Name: 식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 환경 시료에서 세균 내생 포자를 비파괴적으로 분리하는 방법을. 식물 세포 용해 기술을 활용하여 미생물학 및 생태학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 그랜트 번호 31003A-1분의 132,358, 31003A_152972 및 번호 151948에 대한 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 인정하고 Fundation 피에르 메르 라 과학을 붓는다.

화학 물질 및 장비의 1. 준비 <ol><li> 1 %의 나트륨 헥사 (SHMP) (나포 3) N 용액 500 mL로하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 멸균 니트로 셀룰로오스 (NC) 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 47mm). </li><li> 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 NC 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 25mm)를 소독. </li><li> 무게 (에 캡) 멸균 50 ㎖ 튜브의 빈 무게 (샘플 당 하나의 튜브를) 참고. </li><li> EDTA 트리스 완충액 (TE 버퍼) (1X)를 준비 : 10 mM 트리스 (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄) 및 1 mM의 EDTA 완충액 용액을 만든다. 8 산도를 조정하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 1 ㎖의 TE 완충액에 리소자임 0.02 g을 용해하여 리소자임 용액 (20 ㎎ / ㎖)을 제조. 이상적으로, 때마다 신선한합니다. 더 이상 1 이상 주 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 8g / L 염화 나트륨을 용해시켜 용액을 제조 생리증류수 (염화나트륨). 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li></ol> 퇴적물에서 바이오 매스 2. 분리 <ol><li> 퇴적물 시료 3 g을 에탄올 골조 금속 국자를 사용하여 50 ㎖ 튜브를 멸균 무게를 사전에 추가합니다. 오염을 방지하기 위해 깨끗하고 자외선 살균 바이오 안전성 캐비닛에이를 수행합니다. </li><li> 멸균이 뷰렛을 졸업 사용하여 샘​​플에 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션의 15 ML을 추가합니다. SHMP 용액은 오염을 방지하기 위해 필터링 될 수있다. </li><li> 액체 분산기 / 균질 (예를 들어, 울트라 타락 균질)와 침전물과 SHMP 솔루션을 균질화. 70 % 에탄올 소독 또는 사용하기 전에 분산 로터를 압력솥. 17,500 rpm에서 1 분간 균질화를 실행합니다. 2 분 동안 샘플 나머지를하자 같은 회 전자 속도에서 1 분 동안 균질화를 반복합니다. </li><li> 샘플은 10 분 동안 서 보자. 이 단계에서 가장 무거운 입자 (미네랄) 해결됩니다. 그러나 세포와 w 샘플 중 유기 성분병이 용액에 남아 있습니다. 퇴적물 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 그 후, 깨끗한 50 ML 튜브에 뜨는 용액 (포함하는 세포 바이오 매스)을 전송합니다. </li><li> 침전물 펠릿에 멸균이 뷰렛을 졸업하여 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션 다시 15 ml를 추가합니다. 그런 다음 반복 2.3 및 2.4 단계를 반복합니다. 이 반복은 퇴적물의 미네랄 성분으로부터 세포 및 유기 입자의 최대 양의 분리를 보장한다. 이 제 2 분리의 상등액을 제 1 분리에서 상등액과 병합 될 수있다. 주 : 다음 단계는 모든 (셀 바이오 매스를 포함) 상층 액에서 수행된다. 미네랄 성분 (퇴적물 펠렛) 폐기 될 수있다. </li><li> 1 분 20 XG에서 샘플을 원심 분리기. 생물 세포 물질은 여전히​​ 용액에 남아있는 동안이 단계는 작은 광물 입자를 해결하기에 충분 G-힘을 증가시킨다. 원심 분리 후, 상청에 용액 (세포 함유 매스)를 전송할깨끗한 50 ML 튜브. 미네랄 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 샘플을 계량하여 바이오 매스를 함유하는 용액의 최종 부피를 결정한다. 가중치 결정 눈금 실린더에 시료를 전송하는 데 및 오염의 위험을 감소 피한다. </li></ol> 필터 멤브레인에 바이오 매스의 3 컬렉션 <ol><li> 여과 장치 (47mm 직경 멤브레인) 및 진공 펌프를 준비합니다. 고온 가압 멸균하여 70 % 에탄올을 분무 분젠 버너로 타오르는 그래피 (파이렉스 유리의 경우) 중 여과 부 소독. 이 프로토콜을 계속하기 전에 식혀 보자. </li><li> 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 여과 장치에 멸균 NC 멤브레인을 추가합니다. </li><li> 진공 펌프를 사용하여 멤브레인에 세포 막 여과 장치에 (단계 2.6)에서 시료의 상층 액의 절반을 첨가하고 수집한다. </li><li> 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 이단을 사용하여 조심스럽게 제거 막OL-불꽃 집게를 소독. 