농도 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 신장 생리학 및 질병 병리 연구에 중요한 데이터를 제공합니다.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

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