방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해 말라리아 원충

인간 microRNA는 숙주 적혈구에서 Plasmodium falciparum 기생충으로 전위합니다. 여기에서는 합성 microRNA를 숙주 적혈구로 transfection하고 P. falciparum에서 모든 RNA를 분리하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 또한 이 논문에서는 기생충 전사체의 리보솜 점유 및 번역 가능성을 결정하기 위해 P. falciparum에서 폴리솜 분리 방법을 자세히 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 plasmodium falciparum 전사체의 전사 후 유전자 조절에서 적혈구 microRNA의 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 숙주 또는 기생충 small RNA와의 RNA 접합 이벤트가 융합 mRNA의 번역 가능성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 말라리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 풀에서 전체 RNA와 작은 RNA를 함께 포착할 수 있는 능력으로, 하나의 세포에 작은 RNA와 융합 RNA가 존재함을 보여줍니다.

또한 이 절차는 폴리솜 프로파일링을 사용하여 작은 RNA가 융합 mRNA 산물의 번역에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 시작하기 위해, 완전한 말라리아 배지에 300 마이크로리터의 적혈구를 5분 동안 800배 G로 주입하여 transfection을 설정합니다. RPMI 배지로 적혈구를 두 번 세척하고 50% 헤마토크릿에서 완전한 사이토 혼합물로 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 세포를 electroporation vete로 옮기고 10 μg의 DYS th 비오틴 접합 마이크로 RNA 또는 접합되지 않은 음성 대조군 마이크로 RNA를 첨가합니다. 세포를 전기천공하려면 수맥을 전기천공된 곳에 놓고 단일 펄스를 전달합니다. 그런 다음 세포를 플레이트에 삽입하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 4시간 후에 plasmodium falciparum으로 감염시킵니다.

그런 다음 50마이크로리터의 포장, 벗겨낸 avid 및 비드를 마이크로센터 튜브에 있는 10마이크로그램의 기생충 RNA에 넣고 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전하면서 튜브를 배양합니다. 스트립 davan과 비드를 800 배 G에서 30 초 동안 원심 분리 한 다음 1-1000 희석된 RNA 억제제를 포함하는 500 마이크로 리터의 RNP 버퍼로 펠릿을 세척합니다. 다음으로 Resus에 의해 비드에서 RNA를 용리하여 200마이크로리터의 RNA에 현탁시킵니다.

과량의 비오틴을 함유한 용출 완충액을 포집합니다. 구슬을 섭씨 4도에서 밤새 교대로 배양합니다. 그런 다음 800배 G에서 30초 동안 비드를 원심분리하고 상층액 RNA를 수집합니다.

과도한 비오틴으로 용리하고 최소한의 연쇄상구균 avid 및 비드를 사용하여 적절한 특이적 용리를 보장하는 것이 중요합니다. 이것은 백그라운드 RNA 농축을 감소시킵니다. 마지막으로, polysome 분리를 시작하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정량적 R-T-P-C-R에 의해 P falciparum 전사체 및 마이크로 RNA 농축 정도를 결정합니다.

먼저 50% 자당 용액 5ml를 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 50% 용액 위에 15% 자당 용액 5ml를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 다음으로, 그라디언트 튜브를 퍼필로 밀봉하고 벤치 탑에 수평으로 놓일 때까지 튜브를 조심스럽게 기울입니다.

튜브가 굴러가지 않도록 안정적인 위치에 있는지 확인하십시오. 그라디언트가 형성될 수 있도록 튜브를 최소 2시간 동안 이 위치에 유지하십시오. 그 동안, 약 100 밀리리터의 플라스모듐 감염 혈액의 비동기 배양액을 3-5%persit에서 수집합니다.

그런 다음 2 밀리몰 사이클로, 하이데를 포함하는 10 밀리리터의 배양 배지를 첨가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 500배 G에서 7분 동안 원심분리한 다음 200마이크로몰 사이클로 하이드 레서스를 함유한 80밀리리터의 PBS로 두 번 세척합니다. 펠릿을 시클로헥시미드로 PBS에 현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.

세포를 펠렛화하고 상층액을 제거하여 펠릿 부피를 추정합니다. 그런 다음 4.25 밀리리터의 최종 용해량으로 세포를 용해하고 완충 및 회전과 함께 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양합니다. 폴리솜 프로파일링과 말라리아를 유발하는 종에 대한 이전의 시도는 폰트 용해가 폴리솜을 모노 구역으로 분해하기 때문에 대부분 모노를 드러냈습니다.

