Name: (A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 2. 일반 사례 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 BSL-4 실험실에서 플라크 분석법을 안전하게 수행하는 방법을 배우세요. 2급 생물안전 캐비닛 청소, 이중 4차 암모늄 소독제 사용, 오폐수 처리 절차를 포함한 생물안전 규정 준수 기술을 익히세요.

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이 출판물의 내용이 미국 보건복지부(DHHS) 또는 저자와 제휴한 기관 및 회사의 견해나 정책을 반드시 반영하는 것은 아닙니다. 이 작업은 Battelle Memorial Institute와 미국 국립 알레르기 및 전염병 연구소(NIAID)의 주요 계약을 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. 및 J.W.는 Battelle Memorial Institute의 직원으로 이 작업을 수행했습니다. 이 작업을 수행한 Battelle Memorial Institute의 하청업체는 다음과 같습니다: MRI Global의 직원인 S.M.; Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.의 직원으로서의 MGL; J.H.K.는 Tunnell Government Services, Inc.의 직원입니다.

1. 실험 항목 <ol><li> 이전 BSL-4 실험실에 진입 실험 (예를 들면, 세포, 미디어, 소모품)을위한 BSL-2 실험실에서 모든 물품을 수집합니다. </li><li> (참고 7에서 자세히 설명)을 BSL-4 항목의 절차를 완료합니다. </li></ol> BSL-4 실험실에서 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛 2. 준비 <ol><li> 일단 BSL -4- 기관 내부 완료된 일상 점검의 내부 (도 1)을 보장한다. 체크리스트는 이전에 작성하여 바이러스가 사용될 표시되어 있지 않은 경우 체크리스트를 작성합니다. 체크리스트가 이미 완료된 경우에 이름을 추가하고있는 바이러스 목록에 사용될 것이다. </li><li> (5 % 이중 차 암모늄 살균제 용액으로 예를 들면 N- 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, N- 알킬 디메틸 에틸 벤질 암모늄 (새시 포함) BSC의 전체 내부를 분무하여 클래스 II BSC 청소에이전트에 대한 클로라이드 또는 다른 살균제의 적절한 사용)와 종이 타월 10, 11로 닦아된다. 점착성 소독액을 제거 캐비닛 및 새시 안에 70 % 에탄올 용액을 분무. </li><li> 앉아있는 경우, 캐비닛의 뒷면에 도달 할 수 있도록 편안한 높이로 클래스 II BSC의 앞에 의자를 설정하고 실험실 전문가의 얼굴이 전면 개방 위 (그림 2) 11 자리 잡고있다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 용 폐기물 용기를 준비합니다. 폐기물 용기의 이중 급 암모늄 소독제 용액의 최종 농도가 더 5 % 미만인지 확인합니다. 그에 따라 계획 및 10 % 용액이되는 폐기물은 살균제를 희석 것이다 추가됩니다 할 수 있습니다. 또한,시 및 분석 완료 후 사전 제거 및 장갑을 낀 손에 모든 항목을 스프레이 클래스 II BSC 내부 5 % 이중 급 암모늄 소독제 용액 스프레이 병을 배치합니다. </li> &lt;리&gt;는 공기 흐름 (11)의 클래스 II BSC 및 중단으로 반복 재료 소개를 피하기 위해 멀리 돌아 가능한 캐비닛의 클래스 II BSC에서 전체 실험에 필요한 적절한 재료를 놓습니다. </li></ol> 3. 예 : 상패 분석 <ol><li> 바이러스를 함유하는 샘플을 검색하고 손으로 저장 위치에서 바이러스를 제어하고 37 ℃의 배양기에서 물질을 해동. </li><li> 계획된 바이러스 희석액에 따라 사용되는 6- 웰 플레이트의 웰 라벨. 