Name: 약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 슬라이스 공동 배양 시스템을 사용하여 종양 미세 환경이 뇌종양 세포 성장에 미치는 영향을 연구하고 새로운 약물 치료법을 테스트하는 방법을.

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이 작업은 NIH(P01CA142536에서 RAS, T32CA009361에서 DPY)와 소아 저등급 성상세포종 재단의 보조금으로 지원됩니다.

<ol><li>Heddleston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+maintenance%3A+the+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment.</a> Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).</li>
<li>Sasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+pathway+activity+is+down-regulated+in+cultured+medulloblastoma+cells%3A+implications+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies.</a> Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).</li>
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<li>Duffau, H., Capelle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+brain+locations+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Preferential brain locations of low-grade gliomas.</a> Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).</li>
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<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70(2010).</li>
<li>Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+from+a+mitogenic+niche+promotes+cell-cycle+exit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit.</a> J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).</li>
<li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoglycan+interactions+with+Sonic+Hedgehog+specify+mitogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses.</a> Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-+dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 6, 6220(2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
</ol>

저자 중 누구도 경쟁하는 이해관계나 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

이 프로토콜은 뇌 종양 세포가 형광 표지 및 P6 마우스의 시상 뇌 부분에 도금 한 후 문화에 일주일 동안 모니터링 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 배양 분석은 종양 세포 수의 지역 미세 환경의 영향을 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 인간 종양의 성장에 대한 새로운 약물 치료의 효능을 측정하기위한 시스템으로 사용될 수있다. 이전의 연구는 신경 전구 증식 7,8에서 뇌 미세 환경의 역할을 평가하기 위해 동일한 전략을 이용했다. 뇌종양 세포 Organotypic 슬라이스 배양 9에 접종하는 상기 분석은 정상적인 세포 배양 조건에서 번식하기 어려운 인간 뇌종양 세포를 성장시키기위한 시스템을 제공한다. 이 절차의 하나의 중요한 측면은 슬라이스와 종양 세포의 건강 유지의 중요성이다. 슬라이스는 D시 버퍼에 앉아 시간의 길이이미징 동안 issection 및 실온에서는 슬라이스와 세포가 가능한 ...

최근 암 연구는 뇌종양의 다양한 유전 적 변이, 분자량 변화 및 ​​가능한 치료를 확인하는데 상당한 진보를 이루어왔다. 이 진행에도 불구하고, 뇌 종양은 성인과 어린이를위한 암 관련 사망의 상단 원인 중 하나 남아있다. 뇌 종양 연구에 제한 요인이 주 환자 샘플 및 세포주의 제한된 가용성 및 접근 실험 시스템의 고유 한 이기종 뇌 미세 복제의 어려움을들 수있다. 많은 뇌에 대해 시간이 아직 공지되지 않은 종양 세포를 유지하기 위해 필요한 조건을 종양이. 심지어 neurosphere를 같은 세포 현탁액에서 성장 될 수 뇌종양, 배양 조건은 종양 세포 1,2- 영향을 미칠 수있다. 실제로, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 또는 표피 성장 인자의 첨가는 증식을 유도 유전자 발현을 변경시킬 수 1 분화를 억제한다. 종양 세포의 성장을 그러한 다른 방법종양 세포의 동소 또는 피하 이종 이식을 통해 마우스에서 종양 증식으로 유용한 분석법하지만 이러한 주입 연구 될 수있는 종양 발생 (특히 저급 종양), 비용 및 종양 세포의 수와 시간 등의 요인에 의해 제한된다 . 인간 뇌종양 세포를 성장시키기위한 현재의 방법은 따라서 특정 유형의 종양을 유지 불충분하고, 종종 가깝게 모방 생체 내 종양 환경 안 인공 환경을 제공한다. 뇌종양의 독특한 유형의 뇌 내에서 고도의 전문 사항 성장 [3, 4]와이 종양의 성장을위한 별개의 미세 환경의 요구 조건을 반영하는 것 같다 [5]. 이 프로토콜은 통상의 배양 조건으로 전파하기 어려운 세포의 Organotypic 뇌 미세 환경에서 성장 될 수 신규 시스템을 기술 생체 내 종양 성장 조건을 모방한다. 이 정량 분석​​에서, 형광 표지뇌종양 세포 청소년 마우스 뇌의 Organotypic 슬라이스에 도금 시간에 걸쳐 모니터링된다. 이 분석은 종양 성장에 미세 환경의 영향을 조사하기 위해, 그리고 임상 적으로 뇌의 미세 환경에서 새로운 약물 요법을 테스트하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>포도</td>당 <td>인비트로겐</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>생명 기술</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>생명 기술</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>생명 기술</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>생명 </td><td></td> Neurobasal-A- Medium에서 페놀 레드 Invitrogen을 뺀 35050061 <td></td>기술</tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>12349015</tr><tr><td>저 융점 Agarose</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 배양 인서트&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Cm-DiI&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>EDU(라벨링 및 감지)&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>c10337</td><td></td></tr><tr><td>마이크로스피어&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>F-21010</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰&nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Nikon Eclipse ni C2si</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mm 커버 안경&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>64-0700 (CS-5R)</td><td></td></tr></tbody></table>

