식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

이 절차의 전반적인 목표는 침전물과 같은 복잡한 미생물 군집 샘플에서 박테리아 내생포자를 분리하는 것입니다.이 방법은 자연 샘플에서 내생포자의 존재와 풍부함에 대한 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이는 화학 물질과 열에 대한 내생포자와 식물 세포 간의 저항 차이를 기반으로 합니다. 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 내생포자를 비파괴하므로 배양, 정량화 및 대사 검사와 같은 다운스트림 실험에 사용할 수 있다는 것입니다.

우리는 내포자 형성 박테리아의 생태학에서 작동하도록 이 방법을 설계했지만, 포자가 유익하거나 해로울 수 있는 외생물학 또는 식품 산업과 같은 분야에서도 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액 및 장비를 준비한 후 UV 멸균 생물 안전 캐비닛 아래에서 에탄올 화염 금속 스쿱을 사용하여 미리 계량된 멸균 50ml 튜브에 3g의 침전물 샘플을 추가합니다. 멸균된 눈금이 매겨진 뷰렛을 사용하여 15ml의 멸균 여과된 1% 헥사메타인산나트륨 또는 SHMP 용액을 샘플에 첨가합니다.

액체 분산기 또는 균질화기 및 멸균 분산 로터를 사용하여 1분 동안 17, 500RPM에서 시료를 균질화합니다. 샘플을 2분 동안 그대로 두고 균질화를 반복합니다. 가장 무거운 입자가 가라앉을 때까지 샘플을 10분 동안 그대로 두십시오.

세포 바이오매스를 포함하는 상등액을 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 깨끗한 50ml 튜브로 옮깁니다. 침전된 펠릿에 또 다른 15ml의 SHMP 분취액을 추가하고 상층액을 수집하여 첫 번째 분취액과 결합하기 전에 균질화를 반복합니다. 20배 G에서 1분 동안 샘플을 원심분리하고 펠릿을 버리기 전에 상층액을 새 50ml 튜브로 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 따라 여과 장치와 진공 펌프가 준비되면 에탄올 화염을 사용하여 집게를 살균하고 여과 장치에 멸균 니트로셀룰로오스 멤브레인을 추가합니다. 방금 준비한 상층액 샘플의 절반을 멤브레인 여과 장치에 추가하고 진공 펌프를 사용하여 멤브레인의 세포를 수집합니다. 액체가 필터를 완전히 통과하면 진공 펌프를 정지하십시오.

멸균된 집게를 사용하여 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 새로운 멸균 멤브레인 조각으로 용액의 나머지 절반으로 여과를 반복합니다. 방금 수집된 바이오매스에서 식물 세포에서 내생포자를 분리하려면 멤브레인이 얼어 있는 경우 해동하고 에탄올 화염 멸균 가위를 사용하여 더 작은 조각으로 자릅니다.

멤브레인 조각을 멸균 2ml 튜브로 옮기고 900마이크로리터의 1X TE 버퍼를 추가합니다. 멤브레인에서 바이오매스를 방출하기 위해 와류로 철저히 혼합합니다. 튜브를 섭씨 65도 및 80rpm에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 15분 동안 식힙니다. 갓 준비한 라이소자임 100마이크로리터를 최종 농도인 밀리리터당 2밀리그램에 첨가하고 섭씨 37도 및 80RPM에서 60분 동안 샘플을 배양하여 식물 세포를 용해합니다. 용해가 완료된 후 시료에 3개의 일반 수산화나트륨 250마이크로리터와 6% SDS 용액 250마이크로리터를 첨가합니다.

실온에서 80RPM으로 60분 동안 배양합니다. 다음으로, 오토클레이브로 직경 25mm의 멤브레인을 고정하는 멸균 여과 장치를 준비합니다. 여과 장치가 냉각된 후 직경 25mm, 0.2마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인을 그 위에 놓습니다.

샘플을 멤브레인에 추가하고 진공 펌프를 사용하여 액체를 여과하여 멤브레인의 내생포자를 포획하는 동안 식물성 세포 물질이 통과합니다. 잔류 세제를 씻어내려면 멤브레인에 2ml의 멸균 생리학적 용액을 추가하고 진공 펌프를 적용합니다. 액체가 완전히 여과되면 펌프를 끄고 여과 장치의 멤브레인을 그대로 두십시오.

멤브레인에서 직접 DNase 처리를 수행하려면 450마이크로리터의 멸균수, 50마이크로리터의 1X DNase 반응 완충액 및 0.5마이크로리터의 DNase 효소를 멤브레인에 첨가하고 약 섭씨 25도에서 15분 동안 그대로 둡니다. 이전에 용해된 세포에서 방출된 세포외 DNA는 효소로 소화된 다음 씻겨 나옵니다. 이를 통해 최종 내생포자 제제에 분자 분석과 같은 다운스트림 분석의 핵심인 외부 DNA가 없음을 보장합니다.

필터 장치에서 누출이 없어야 하며 샘플이 마르지 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 배양 후 생리용액 1ml를 넣고 펌프를 켜서 샘플에서 잔류 효소를 씻어냅니다. 멸균 집게를 사용하여 내생포자가 포함된 멤브레인을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 분석합니다. 이 식물 세포의 표적 용해에 대한 이 비디오에서 입증된 프로토콜은 정제된 내생포자 샘플과 내생포자 형성 firmicutes의 분율을 크게 증가시킵니다. 16S 리보솜 RNA의 앰플리콘 염기서열분석에서 처리되지 않은 샘플의 유전자 firmicutes는 염기서열의 8%에서 19%에 불과합니다.

대조적으로, 치료 후 피르미쿠테스는 엔도스포린이 풍부한 샘플의 90.6%와 83.9%를 차지했습니다. 엔도스포어(endospore) 형성 피르미큐트(firmicutes), 바실라(bacillales) 및 클로스트리디알레스(clostridiales)의 두 가지 주요 순서는 풍부해진 반면, 락토바실라레(lactobacillales)와 같은 비내포어(non endospore) 형성 피르미큐트는 없었습니다. 치료의 효율성은 또한 순수 배양을 사용하여 입증되었습니다.

내생포자 제제와 식물 세포 배양을 처리하고, 모든 세포를 배양하고, 600나노미터의 광학 밀도로 성장을 측정했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 내생포자 배양에서는 성장이 관찰된 반면, 처리된 대장균 배양에서는 성장이 관찰되지 않았는데, 이는 식물 세포가 돌이킬 수 없게 손상되었음을 나타냅니다. 일단 숙달되고 용액과 장비가 이전에 준비된 경우 이 기술은 약 5시간 내에 완료되어야 합니다.

멸균 조건에서 작업하고 용액과 모든 장비의 멸균을 보장하여 모든 오염을 피하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 배양, 분리 및 대사 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 내생포자의 균주 식별 및 대사 가능성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 또한 다운스트림 DNA 추출 및 메타유전체 염기서열분석(metagenomic sequencing)을 수행하여 종의 다양성과 유전자 존재를 분석할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 환경 샘플에서 내생포자를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. SDS와 같은 세제로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 개인 보호 장비를 착용하는 것을 잊지 마십시오.