뚜껑과 몸체가 분리 된 경우 성공적인 매칭을 보장하기 위해 접시의 뚜껑과 본체를 표시합니다. </li><li> 클래스 II BSC에 단계 3.1-3.2에서 자료를 가져와. 다른 쪽 ( &quot;더러운 측&quot;)에 ( &quot;깨끗한 측&quot;)와 낭비를하지 않았거나 한쪽 바이러스와 접촉하지 않습니다 모든 항목을 놓습니다. 가능하면, 에어로졸 발생 활동 한 동안 떨어져 &quot;더러운 항목&quot;에서 &quot;깨끗한 항목&quot;적어도 30cm를 유지1. </li><li> 내부 중심이 자기 (11)을 보호하기 위해 가장 효과적인 위치가되도록 설계 한, 가능한 클래스 II BSC의 내부 중앙에 가깝게 작동한다. </li><li> 바이러스 샘플 및 제어 바이러스의 50 μl를 제거하고 2 % 소 태아 혈청에 둘 베코의 변형 이글의 매체의 450 μL에 배치합니다. 지금까지 필요 (그림 3A)와 같은에서 연속 희석을 진행합니다. </li><li> 샘플에 기포 발생을 최소화하기 위해 노력하는 동안 희석 동안 천천히 그리고 조심스럽게 피펫 팁으로 바이러스 샘플을 적어도 5 번 섞는다. 또한 다음 희석에 각각 첨가 한 후 피펫 팁을 변경합니다. </li><li> 최종 희석 시료 5 시간 혼합 한 후, 같은 부피의 희석을 위해 폐기물 컨테이너로 바이러스 시료 50 μL를 버린다. </li><li> 팁 폐기 할 때는 expell 전에 팁의 내부와 외부의 오염을 제거하기 위해 쓰레기 통에서 소독액 각 팁을 씻어폐기물 통에 팁을 보내고. </li><li> 희석액이 이루어진 후에, 6- 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 미디어두고 따로 희석 웰을 설정하고 세포 배양 플레이트의 웰로부터 매체의 흡입을 시작. </li><li> 수동, 볼륨 조절을 사용하여 피펫의 상단에 쓰레기 통에서 피펫 팁, 흡인 소독제 용액으로 완료되면, 푸시 버튼 피펫을 피펫 내부의 적절한 오염 제거를 위해. 실험이 끝날 때까지 폐기물로 버킷 팁을 떠난다. </li><li> 미디어 판에서 제거 된 후, 각 샘플에 대한 팁 각을 변경, 중복 미리 라벨링 플레이트에 적절한 우물에 올바른 시료 100 μl를 추가합니다. </li><li> 플라크 분석 접종이 완료되면, 소독 용액으로 장갑을 낀 손을 스프레이 손으로 인큐베이터에 다시 접시를 배치하기 전에 모든 판의 외부를 닦아 소독 용액에 적신 종이 타월을 사용합니다. 레모든 판을 다시 인큐베이터로 될 때까지이 과정을 이탄. </li><li> 1 시간 동안 세포에 걸쳐 매 15 분 샘플의 적절한 분산을 보장하기 위해 8 자형 모션 플레이트 락. </li><li> 락 플레이트 종료 후 플라크 분석의 중첩을 위해 사용되는 배 이글의 최소 필수 배지 혼합물을 1.6 %의 트라가 칸트, 아가보다 조작하기 쉽다 반고체 오버레이와 함께 클래스 II BSC로 플레이트를 반환한다. </li><li> 우물의 표면에 걸쳐 오버레이의 평등 한 분배를위한 8 자형 동작으로 다시 한 번 6 웰 플레이트와 바위에 각 웰에 오버레이 혼합물 2 ㎖를 추가합니다. 잘 사용하는 모든이 오버레이 혼합물로 중첩 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 혈청 학적 피펫의 팁 오버레이 절차를 수행 할 때 교차 오염을 방지하기 위해 우물에 액체를 만지지 않도록하십시오. </li></ol> 4. 폐기물 처리 및 청소 악기 및 바이오 안전성 내각 &lt;올&gt; <li> 완전히 적어도 10 분의 접촉 시간 동안 폐기물 양동이 5 % 소독액 모든 폐기물 잠수함. 피펫 팁, 혈청 학적 피펫, 전술 한 바와 같이 다른 폐기물을 소독. 또한, 상기 용액을 10 분의 접촉 시간 동안 폐기물 통에 접촉을 유지하도록 5 % 살균제 용액 폐기물 버킷 (안과 밖) 스프레이. </li><li> 폐기물에 대한 경과 접촉 시간을 기다리는 동안, 5 % 소독액에 종이 타월을 담가 같은 Micropipette과 같은 악기를 닦아하고, BSC에서 제거. 