멸균 페트리 접시에 막 놓습니다. <ol><li> 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 반으로 막을 잘라. 별도의 2 ML 튜브에 막의 각각의 절반을 추가합니다. 멤브레인의 절반은 DNA 추출 및 사회 전체 박테리아의 분석을 위해 사용된다. 필터의 다른 절반은 -80 ° C에서 저장 및 백업의 역할을한다. </li></ol></li><li> 여과 유닛 상에 새로운 NC 멤브레인을두고 진공 펌프를 사용하여 (단계 260)에서 샘플 볼륨의 후반에서 미생물을 모은다. </li><li> 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 신중 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 멤브레인을 제거한다. 별도의 2 ML 튜브로 전체 막 놓습니다. 이 샘플은 식물 세포로부터 내생 포자를 분리하는 처리를 위해 사용될 것이다. 시료를 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 식물 세포의 용해 (4) <ol><li> 수행치료 이전에 NC 막 (단계 3.6)에 수집 된 바이오 매스에 식물 세포에서 내생 포자를 분리합니다. <ol><li> 멤브레인이 동결 된 경우 해동 실온에서 10 분 동안두고. 그런 다음 멸균 페트리 접시에서 막을 배치하고 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 작은 조각으로 (약 4 배)를 잘라. 그런 다음 멸균 2 ML 튜브에 모든 멤브레인 필터 조각을 배치합니다. </li></ol></li><li> 샘플 멤브레인을 포함하는 튜브에 1X TE (트리스 - EDTA) 버퍼의 900 μl를 (1.5 참조) 추가 소용돌이에 의해 철저하게 섞는다. 이 단계에서, 바이오 매스-TE 완충액으로 막으로부터 제거된다. </li><li> 10 분 80 rpm으로 65 ° C에서 인큐베이터에서 튜브를 놓습니다. 그 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 15 분 동안 냉각 수 있습니다. </li><li> 2 mg / ml의 최종 농도에 도달하기 위해 새로 제조 라이소자임 (1.5 참조) 100 ㎕를 추가한다. 샘플을 37 ℃로 냉각되기 전에이 내지 수 있기 때문에, 라이소자임를 추가하지 마십시오효소 rade. </li><li> 리소자임에 대한 최적 조건은 식물 세포를 용해시키기 위하여, 60 분, 80 rpm으로 37 ℃에서 샘플을 배양한다. </li><li> 용해가 완료되면, 3 N 수산화 나트륨 (NaOH) 샘플 6 % 도데 실 황산나트륨 (SDS) 용액을 250 μL의 250 μL를 추가한다. 이 첨가에 의해, 시료 부피는 1.5 ㎖에 도달하여, 0.5 N NaOH를 최종 농도 1 % SDS의 최종 농도가있다. </li><li> 60 분 80 rpm으로 실온에서이 믹스를 품어. 베이스와 세제를 추가하면 최종 세포 용해에 도움이 될 것입니다. 식물 세포를 용균 동안 이러한 세제의 농도는, 내생 포자를 해치지하도록 최적화되어있다. </li><li> (파이렉스 유리의 경우) 70 % 에탄올로 분무하고 분젠 버너 화염을 오토 클레이브에 의해 직경 25mm 막을 보유, 또는 멸균 여과 유닛을 준비한다. 이 식히십시오. </li><li> 에탄올 화염 멸균 집게를 사용하여 여과 유닛에 0.2 μm의 NC 막 (25mm 직경)을 배치했다. &lt;/ 리&gt; <li> 멤브레인 상 단계 4.7에서 샘플을 추가하고, 진공 펌프를 사용하는 액체 필터. 액체가 통과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 이 막 상에 유지되지 않기 때문에이 단계에서 분해 된 식물 세포의 재료가 제거된다. 만 내생 포자는 막에 남아있을 것이다. </li><li> 잔류 세제를 씻어 진공 펌프를 사용하여 액체를 필터링하는 멸균 생리 용액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 액체가 완전히 여과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 여과 장치의 멤브레인을 남겨주세요. </li></ol> 5. DNase의 치료 주 : 여과막에 직접 D​​Nase의 처리를 수행한다. 이 여과 장치가 누출되지 않는 것이 중요하고, 진공 펌프는 턴 오프된다. <ol><li> 필터 막에 멸균 물 450 μL, 직접 D​​Nase의 반응 버퍼 (1X) 0.5 μL DNase의 효소의 50 μl를 추가하고 15 분 동안 서 보자. 가능하면, 약간 전쟁 방에서이 소화 할평균 RT보다 르, 효소는 위의 25 ° C에서의 온도에서 잘 작동하기 때문이다. 주 : 분젠 버너를 늘리지 따로 여과 장치는 또한 온도가 증가하고 무균 환경을 유지하는 추가적인 장점을 가지며, 따라서 샘플의 오염의 위험을 감소시켰다. </li><li> DNase의 분해가 완료되면, 샘플로부터 효소를 제거하기 위해 진공 펌프를 켜. </li><li> 추가 및 생리 액 1ml를 필터링하여 잔여 효소를 씻어 내십시오. </li><li> 액체가 완전히 통과 한 경우, 진공 펌프를 끄고 멸균 집게를 사용하여 멸균 페트리 접시에 배치 내생 포자가 들어있는 필터 멤브레인을 제거합니다. 주 : 분리 내생 포자의 샘플을 지금 다운 스트림 분석을위한 준비가되어 있습니다. 발아와 재배에 사용되는 경우 -20 ° C에서 보관은 DNA 추출을 위해 또는 다른 4 ° C에서 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