여기에서 우리는 적혈구 및 기생충을 동시에 lysis plasmodium falciparum의 polysome 본을 보존하기 위하여 lysis 완충액을 이용하고, 마이크로 분리기 관에 lysate를 옮기고 16, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 000 시간 G에 그 후에 회전시킨다. 별도의 사전 냉각된 5ml 초원심분리기 튜브에 27게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 1.25ml의 차가운 0.5몰 자당 쿠션 용액을 추가합니다. 자당 쿠션 위에 3.75ml의 용해물 상층액을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.

섭씨 4도에서 366, 000회 G로 146분 동안 샘플을 원심분리합니다. 이 시간 동안 자당이 제거된 초원심분리기 튜브를 천천히 수직 위치로 되돌리고 최소 15분 동안 얼음 위에 그대로 두십시오. 초원심분리기에서 용해물을 제거한 후 15ml 원추형 2개에 상등액을 조심스럽게 수집합니다.

상등액을 섭씨 영하 80도에서 보관하여 리보솜에 결합되지 않은 RNA 분획을 보존합니다. 다음으로, 리보솜 펠릿을 Resus 현탁액 500 마이크로 리터에 재현탁 시키고, 16, 섭씨 4도에서 10 분 동안 000 회 G로 샘플을 혼합 원심 분리하기 위해 5 분 동안 피펫팅하여 완충합니다. 불용성 물질을 제거하려면 그래디언트를 방해하지 않도록 그래디언트 튜브의 파라바 씰을 조심스럽게 제거한 다음 주사기와 27 게이지 바늘로 리보솜 현탁액을 위에 겹쳐 놓습니다.

섭씨 4도에서 180분 동안 G를 200, 000배 사용하여 튜브를 원심분리한 후 분획기에 로드할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 그래디언트를 보관합니다. 빈 초원심분리기 튜브를 그래디언트 분획기에 넣고 RNA free water로 5분 동안 시스템을 세척합니다. 세탁하는 동안 254나노미터의 UV 흡광도 검출기의 감도를 0.2로 설정합니다.

신호에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 다음으로, 물이 감지기를 통해 흐를 때 기준선 신호를 0으로 설정합니다. 집진기를 세척한 후 분획기를 통한 유체 흐름을 역전시켜 라인을 비운 다음 빈 초원심분리기 튜브를 제거합니다.

니들 장치에서 나올 때까지 FRACTIONATOR를 통해 60% 자당 용액을 실행합니다. 그런 다음 적재된 그라디언트 튜브를 적재 챔버 상단에 놓고 밀봉을 조입니다. 바늘로 튜브 바닥을 뚫습니다.

그런 다음 분획기의 유속을 12.5 x 10으로 재설정하고 마이크로 원심분리기 튜브에서 18초 분획을 수집합니다. 60% 슈크로스 용액의 순류 흐름을 시작하여 그래디언트 용액의 첫 번째 방울이 마이크로 원심분리기 튜브에 들어가기 전에 분획을 용리합니다. 254 나노미터 신호에서 흡광도의 수집과 실시간 녹음을 모두 시작합니다.

흡수 신호가 50 % 및 60 % 자당 용액의 계면에서 급격히 떨어지면 흐름과 기록을 중지하십시오. 그래디언트 분율은 섭씨 영하 80도에서 저장합니다. 그런 다음 60% 용액이 초원심분리기 튜브에서 비워질 때까지 유체 흐름을 역전시킵니다.

튜브를 제거하고 다음 그래디언트 분석을 시작합니다. 적혈구를 microRNA로 형질주입한 후 비오틴화된 마이크로 NA mRNA 하이브리드를 회수하면 PKAR 융합 전사체가 풍부해지는 것으로 나타났습니다. 모의 또는 관련이 없는 마이크로 RNA 형질주입은 PKAR 전사체를 농축하지 않았습니다.

데이터는 40 s 및 60 s 리보솜 소단위의 elucian 피크, DS 리보솜 및 표시된 수의 리보솜을 포함하는 polysome fractions를 보여줍니다. 리보솜은 적혈구 내부에 존재하는 PCI에서 분리된 전사체와 관련이 있었습니다. 북부 혈액 분석은 리보솜과 폴리솜이 18 S 및 28 SRNA와 관련이 있음을 보여주었습니다.

이 절차와 함께 microRNA MR의 존재를 추가로 검증하기 위해 R nase H 분해, 리보뉴클레아제 보호 분석 및 북부 블로팅과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. NA 융합. 이 동영상을 시청한 후에는 microRNA를 적혈구로 transfection하고 이후에 키메라 전사체를 포함한 총 RNA를 가진 작은 RNA를 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 폴리솜을 복구하여 리보솜 점유를 결정할 수 있어야 하며, 따라서 이러한 융합 전사체의 번역 가능성을 결정할 수 있어야 합니다.