클래스 II BSC에서 장갑을 낀 손을 가져 전에 5 % 소독액과 장갑을 낀 손을 스프레이. <ol><li> BSC에에서 가능한 Micropipette을 제거한 후, 기기에 스티커 발생을 방지하기 위해 70 % 에탄올 용액으로 별도의 종이 타월로 닦아냅니다. 효율적으로 5 % 살균제로 닦여 수없는 악기를 스프레이하고 10 분 동안 BSC의 용액과 접촉 둡니다. </li></ol></li><li> 충분한 접촉 시간 후, BSC에서 모든 항목을 제거합니다. 싱크에 폐기물을 포함하는 폐기물 통을 포함하여 항목을 가져 가라. 살균제 잔류 물을 제거하기 위해 재사용 할 수있는 항목을 씻어. 자신의 저장 위치에있는 모든 항목을 돌려줍니다. </li><li> 클래스 II BSC의 작업 표면, 캐비닛 측면을 청소하고 다시 유리의 내부, 5 % 소독액과 띠 (1)는 70 %의 에탄올 용액 하였다. </li><li> 당기 및 고압 증기 멸균에 대해 별도의 피펫 트레이에 폐기물 양동이와 장소 표면 소독 혈청 피펫에서 혈청 피펫 드레인 (혈청 학적 피펫이 날카로운 위험을 제시 할 수 있고 쓰레기 봉투를 찢어 수 있습니다. 전에 하드 양면 용기에 이러한 피펫을 배치 고압 증기 멸균). </li><li> 싱크대의 하부에 배치 된 스트레이너에 폐기물 통의 내용을 붓는다. </li><li> straine의 내용을 싱크대에 빨간색 생물 학적 가방 늘어서 생물 학적 폐기물 용기를 가져오고 덤프빨간색 생물 학적 가방에 r에. 스트레이너의 내부에 충실 할 수 마이크로 피펫 팁을 제거하는 여과기에 도달하지 마십시오. 모든 팁이 제거 될 때까지 폐기물 용기의 내부를 따라 스트레이너를 쳐, 또는 여과기에서 팁을 제거하는 핀셋을 사용합니다. </li><li> 싱크대 옆에있는 랙에 건조 폐기물 양동이와 장소를 씻어. </li></ol> 5. 고압 증기 멸균 폐기물 <ol><li> 카트에 오토 클레이브 트레이에서 생물 학적 폐기물 용기 및 장소에서 생물 학적 가방을 제거합니다. </li><li> 트레이에 고정 가방을 유지하기 위해 오토 클레이브 트레이의 측면을 연결, 열린 생물 학적 가방을두고 가방의 외부를 통해 오토 클레이브 테이프의 조각을 놓습니다. </li><li> 혈청 학적 피펫 팁 트레이에 오토 클레이브 테이프의 두 조각을 놓고 자신의 이니셜과 날짜로 레이블을 붙입니다. 오토 클레이브 트레이 카트에 혈청 학적 피펫 트레이를 배치합니다. </li><li> 오토 클레이브를 엽니 다. 제공되는 오토 클레이브로드 / 언로드 캘리포니아를 연결오토 클레이브에 RT 카트에 휴식을 신축 오토 클레이브 플랫폼을 가지고. </li><li> 오토 클레이브에서 금속 막대를 제거하고 상부를 엽니 다. 오토 클레이브 멸균 사이클이 성공적으로 완료되었는지 확인하기 위해 금속 막대에 Geobacillus 스테아로써 모필 러스의 포자를 포함하는 생물학적 지표의 병을 놓습니다. </li><li> 오토 클레이브 트레이의 폐기물 가방의 중심에 금속 막대를 배치하지만, 금속 막대는 여전히 쉽게 접근 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 신축 오토 클레이브 플랫폼으로 폐기물 및 혈청 학적 피펫 트레이 가득 오토 클레이브 트레이를 놓고 다시 오토 클레이브에 밀어 넣습니다. </li><li> 오토 클레이브에서 오토 클레이브 로딩 / 언 로딩 카트를 분리하고 오토 클레이브 문을 닫습니다. </li><li> 오토 클레이브를 시작합니다. </li><li> 사이클이 시작될 때까지 오토 클레이브를 두지 마십시오. 오토 클레이브의 작동 화면이 실행되는 남은 시간을 표시합니다. </li><li> 오토 클레이브의 실행이 완료된 후, 생물학적 IND 삭제icator하고 지정된 인큐베이터에서 가열하여 성장을 평가한다. 성장은 생물학적 지표에 감지되면, 오토 클레이브에서 쓰레기를 재 실행하고, 새롭게 지표를 평가합니다. 