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외부 공격적인 물리 화학적 요인 (예를 들면, 온도 또는 세제)에 내생 포자의 저항은 환경 시료에서 식물 세포에서 세균 내생 포자를 분리하는 방법을 고안 하였다. 이것은 비파괴 방식으로 환경 시료로부터 내생 포자를 분리하는 제 광범위한 방법이다. , 양을 감지하거나 샘플 내생 포자를 분석하는 이전 방법 등 dipicolinic 산 또는 특정 마커 유전자와 같은 내생 포자에 대한 특정 프록시의 측정을 기반으로했다. 대조적으로, 프로토콜, 여기에 제시된 내생 포자 이외의 샘플 성분은 제거되고 있으므로 결국 내생 포자 시료의 단독 및 정제 된 잔재로 남아있다. 이러한 살균 또는 밀도 구배 원심 분리 등의 다른 방법이 내생 포자 22 풍부 제안하였으나, 우리의 실험은 밀도 구배 원심 분리는 환경 시료에 대한 일반적인 방법으로 적합하지 않은 것으로 밝혀인해 생리적 차이 내생 포자 형성 제의 여러 종의 다른 밀도로 (데이터는 미도시). 대조적으로, 우리는 프로토콜을 쉽게 환경 시료의 모든 유형에 적용되...