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

뇌종양은 암 관련 이환율 및 사망률의 주요 원인입니다. 이러한 암에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것은 이러한 종양의 많은 부분이 표준 배양 조건에서 쉽게 자라지 않기 때문에 어렵습니다. 무혈청 조건에서의 신경권 배양과 정형소 이종이식편은 유지할 수 있는 종양의 범위를 확장했습니다. 그러나 많은 유형의 뇌종양은 여전히 전파하거나 연구하기 어렵습니다. 이는 특히 유모세포성 성상세포종(pilocytic astrocytomas 및 medulloblastomas)과 같은 소아 뇌종양의 경우 더욱 그렇습니다. 이 프로토콜은 원발성 인간 뇌종양이 배양에서 배양될 수 있도록 하는 시스템을 설명합니다. 이 정량적 분석법은 종양 성장에 대한 미세환경의 영향을 조사하고 신약 요법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 형광 표지된 뇌종양 세포가 어린 쥐의 유기형 뇌 절편에서 자라는 시스템을 설명합니다. 약물 치료에 대한 종양 세포의 반응은 시간 경과에 따른 절편의 세포 수 변화를 분석하여 이 분석에서 연구할 수 있습니다. 또한 이 시스템은 일반적으로 뇌종양의 성장을 촉진하는 미세환경의 특성을 해결할 수 있습니다. 이 뇌종양 유기형 슬라이스 공동 배양 분석법은 뇌 미세환경 내에서 인간 종양 세포에 대한 신약을 테스트하기 위한 적절한 시스템을 제공합니다.

이 절 결과의 종류가 지역 미세 환경을 조사 할뿐만 아니라 새로운 치료법을 테스트 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 배양을 이용하여 예상 될 예시한다. 우리는 세이 조직으로서 조직, 뇌 종양 미세 환경을 복제 할 수 있도록 설계되어 슬라이스의 증식 상태는 (도 3)로 유지되는 것을 보여준다. 우리는 또한 시간이 지남에 따라 슬라이스 종양 세포 수의 증가는 부분적 뇌 조각 위에 미세 세포의 이동 (도 4)에 기인 할 수 있음을 입증한다. 우리는 또한 조각의 특정 지역에 대한 문화의 주 이상 세포 수의 배의 변화를 계산하여이 공동 문화는 정량적 인 분석으로 사용될 수 있음을 보여 주었다, 또는 전체 뇌 슬라이스 (그림 6) 복수의 예비 결과 종양 세포 유형의 종양 세포의 수의 공 초점 화상에 의해 정량화 될 수 있음을 보여 주었다세포만을 슬라이스로 20-50 ㎛의 깊이로 이동한다는 사실에 기인 200 μm의 두께 슬라이스. </...

많은 유형의 인간 뇌종양은 뇌 내의 특정 영역에 국한되어 있으며 배양에서 성장하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 종양 미세환경의 역할을 다루고 유기형 마우스 뇌 절편에서 자라는 형광 원발성 뇌종양 세포를 분석하여 신약 치료를 조사합니다.