성장이 검출되지 않은 경우, 시설에서 쓰레기를 제거한다. </li></ol> 6. 예 : 고정 및 상패 분석 ​​실험의 염색 <ol><li> 통과 (사용 바이러스에 의존한다) 일의 적절한 수의 후 실험실로 다시 돌아가 다시 한번 섹션 1과 2에서 단계를 수행합니다. </li><li> 조심스럽게 단계 3.1.2 완료 인큐베이터에서 플라크 분석 플레이트를 제거하고 손으로 클래스 II BSC에 배치합니다. </li><li> 미디어 및 오버레이 재료 모두를 피펫 및 소독액 용기에 분배 10 % 중성 완충 포르말린 0.8 % 크리스탈 바이올렛 (12, 13)의 혼합물로 대체합니다. 혼합물 플레이트 바이러스를 불 활성화 30 분 동안 플레이트에 남아하자. </li><li> 불 활성화 한 후, 신중하게 중립을 제거별도의 폐기물 용기에 포르말린 / 크리스탈 바이올렛 혼합물 및 장소는 처분 이전에 중화한다. </li><li> 살균제와 장갑을 낀 손 스프레이 전술 한 바와 같이 클래스 II BSC에서 그들을 전달하기 전에 판의 외부를 닦으십시오. </li><li> 여분의 얼룩을 제거하고 건조 카트에 판을 배치 판을 씻어 싱크를 진행합니다. </li><li> 플레이트가 완전히 건조되면 플라크를 계산하기 위해 빛의 상자를 사용합니다. 모든 수를 기록하고 표준 식 (그림 3B)에서 바이러스 역가를 계산합니다. </li></ol> 7. BSL-4 실험실에서 샘플을 제거 <ol><li> BSL -2- 실험실 조건에서 조작 될 모든 샘플을 비활성화한다. 따라 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF) 또는 트리 졸 LS (페놀, 구아니딘 이소 티오 시아 네이트, 티오시 안산 암모늄, 아세트산 나트륨, 글리세린) 1,14를 사용 IRF-프레드릭의 내부 바이오 사무실 승인 두 가지 방법 중 하나. 전송 사이전 BSL-4 실험실에서 제거를위한 포장에 BSC의 외부 새로운 깨끗한 튜브 또는 판에 mples. </li><li> 백의 내부와 BSL -4- 실험실 밖으로 전송받은 샘플 튜브의 외부를 살균하기에 충분한 5 % 살균제 또는 정착액 용액을 함유하는 열 밀봉 주머니에서 튜브 또는 플레이트의 열 밀봉 비활성화 샘플. 동일한 절차에 따라 다른 주머니에이 파우치를 놓습니다. </li><li> 제 파우치 밀봉 가열 밀봉 주머니의 외측 소독 적어도 10 분 동안 5 % 소독액 함유 덩크 탱크에 열 밀봉 주머니를 배치했다. </li><li> 불 활성화 방법을 사용, 룸 샘플이 전송되는 위치에, 에이전트가 사용되는 튜브의 수 및 튜브의 크기, 볼륨을 서술하여 실험실 내부의 덩크 탱크 일지를 작성합니다. </li><li> 덩크 탱크에서 파우치를 검색하고 BSL-2 실험실에 샘플을 채취하기 위해 BSL-4 실험실 외부에 동료와 함께 좌표. </li></ol>

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BSL-4 실험실에서 작업은 상당한 시간과 세부 사항에 대한 추가적인주의가 필요합니다. 이 환경에서 작업의 모든 유형이 아니라 철저한 훈련, 그리고 양심적 인 개인이 필요합니다. 분석 실험실 근로자가 훈련을해야하는 몇 가지 주요 개념을 포함로 표준 바이러스 성 플라크 분석은 BSL-4 실험실에서 높은 결과 병원균 작업을위한 일반적인 절차의 정확한 모델을 제공합니다. 첫 번째 주요 개념은 높은 결과 병원균에 대한 기본 봉쇄로 기능 클래스 II BSC,의 적절한 사용 및 안전 관행에의 응용 프로그램입니다. 클래스 II BSC의 기능은 크게 개인에 대한 노출 위험을 제한하는 방법을 지시하는 방법을 이해. 클래스 II의 작업 영역에 걸쳐 오염 된 지역에 깨끗한 지역에서 작업 흐름 ( &quot;깨끗한 측&quot;) ( &quot;더러운 측&quot;)는 BSC는 교차 오염 (11)을 방지하는 데 도움이됩니다. 깨끗하고 오염 물질 및 Suppl에이거 깨끗한 항목을...