이 연구의 목적은 환경 시료에서 식물 세균 세포에서 세균 내생 포자의 분리를위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 박테리아 내생 포자의 형성은 문 후벽 균 1 그룹에 속하는 박테리아의 수에서 발견 생존 전략, 보통 기아에 의해 유발된다. 내생 포자 형성 세균이 잘 균주의 수는 병원균 따라서 의료의 중요성 (예를 들어, 탄저균이나 클로스 트리 디움 디피)의 주로하기 때문에, 연구한다. 내생 포자 형성 박테리아의 환경 균주는 거의 모든 환경 (토양, 물, 퇴적물, 공기, 얼음, 인간의 직감, 동물의 창자 등) 1-3에서 고립되었다. 따라서, 후벽 균 배양 컬렉션 (4)에서 두 번째로 가장 풍부한 문이다. 때문에 튼튼한 외부 피질 및 보호 핵심 단백질, 내생 포자는 FR에 이르기까지 극단적 인 환경 조건을 견딜 수높은 방사선, 극한의 온도 및 유해 화학 물질 5 옴 탈수. 이 놀라운 저항은 내생 포자 6-8에서 DNA를 추출하는 도전한다. 그들은 환경 시퀀싱 연구 9,10에서 간과 된 이유는 가능성을 설명합니다. 형광 항체 (11)에 의해 환경 시료의 내생 포자의 대상과 같은 다른 방법, 토양 12, 퇴적물 13 dipicolinic 산의 정량 (DPA)은 14 유동 세포 계측법 또는 저온 살균 이후 재배 (15, 16)는에 내생 포자를 검색하거나 정량화하는데 사용되어왔다 환경 시료. 최근, 최적화 된 DNA 추출 방법뿐만 아니라, 특정 분자 프라이머 내생 포자 특정 유전자 서열은 10,17-20 개발 된 타겟팅한다. 이 박테리아 (21)이 그룹들 사이에서 더 많은 생물 다양성을 나타 내기 위해 도움이 또한 내생 포자의 검출을위한 산업 및 의학에 응용하게되었다, 우유 분말 (19)의 예를 들어. 여기에 제시된 프로토콜은 식물 세포에 대하여 내생 포자의 세균 (예 : 열 및 세제 등) 유해한 물리 화학적 조건에 저항의 차이에 기초한다. 샘플에서 식물 세포를 파괴하기 위해, 우리는 연속적으로 열, 리소자임과 세제의 낮은 농도를 적용합니다. 포자를 파괴하지만, 모든 식물 세포를 용균하지 않도록 이러한 치료의 시간과 강도를 최적화되었다. 환경 세포 풀의 일부 셀들은 다른 것보다 더 내성이므로, 모든 식물 세포 파괴의 확률을 증가시키기 위해, 우리는 세 가지 다른 치료를 적용한다. 이 방법의 장점 및 신규성은 치료 후 내생 포자는 그대로이며, 하류의 분석에 이용 될 수 있다는 것이다. 이들은 D를 감소 따라서 DNA 추출, 정량 PCR (qPCR에) 및 앰플 리콘 또는 특히 내생 포자의 그룹을 대상으로 metagenomic 시퀀싱 (및 포함iversity) 범위 증가한다. 또한 하류 내생 포자 배양 또는 형광 현미경으로 정량에 사용될 수있는, 유동 세포 계측법, 또는 DPA의 검출. 이 방법의 중요한 특징은 처리 된 샘플과 미처리 샘플과 비교하여, 하나의 셀에 대응하는 식물 성분 외에 환경 샘플에서 내생 포자의 양과 다양성을 추론 할 수 있다는 점이다.

<table><tbody><tr><td>Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터, 0.2 &#956; m 기공 크기, 직경 47mm</td><td>시그마-알드리치</td><td>WHA7182004 알드리치&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>252859 시그마-알드리치</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E9884 시그마-알드리치</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자위의 라이소자임</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 플루카</td><td>분말, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax 호모게나이저 T18 기본</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>유리 필터 홀더 47&nbsp; mm 멤브레인, Pyrex 유리</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>화학 듀티 진공 펌프</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>매니폴드 샘플링 여과 25&nbsp; mm 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>1225 샘플링 매니폴드</td><td>폴리프로필렌</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Rnase 무료</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 도데실 설프페이트 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터, 0.2 &#956; m 기공 크기, 직경 25mm</td><td>시그마-알드리치</td><td>WHA7182002 알드리치</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

