2.8: 배아 줄기 세포 배양 및 분화

배아 줄기 세포 또는 ES 세포는 일반 성체 세포와 구별되는 여러 가지 독특한 특성을 가지고 있습니다. 따라서 과학자들은 이러한 특성을 유지하거나 활용하기 위해 특별한 배양 기술을 고안했습니다. 적절하게 배양되면 ES 세포는 무한정 분열하여 더 많은 세포를 만들 수 있습니다. 동시에, 배양 조건을 변경함으로써 ES 세포는 우리 몸에서 발견되는 거의 모든 세포 유형으로 분화하도록 지시 될 수 있습니다. ES 세포의 이러한 능력을 "다능성(pluripotency)"이라고 합니다.

이 비디오에서는 ES 세포를 배양하고 계대배양하여 고유한 특성을 유지하는 방법, ES 세포에서 분화를 유도하여 특정 세포 유형을 형성하는 방법, ES 세포 배양 및 분화 기술이 오늘날 연구자들에 의해 사용되고 개선되는 방법을 배우게 됩니다.

ES 세포 유지 절차를 자세히 설명하기 전에 먼저 ES 세포 분화를 방해하거나 유발하는 요인을 이해하는 것이 중요합니다. ES 세포가 다능성과 자가 재생이라는 고유한 특성을 유지하기 위해서는 자발적 분화를 억제하는 성장 배지의 특정 인자로 배양해야 합니다.

이것은 일반적으로 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEF)인 "공급기(feeders)"의 층에서 ES 세포를 배양함으로써 가장 일반적으로 수행됩니다. 공급세포는 ES 세포를 미분화 상태로 유지하는 데 도움이 되는 액티빈 A와 같은 특정 인자를 ES 세포에 "공급"합니다.

최근 과학자들은 ES 세포가 정의된 레시피에 필요한 요소를 첨가한 배지에서 성장하는 피더 없는 배양 방법도 개발했습니다. 이 접근 방식은 가변성을 줄이고 임상 적용의 전제 조건인 ES 세포 배양에서 비인간 구성 요소를 제거합니다.

ES 세포의 또 다른 특징은 자연적으로 군집이나 군체에서 자라며, 단일 세포, 특히 인간 ES 세포로 해리될 때 생존율이 낮은 경향이 있다는 것입니다. 그 결과, 인간 ES 세포를 통과시키려면 일반적으로 기계적인 "피킹(picking)"을 통해 세포를 온전한 덩어리로 유지해야 합니다.

ES 세포가 비부착 조건에서 성장하면 배아체(embryoid body, EB)로 알려진 3D 응집체를 형성하며, 여기서 ES 세포는 모든 다른 세포 유형으로 분화합니다. 배지에 특정 성장 인자를 추가하는 것과 같은 분화 조건을 변화시킴으로써, 과학자들은 ES 세포 분화를 특정 세포 유형으로 유도하는 방법을 개발하고 있습니다.

이제 ES 세포 유지 및 분화의 원리를 이해했으므로 MEF feeder에서 ES 세포를 배양하고 계대형성하는 방법을 살펴보겠습니다.

MEF는 초기 단계의 마우스 배아에서 얻은 다음 화학 물질이나 방사선에 의해 비활성화되어 더 이상 분열하는 것을 방지합니다. 비활성화된 MEF는 ES 세포 배양을 시작하기 최소 하루 전에 젤라틴화된 조직 배양 접시에 도금해야 합니다. 피더가 완전히 정착되면 ES 세포가 해동되어 플레이트에 파종됩니다.

앞으로 며칠 동안 ES 세포는 큰 군체로 자랄 것입니다. 식민지가 접촉하고 융합하기 시작하기 전에 ES 문화가 통과되어야 합니다. ES 세포의 형태를 관찰하여 분화의 징후를 보이고 있는지 확인해야 합니다. 미분화된 ES 군체는 일반적으로 잘 정의되고 균질하게 보이는 반면, 분화된 세포는 둔하고 불규칙한 모양의 "조약돌"처럼 보입니다.

콜로니가 70% 이상의 분화를 보이거나 희박한 경우, 미분화 콜로니를 기계적으로 잘라내어 새로운 피더 플레이트로 옮깁니다. 그렇지 않으면 분화된 영역이나 군체를 제거하고 전달을 진행하기만 하면 됩니다.