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Nicole Joselyn
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Nicole Josleyn

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높은 결과 병원균을 처리하는 실험실 요원의 안전 (더 감염 prophylaxes이나 치료 방법이없는) 가장 중요하기 때문에, 미국 보건 복지부는 생명 의학에서 병원균과 함께 작업의 안전한 행위에 대한 설비 건설을위한 가이드 라인 및 우수 사례를 설립했다 바이오 안전성 관점 1 임상 실험실. 법률 및 규제를 통해, 관행 및 절차의 대부분은 이러한 병원체와 작업에 따라야 필수 요건이되었다. 미국, 쉽게 사람에서 사람 전송되는 병원균에서 높은 경우 - 사망률 결과 및 / 또는 주요 공중 보건에 미치는 영향과 생물 테러의 가능성을 가지고, 알레르기 및 감염성의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소로 분류됩니다 질병 (NIH / NIAID) 우선 순위 병원균과 또는 질병 통제 및 예방 (CDC) 바이오 테러의 범주에 대한 센터 에이전트 2. 또한, H이 병원균은 잠재적 생화학 테러 요원 대량 사상자 또는 경제, 중요 인프라, 또는 공신력 3에 파괴적인 영향 가능성이있는 경우 IGH-결과 병원균은 1 단계 선택 에이전트로 분류됩니다. BSL-4의 실험실과 연구소에 대한 액세스를 포함 BSL-4 작업은, 더 높은 BSL-2 / 3 작업보다 제어된다. 예를 들어, 인해 상당한 정장 트레이닝 요구 광범위한 멘토 요구 사항 및 추가적인 의료 바이오 필수로 BSL-2 또는 BSL -3- 실험실 비교 BSL -4- 실험실에 액세스 실질적으로 더 어렵다. 또한, BSL-2 또는 BSL -3- 설비 4-6 대 BSL -4- 시설의 물리적 보안 장벽은 일반적으로 존재한다. BSL-4 출입 절차에 우리의 첫 번째 문서에 설명 된 바와 같이, 실험실 직원은 BSL-4 실험실 (7)에 입학 자격 광범위한 교육 및 심리 검사를 받아야. WBSL-4 실험실 ithin, 감염과 실수의 위험은 피할 수 또는 설립 절차에 따라 완화. 연구는 최소한의 멀티 태스킹 또는 산만, 신중하고 신중하게 진행해야합니다. 긍정적 인 압력 정장 절곡하는 것은 어렵고, 얼굴 방패는 현미경과 같은 절차를 제한 할 수 있습니다. 부피가 큰 장갑 등의 소품을 취급 또는 튜브 라벨 등의 미세 운동 작업의 성능을 방해. BSL-4 실험실에서 소요되는 시간을 최소화하기 위해, 실험실 전문가는 작업 (들)의 완성을위한 BSL-4 실험실에 이러한 물질을 BSL-2 실험실에서 앞서 수행 할 수있는 단계를 식별하고 수송하는 작업 절차를 검토해야합니다. BSL-2 실험실에서 추가 처리를 위해 물질을 제거 할 때, 재료는 고정 및 밀폐 된 차 컨테이너에서 BSL-4 실험실에서 제거됩니다. 제거해야 할 샘플의 예로는 효소 결합 immunosorbe 분석한다 고정판 또는 감염 물질의 튜브NT 분석법 (ELISA), 면역 형광 분석법 (IFA) 또는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR). BSL-2 실험실에서에 비해 BSL-4의 실험실에 필요한 개인 보호 장비에 의해 부과 된 더 큰 물리적 한계뿐만 아니라, 세포 배양 접시와 폐기물 처리에 높은 결과 병원균의 불 활성화에 대한 절차는 적은 병원성 바이러스에 필요한 것보다 엄격한 BSL-2 실험실에서 공부했다. 최소한, 이들 방법은 CDC 요건을 충족해야한다. 예를 들어, 오염 된 세포 배양 플레이트 및 다른 재료는 중성 완충 포르말린과 같은 화학적 시약으로 불 활성화 될 수있다. 처리 된 세포 배양 플레이트 또는 튜브는 액체 살균제를 가득 덩크 탱크로 실험실에서 포르말린을 함유하는 열 밀봉 주머니에 넣고, 제거되어야한다. 폐기물 버킷 살균제 솔루션 가득 소독제 일시적으로 실험 기간 동안 및 소독에 대해 생성 된 폐기물을 수신에 사용되는 스프레이장갑을 nfecting 각각 바이오 안전성 캐비닛 표면 및 악기 청소. 나열된 농도 차 암모늄 살균제 솔루션은 모든 미국 BSL-4 실험실 (바 J, 개인 통신, 2015)의 황금 표준으로 간주됩니다. 폐기물 통에서 고체 폐기물은 오염 가능성을 제거하기 위해 멸균한다. 