내포자 형성은 피르미쿠테스(Firmicutes)문의 일부 박테리아에서 발견되는 생존 전략입니다. 내포자가 형성되는 동안 이 박테리아는 불리한 환경 조건에서 생존을 향상시키는 형태 생리학적 휴지 상태로 들어갑니다. 내포자 형성 피르미쿠테스는 배양 연구에서 가장 빈번하게 농축되고 분리된 박테리아 그룹 중 하나이지만, 분자 방법에 기반한 다양성 연구에는 종종 빠져 있습니다. 포자 코어의 저항은 내생포자에서 DNA의 회복을 제한하는 요인 중 하나로 간주됩니다. 우리는 내생포자의 높은 저항성을 이용하여 물리적, 효소적, 화학적 용해 방법을 사용하여 복잡한 미생물 군집의 다른 세포와 분리하는 방법을 개발했습니다. 이렇게 얻어진 내포자 단독 제제는 재배양에 사용하거나 내생포자에 최적화된 맞춤형 DNA 추출 및 후속 DNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 퇴적물 샘플에 적용된 이 방법은 내생포자를 풍부하게 할 수 있었고 염기서열분석 후 담수호 퇴적물에서 매우 다양한 내생포자 형성 물질을 밝혀냈습니다. 이 방법을 다른 샘플에 적용하면 유사한 결과가 나올 것으로 예상됩니다.

여기에 제시된 결과는 이전 10,21 발표되었다. 데이터의 환경 적 해석과 설명은 해당 문서를 참조하십시오. 전체 절차를도 1에 요약 및 세 개의 주요 단계에 해당된다 : 첫째, 침전물 또는 다른 환경적인 행렬에서의 바이오 매스의 분리; 둘째, 식물 세포의 파괴; 그리고 세 번째, 분리 된 내생 포자의 하류 분석. 하류 분석 다양성을 결정하는 DNA 추출 및 앰플 리콘 서열, 예를 들어, 구성 될 수있다. 내생 포자의 용해를 확보 할 수 있도록 DNA 추출을 최적화 할 필요가있다. 침전물 시료에서는 강제 순차 DNA 추출 과정 (10)를 이용하여이를 달성했다. 퇴적물에있어서의 애플리케이션은 분리 후 내생 포자 형성 후벽 균의 분획의 상당한 증가를 보여준다. 16S rRNA의의 앰플 리콘 시퀀싱에서유전자 치료 샘플 후벽 균 (전체 커뮤니티) 만에 8.0 시퀀스의 19.0 % (표 1)</stro...

복잡한 미생물 군집에서 박테리아 내생포자를 선별하는 방법이 개발되어 이 박테리아 그룹에 대한 맞춤형 배양 또는 분자 연구를 수행할 수 있습니다.