분화된 콜로니가 청소되면 콜라겐분해효소와 같은 단백질 분해 효소를 첨가하여 37에서 배양으로 플레이트에서 세포를 들어 올립니다. C를 적절한 시간 동안 사용합니다. 그런 다음 효소 반응을 중단하기 위해 새로운 ES 배지를 추가합니다. 콜로니는 플레이트에서 기계적으로 분리되어 원심분리기 튜브로 옮겨져 부드러운 피펫팅으로 원하는 크기로 분해됩니다. ES 세포는 원심분리에 의해 수집되고, ES 배지에 재현탁되고, 준비된 공급 플레이트에 도금됩니다.

ES 세포를 계대에 분포시키는 방법을 배운 후, ES 세포를 배아체로 분화하는 데 사용되는 보다 일반적인 기술 중 하나인 행잉 드롭(hanging drop) 방법을 살펴보겠습니다.

우선, ES 세포는 콜라겐분해효소(collagenase)와 같은 단백질 분해 효소(proteolytic enzymes)의 도움으로 분리되고, 계통 특이적 분화 인자(lineage-specific differentiation factor)를 포함하는 배지에서 원하는 농도로 희석됩니다. 그런 다음 ES 세포 현탁액은 박테리아 페트리 접시의 뚜껑에 방울로 쌓입니다. 뚜껑을 빠르게 뒤집어 접시에 놓으면 미디어 방울이 거꾸로 매달려 배아체가 발달할 수 있습니다.

약 2일 후, EB가 함유된 방울을 모아 추가 배양을 위해 비접착성 플레이트에 도말할 수 있습니다. 원하는 세포 계통에 대한 적절한 시점에서, 배아체는 추가 분화를 위해 젤라틴화된 부착 조직 배양 접시에 다시 도금됩니다.

지금까지 ES 세포를 배양하고 분화하는 기본 기법을 살펴보았으니, 이제 ES 세포가 특정 실험 요구에 어떻게 부합하는지 살펴보겠습니다.

앞서 언급했듯이 ES 세포는 서로 다른 배양 조건에서 특정 세포 유형으로 분화하도록 지시될 수 있습니다. 이 실험에서 과학자들은 인간의 ES 세포에서 운동 뉴런을 생성했습니다. 이것은 먼저 배아체를 신경 계통으로 향하게 하는 분화하는 요인을 추가하고, 그 다음에는 이 세포를 운동 뉴런으로 특이적으로 바꾸는 화학 물질과 도금 조건을 추가함으로써 이루어졌습니다. 연구가들은 이와 유사한 접근법을 사용하여 ES 세포를 리드미컬하게 박동하는 심장 근육 세포로 분화시키는 데 성공했다.

ES 세포를 분화하는 것은 배아가 자연적으로 발달할 때 발생하는 사건을 모방하기 때문에 초기 배아 발달의 생물학을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 연구되고 있는 현상 중 하나는 X염색체 불활성화(XCI)인데, 이는 암컷 포유류의 각 세포에서 두 개의 X염색체 중 하나가 침묵하는 중요한 과정입니다. EB 개발 과정에서 특정 RNA와 단백질의 분포를 시각화함으로써 과학자들은 XCI의 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 얻었습니다.

마지막으로, ES 세포 실험의 일관성과 효율성을 높이기 위해 과학자들은 ES 세포를 배양하는 더 나은 기술을 고안하기 위해 지속적으로 노력하고 있습니다. 한 가지 방법은 비집락형 단층 배양(non-colony type monolayer culturing, NCM)이라고 하는 단일 층에서 ES 세포를 성장시키는 것입니다.

인간 ES 세포는 3D 응집체로 성장하지 않을 때 불행한 경향이 있다는 것을 기억하십니까? 과학자들은 ROCK 억제제로 알려진 화학 물질이 해리된 ES 세포의 생존을 증가시켜 단일 세포 현탁액으로 계대배양하고 고밀도로 도금할 수 있음을 보여주었습니다. NCM 기술의 장점은 모든 세포가 배지의 성장 인자와 영양소에 더 균등하게 노출되어 배양 내 이질성을 줄이는 동시에 ES 세포를 대량으로 더 쉽게 성장시킬 수 있다는 것입니다.

배아 줄기 세포를 배양하고 분화하는 방법에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청하셨습니다. 이제 ES 세포를 미분화 상태로 유지하는 데 중요한 요인이 무엇인지, 그리고 ES 세포 다능성을 활용하여 접시에서 특정 세포 유형을 생성하는 방법을 알아야 합니다. 앞으로 과학자들은 재생 의학 응용 분야에 사용할 수 있는 특수 세포 유형을 생산하기 위해 보다 효율적이고 잘 정의된 배양 및 분화 조건을 개발하기 위해 노력할 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다!