하기 위해 시각적 작업 흐름 및 일반적인 BSL -4- 절차 한계를 보여, 우리는 일반적으로 사용되는 바이러스 절차의 예로서, 표준 바이러스의 플라크 분석을 사용 하였다. 바이러스 분석 절차는 일반적으로 설명되지만,이 프로토콜에서 실험 인원의 안전을 보장하기 위해 사용되는 바이오 절차를 강조한다. 플라크 분석 기법 8,9에 대한 자세한 배경에 대한 이전의 고전 상패 분석 시각화를 참조하십시오. 여기에 제시된 절차는 CDC (1)에 의해 설명 된 BMBL 사양을 따릅니다. 그러나, 제시된 프로토콜은IRF-프레드릭 특정. 각 BSL-4 시설은 BSL-4 실험실에서 실험의 실행에 영향을 미칠 다른 표준 운영 절차 (SOP를) 및 운영 방법이 있습니다. 폐기물 관리 및 상패 분석의 실행을위한 대체 절차는이 연구소의 관리 및 운영에 따라 다를 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, BSL-4 정장 실험실 및 BSL-4 환경 내에서 클래스 II 캐비닛 작업을 수행하기위한 절차의 설정에 대한 일반적인 이해는 고위험 병원체의 연구를 고민 할 때 과학자들은 제약 및 안전에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이됩니다. BSL-4 실험실에서 직장을 둘러싼 어려움의 외부 협력자의 증가 인식이 조정 된 기대와 연구 지역 사회에 의료 대책 개발에 더 쉽게 발생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>National Chemical Laboratories</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 96-딥 웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청학적 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 혈청학적 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>140675</tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% 중립 버퍼드 포르말린</td><td>Fisher</td><td>22-050-105</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Fisher</td><td>50-702-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20 &뮤; l 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>21-402-550</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>21-402-561</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>21-402-581</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>2x EMEM</td><td>품질 생물학</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>피펫터</td><td>드러먼드</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l 피펫&nbsp;</td><td>라이닌</td><td>&nbsp; L-1000XLS+</td><td></td></tr><tr><td>200 &뮤; l 피펫&nbsp;</td><td>라이닌</td><td>&nbsp; L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>12-Well, 다중 채널 200 &mu; l 피펫터</td><td>Rainin</td><td>L12-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>8-Well, 다중 채널 1,000 &mu; l 피펫터</td><td>Rainin</td><td>LA8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>Attest</td><td>Express 의료 용품&nbsp;</td><td></td><td></td>MMM12192</tr><tr><td>오토클레이브</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 