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 형광 표지된 일차 인간 뇌종양 세포를 마우스 뇌 절편 공동 배양 시스템에서 성장시켜, 뇌 미세환경이 종양 세포 성장에 미치는 역할을 조사하고 새로운 잠재적 약물 치료법을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 어떤 뇌 영역이 종양 성장을 지원하는지, 그리고 잠재적으로 왜 특정 뇌 영역에서 뇌종양이 발생하는지와 같은 암 생물학 분야의 핵심 질문을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 세포 배양 조건에서는 성장하지 않는 인간 뇌종양 세포를 대상으로 새로운 약물 치료법을 테스트하는 시스템으로 활용할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 생후 6일 된 마우스의 코 부분을 잡아 머리를 고정하고, 두개골 후방에서 안와 방향으로 양측에 두 번 절개합니다. 조직 손상을 방지하기 위해 가위 끝을 두개골에 최대한 밀착시키십시오. 그런 다음 첫 번째 절개선과 두 번째 절개선을 가로질러 세 번째 절개를 수행합니다.그 후, 소형 스프링 가위를 사용하여 두개골을 조심스럽게 벗겨냅니다. 남은 두개골을 중앙선을 따라 절개합니다. 이어서 두개골을 벗겨내어 후각구(olfactory bulbs)를 노출시킵니다.해부 버퍼를 적신 평면 스파출러를 뇌 바닥과 두개골 기저부 사이에 삽입합니다. 그다음 뇌를 조심스럽게 제거하여 얼음 위에 놓인 해부 버퍼에 넣습니다. 이 과정에서 35 mm 정사각형 접시 2개를 얼음 위에 준비합니다.다음으로, 돔 형태가 만들어질 때까지 두 개의 디쉬에 3% 저융점 agros를 붓고 3분 동안 기다립니다. 3분 후, agros가 채워진 35 millimeter 디쉬의 가장자리에 뇌 조직 하나를 놓습니다. 그런 다음 이를 디쉬 중앙으로 이동시킵니다.두 번째 뇌에 대해 동일한 절차를 반복하고 10분 동안 대기합니다. 10분 후, P6 뇌가 포함된 각 중합된 aros 블록을 밀어내기 위해 aros와 디시 사이에 평평한 스패튤라를 삽입합니다. 다음으로, 가장자리가 최대한 직선이 되도록 주의하면서 각 aros 블록을 뇌 주변의 작은 정육면체 모양으로 다듬습니다.그 후, vibram 플레이트에 순간접착제를 두 줄로 도포합니다. 그런 다음 agros가 장착된 뇌들을 접착제 위에 나란히 조심스럽게 놓습니다. 시상면 절단을 위해서는 뇌들이 서로 정렬되어 있고 높이가 거의 동일한지 확인하십시오. 면도날을 agros에 고정된 뇌에 최대한 가깝게 배치하고, 면도날이 뇌 바로 위에 위

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 3D 공동 문화 시스템의 개발을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 막에 놓고 형광 표지된 인간 뇌종양 세포가 그 위에서 자랄 수 있도록 합니다. 시스템이 준비되면 이미징을 위해 염색됩니다.

Organotypic Slice 공동 배양 모델에서 뇌종양 확립

이 비디오는 교모세포종 조직에서 유기형 절편 배양의 생성 및 유지를 보여줍니다. 분리된 조직은 아가로스 매트릭스에 내장되고 얇은 절편은 비브라톰을 사용하여 얻습니다. 그런 다음 이러한 절편을 마이크로플레이트 내의 투과성 멤브레인 삽입물에 놓고 장기 유지 관리를 위해 슬라이스 배양 유지 매체에서 배양합니다.

인간 교모세포종 조직으로부터 Slice 배양 생성 및 유지

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

우리는 생성, 재배 및 organotypic 조각 murine 폐 종양에서 파생 된의 체계적인 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다. 우리는 또한 슬라이스 두께 대 한 최적화 하는 방법과 종양 조각 치료 약물 농도 선택 하는 방법을 설명 합니다.

설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

우리는 organotypic 종양 조직 조각에 있는 실시간 약 반응을 측정하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 여기에 설명된 실험 전략은 생체 내 조건에서 임상 또는 마우스 종양에서 유래한 조직 조각에 중고 처리량 약물 스크린을 수행하는 플랫폼을 제공한다.

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

이 프로토콜은 유기형 절편 배양(OTSC)의 준비에 대해 설명합니다. 이 기술은 온전한 다세포 조직의 체외 배양을 용이하게 합니다. OTSC는 다세포 환경에서 약물에 대한 각각의 반응을 테스트하는 데 즉시 사용할 수 있습니다.

원발성 췌장암 및 전이에서 종양 미세환경의 전임상 모델로서의 유기형 절편 배양

우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

여기에서는 유전자형-표현형 의존성을 조사하고 교모세포종 치료를 위한 잠재적 약물을 스크리닝하기 위해 실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드(LEGO)를 생성 및 활용하기 위한 포괄적인 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

배우세요 마우스 뇌 슬라이스 공동 배양 시스템을 사용하여 종양 미세 환경이 뇌종양 세포 성장에 미치는 영향을 연구하고 새로운 약물 치료법을 테스트하는 방법을.

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

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