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

본 절차의 전반적인 목표는 퇴적물과 같은 복잡한 미생물 군집 시료로부터 세균 내생포자를 분리하는 것입니다. 이 방법은 자연 시료 내 내생포자의 존재와 풍부도에 관한 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이는 화학 물질과 열에 대한 내생포자와 영양 세포 간의 저항성 차이를 이용한 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 내생포자에 대해 비파괴적인 방법이라는 점이며, 따라서 배양, 정량 분석 및 대사 테스트와 같은 후속 실험에 사용할 수 있습니다.본 방법은 내생포자를 형성하는 박테리아의 생태학적 특성에 맞게 설계되었으나, 포자가 유익하거나 유해할 수 있는 외계생물학 또는 식품 산업과 같은 분야에서도 활용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용액과 장비를 준비한 후, UV 멸균된 생물안전작업대 내에서 에탄올로 화염 멸균한 금속 스쿱을 사용하여 미리 무게를 잰 멸균 50 milliliter 튜브에 3g의 퇴적물 샘플을 넣습니다. 멸균된 눈금 뷰렛을 사용하여 멸균 여과된 1% sodium hexametaphosphate(SHMP) 용액 15 milliliters를 샘플에 첨가합니다.액체 분산기 또는 균질기와 멸균된 분산 로터를 사용하여, 17,500 RPM에서 1분 동안 시료를 균질화합니다. 시료를 2분 동안 방치한 후 균질화 과정을 반복합니다. 가장 무거운 입자들이 가라앉을 수 있도록 시료를 10분 동안 방치합니다.펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 세포 바이오매스가 포함된 상층액을 깨끗한 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 침전된 펠렛에 SHMP 15 milliliter를 추가로 넣고 균질화를 반복한 후, 상층액을 수집하여 첫 번째 분획과 합칩니다. 샘플을 20 times G에서 1분 동안 원심 분리하고 상층액을 새 50 milliliter 튜브로 옮긴 다음 펠렛은 폐기합니다.텍스트 프로토콜에 따라 여과 장치와 진공 펌프 준비가 완료되면, 에탄올 램프로 핀셋을 멸균한 후 멸균된 니트로셀룰로오스 막을 여과 장치에 추가합니다. 방금 준비한 상층액 샘플의 절반을 막 여과 장치에 넣고 진공 펌프를 사용하여 세포를 막 위에 수집합니다. 액체가 필터를 통해 완전히 통과하면 진공 펌프를 정지시킵니다.멸균된 핀셋을 사용하여 막을 조심스럽게 제거한 후 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 새로운 멸균 막을 사용하여 남은 절반의 용액으로 여과 과정을 반복합니다. 방금 수집한 바이오매스 내의 영양 세포와 내생포자를 분리하려면, 막을 냉동 보관했을 경우 해동하고 에탄올 램프 멸균 처리한 가위로 막을 작은 조각으로 자릅니다.멤브레인 조각들을 멸균된 2mL 튜브로 옮기고 900µL의 1X TE buffer를 첨가합니다. 볼텍싱을 통해 충분히 혼합하여 멤브레인으로부터 바이오매스를 분리합니다. 튜브를 65°C, 80 RPM 조건에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음, 튜브를 인큐베이터에서 꺼내 15분 동안 식힙니다. 최종 농도가 2 mg/mL가 되도록 갓 준비한 lysozyme 100 µL를 첨가하고, 영양 세포를 용해시키기 위해 샘플을 37 °C, 80 RPM에서 60분 동안 인큐베이션합니다. 용해가 완료되면 샘플에 3 N sodium hydroxide 250 µL와 6% SDS 용액 250 µL를 첨가합니다.실온에서 80 RPM으로 60분 동안 배양합니다. 다음으로, 오토클레이브를 사용하여 직경 25 millimeter 멤브레인을 장착할 수 있는 멸균 여과 장치를 준비합니다. 여과 장치가 식으면, 직경 25 millimeter, 공극 크기 0.2 micrometer의 니트로셀룰로오스 멤브레인을 장치 위에 올립니다.샘플을 멤브레인 위에 올리고 진공 펌프를 사용하여 액체를 여과함으로써, 영양 세포 물질은 통과시키고 엔도스포어는 멤브레인에 포집합니다. 잔류 세제를 씻어내기 위해 2 mL의 멸균 생리식염수를 멤브레인에 가하고 진공 펌프를 작동시킵니다. 액체가 완전히 여과되면 펌프를 끄고 멤브레인을 여과 장치 위에 그대로 둡니다.막 위에서 직접 DNase 처리를 수행하려면, 멸균수 450 µL, 1X DNase 반응 버퍼 50 µL, DNase 효소 0.5 µL를 막 위에 첨가하고 약 25 °C에서 15분 동안 방치합니다. 용해된 세포에서 이전에 방출된 세포 외 DNA는 효소에 의해 분해된 후 세척되어 제거됩니다. 이를 통해 최종 엔도스포어(endospore) 준비물에서 외부 DNA가 제거되며, 이는 분자 분석과 같은 후속 분석의 핵심 요소가 됩니다.필터 장치에 누수가 없어야 하며, 시료가 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 배양 후 생리식염수 1 mL를 첨가하고 펌프를 작동시켜 시료에 남아 있는 잔류 효소를 씻어냅니다. 멸균 핀셋을 사용하여 내생포자가 포함된 막을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 분석하십시오. 영양 세포의 표적 용해를 다루는 이 비디오의 프로토콜을 통해 정제된 내생포자 샘플을 얻을 수 있으며, 내생포자를 형성하는 firmicutes의 분율이 유의미하게 증가합니다. 16S 리보솜 RNA 유전자의 앰플리콘 시퀀싱 결과, 처리되지 않은 샘플 내 firmicutes는 전체 서열의 8%에서 19%에만 해당합니다.이와 대조적으로, 처리 후 endosporin이 풍부한 샘플에서는 firmicutes가 90.6% 및 83.9%를 차지했습니다. 내생포자를 형성하는 firmicutes의 두 주요 목인 bacillales와 clostridiales는 농축된 반면, lactobacillales와 같이 내생포자를 형성하지 않는 firmicutes는 관찰되지 않았습니다. 처리 효율은 순수 배양을 통해서도 입증되었습니다.내생포자 조제물과 영양세포 배양물을 처리한 후, 모든 세포를 배양하고 600 nm의 흡광도로 성장을 측정하였습니다. 여기에서 보시는 바와 같이 내생포자 배양물에서는 성장이 관찰된 반면, 처리된 E. coli 배양물에서는 성장이 관찰되지 않았으며, 이는 영양세포가 가역 불가능하게 손상되었음을 나타냅니다. 숙달된 상태에서 용액과 장비가 미리 준비되어 있다면, 이 기술은 약 5시간 내에 완료될 수 있습니다.멸균 조건에서 작업하고 용액과 모든 장비의 멸균 상태를 유지하여 모든 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 배양, 분리 및 대사 테스트와 같은 다른 방법들을 수행하여 내생포자의 균주 식별 및 대사 잠재력에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 또한, 종 다양성과 유전자 존재 여부를 분석하기 위해 후속 DNA 추출 및 메타게놈 시퀀싱을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 환경 시료에서 내생포자를 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. SDS와 같은 세제류를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 유의하십시오. 개인 보호 장구를 반드시 착용하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