백</td><td>Fisher</td><td>01-828E</td><td></td></tr><tr><td>2,000 ml 비커</td><td>Fisher</td><td>02-591-10H</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 트레이</td><td>Fisher</td><td>13-359-20B</td><td></td></tr><tr><td>피펫 트레이</td><td>Fisher</td><td>13-361-5</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 인큐베이터</td><td>Fisher</td><td>WU-39321-00</td><td></td></tr><tr><td>바이오하자드 캔</td><td>러버메이드 상업용</td><td>FG614500 RED</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 테이프</td><td>Fisher</td><td>15-903</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 로드</td><td>IRF 시설 제작</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>라이트 박스</td><td>Fisher</td><td>S11552</td><td></td></tr><tr><td>히트 씰러</td><td>피셔</td><td>NC9793612&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>히트 씰 파우치</td><td>Fisher</td><td>01-812-25H</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 위험 백</td><td>Fisher</td><td>01-828E</td><td></td></tr></tbody></table>

(a)의 안전주의 사항 및 운영 절차 bsl-4 실험실 2. 일반 사례

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

바이오 안전성 레벨 4 (BSL-4) 봉쇄 실험실에서 작업 시간과 세부 사항에 큰 관심을 필요로한다. 비 고 결과 병원균과 BSL-2 실험실에서 수행하는 것과 동일한 작업은 BSL-4 환경에서 상당히 오래 걸릴 수 있습니다. 이 증가 된 시간 요구 사항으로 인해 실험실 획득 감염, 잠재적 오염의 작업 환경과 높은 결과 병원균이 가능합니다 릴리즈에서 지역 사회에서 연구원을 보호하기위한 것이다 요인의 군중이다. 실험실 내부, 운동은 필수 전신 안전 정장에 ​​부착 된 공기 호스로 인해 제한됩니다. 또한, 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛 (BSC들)에서 제거 된 모든 항목의 소독이 필요합니다. 실험실 전문가는 BSL-4 실험실의 관행에서 훈련을해야하고 그들이 수행하는 능력에서 높은 능력을 보여 주어야한다. 이 기사의 초점은 적절한 절차 및 실험실 (B)을 보장하는 기술을 간략하게 설명하는 것입니다예제 절차와 표준 바이러스 플라크 분석법을 이용하여 iosafety 실험의 정확성. 실험을 수행하는 것은 시각적으로 강조 할 때 특히 적절한 기술은 BSL-4 환경에서 안전하게 작업 할 수 있습니다. 이러한 기술은 다음과 같습니다 실험, 적절한 작업을 완료 클래스 II BSC의 청소, 폐기물 관리 및 BSL-4 실험실 내부에서 발생하는 폐기물의 안전한 폐기 및 BSL- 내부에서 불 활성화 된 샘플의 제거를위한 클래스 II BSC를 설정 BSL-2 실험실 4 실험실.

BSL-4 실험실 내에서 적절한 절차에 따라이 분석의 안전하고 효과적인 완성을 보장하기위한 중요합니다. 완성 된 매일의 내부 체크리스트 (그림 1)을 참조하여, 실험실 직원은 장비가 완전히 작동 확인합니다. BSC에 중앙의 적절한 몸체 위치가 실험 최적의 공기 유동 상태 (도 2)에서 수행되는 것을 보장한다. 바이러스 샘플을 직렬로 플레이트 당 30-300 플라크 (도 3A) 및 바이러스 역가 (도 3b)을 결정하기 위해이 판을 얻기 위해 희석한다. 다수의 인자 숙주 세포주에 대한 친 화성 바이러스 접종 기법 바이러스 성장, 적절한 희석 범위 및 오버레이의 선택 조건을 포함 8 플라크의 형성에 영향을 미칠. 절차 동안 BSC에서 발생하는 폐기물을 제대로하기 전에 고온 가압 멸균에 의해 이전에 BSC 다시에서 제거에 소독BSL-4 ...