출처: Schlimpert, S., et al. 미세유체 장치를 사용한 전체 S. venezuelae 수명주기의 형광 타임랩스 이미징. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 Streptomyces venezuelae에서 포자의 배양 및 분리를 보여줍니다. 박테리아가 스트레스에서 생존하는 데 도움이 되는 휴면 세포인 포자는 영양분 제한 중에 생성되고 원심분리를 통해 수집됩니다. 이 방법은 다운스트림 응용 분야를 위한 순수하고 냉장 저장된 포자 현탁액을 보장합니다.

 액체 배양에서 Streptomyces venezuelae 포자의 준비 및 분리 

출처: Wunderlin, T. 외. 환경 샘플에서 영양세포의 표적 용해를 통한 내포자의 물리적 분리. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 식물성 세포와 다양한 박테리아가 포함된 환경 샘플에서 내포자를 분리하는 방법을 시연합니다. 이 절차는 여과, 기계적 교란, 선택적 화학적 처리를 포함하며, 영양 세포를 약화시키고 용해하면서 내포자를 보존합니다. 마지막 단계는 막 여과를 통해 강인한 내포자를 분리합니다.

환경 샘플에서 식물성 세포의 표적 용해를 통한 내포자 분리 

여기에서는 박테리아 포자 발아 중 환원당의 존재를 감지하기 위한 비색 분석법을 설명합니다.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

지열 온천에서 중금속 내성 미생물을 분리하는 것은 생물 정화 및 환경 모니터링 바이오 시스템 개발을위한 뜨거운 주제입니다. 이 연구는 온천에서 중금속 내성 박테리아를 분리하고 식별하기위한 방법 론적 접근법을 제공합니다.

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Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

배우세요 환경 시료에서 세균 내생 포자를 비파괴적으로 분리하는 방법을. 식물 세포 용해 기술을 활용하여 미생물학 및 생태학 연구에 활용할 수 있습니다.

식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

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