BSL-4 실험실에서 바이러스 분석을 수행하는 것은 필요한 추가 안전 예방 조치로 인해 BSL-2 실험실에서 수행하는 작업에 비해 더 복잡합니다. 여기에서는 BSL-4 실험실 내에서 사용되는 관행 및 절차에 대한 개요를 제시하여 적절한 Class II 생물 안전 캐비닛 사용, 폐기물 관리/처리 및 샘플 제거를 보여줍니다.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 2. 일반 사례

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

이 절차의 전반적인 목표는 플라그 분석법을 예로 들어 생물안전 4등급(BSL-4) 보호복 실험실에서 작업할 때의 안전 수칙을 시연하는 것입니다. 본 절차는 생물안전 4등급 환경에서 표준 플라그 분석법을 수행하기 위해 필요한 수정 사항들을 보여줍니다. 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)의 기술자인 Tracey Burdette가 함께 절차를 시연하겠습니다.일일 내부 시스템 점검 목록을 완료한 후, 5% dual quaternary ammonium 소독액을 분무하여 섀시를 포함한 클래스 II 생물안전작업대의 내부를 세척하십시오. 그 다음, 페이퍼 타월로 작업대를 닦아내되, 분석 과정 중 및 완료 후에 장갑 낀 손을 소독할 수 있도록 소독액이 담긴 분무기를 작업대 내부에 남겨두십시오. 작업대 내부와 섀시에 70% ethanol 용액을 분무하여 끈적이는 소독액을 제거하십시오.생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 사용할 폐기물 용기를 준비합니다. 추가로 투입되는 액체를 고려하여 폐기물 용기 내 이중 4차 암모늄 소독액의 최종 농도가 5% 이상이 되도록 합니다. 5% 이중 4차 암모늄 소독액이 담긴 폐기물 용기를 class II 생물안전작업대 내부에 배치합니다.모든 작업은 2급 생물안전작업대(class II biosafety cabinet)의 내부 중앙에 최대한 가깝게 수행하십시오. 내부 중앙은 작업자를 보호하는 데 가장 효과적인 위치로 설계되었습니다. 바이러스 시료와 대조군 바이러스를 각각 50 µL씩 취해, 2% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's medium 450 µL가 들어 있는 희석 웰(dilution wells)에 넣으십시오.필요한 범위까지 단계 희석을 진행하십시오. 각 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하며 바이러스 샘플을 최소 5회 이상 혼합하십시오. 샘플 내에 기포가 생기지 않도록 천천히 혼합하십시오.완료 후, 희석 웰들을 따로 둡니다. 팁을 폐기할 때, 팁을 폐기 용기에 배출하기 전 폐기 용기에 담긴 소독액으로 각 팁을 헹구어 팁의 내부와 외부를 오염 제거하십시오. 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰에서 배지를 대부분 제거합니다.미리 라벨을 붙인 플레이트의 해당 웰에 정확한 샘플 100 µL를 2회 반복하여 첨가합니다. 작업이 완료되면 장갑을 낀 손에 소독액을 분사합니다. 소독액을 적신 종이 타월로 모든 플레이트의 외부를 닦아낸 후, 플레이트를 손으로 직접 인큐베이터에 넣습니다.1시간 동안 15분마다 플레이트를 8자 모양으로 흔들어 샘플이 세포에 적절히 분산되도록 합니다. 각 웰에 2 mL의 오버레이 혼합물을 첨가하고, 오버레이가 웰 표면에 균일하게 분포되도록 다시 한번 8자 모양으로 흔들어 줍니다. 모든 폐기물은 5% 소독액이 담긴 폐기물 버킷에 완전히 담가 최소 10분 동안 접촉시킵니다.폐기물 버킷의 내외부, 2등급 생물안전작업대 내부, 장비 외관 및 장갑을 낀 손에 5% 소독액을 분무합니다. 소독액이 폐기물 버킷과 기타 표면에 10분 동안 접촉하도록 둡니다. 그 후 항목들을 생물안전작업대에서 꺼내 싱크대로 옮깁니다.사용한 피펫을 오토클레이브용 피펫 트레이에 넣습니다. 폐액통의 내용물을 싱크대의 거름망에 붓습니다. 그다음 빨간색 생물학적 위험물 폐기물 봉투가 깔린 생물학적 위험물 폐기물 전용 용기를 싱크대로 가져와 거름망의 내용물을 빨간색 생물학적 위험물 폐기물 봉투에 버립니다.카트 위의 오토클레이브 트레이에 생물학적 위험물 폐기물 봉투를 놓습니다. 증기가 봉투 내부로 들어갈 수 있도록 오토클레이브 봉투를 테이프로 느슨하게 닫습니다. 그리고 오토클레이브 테이프 중 하나에 본인의 이니셜과 날짜를 기입합니다.오토클레이브에서 타공 금속봉을 꺼내고 상단을 엽니다. 오토클레이브 멸균 사이클이 성공적으로 완료되었는지 확인하기 위해 Geobacillus stearothermophilus 포자가 포함된 생물학적 지표 바이알을 금속봉 안에 넣습니다. 폐기물이 담긴 오토클레이브 트레이를 오토클레이브에 넣습니다.오토클레이브를 작동시키고 사이클이 시작되었는지 확인합니다. 오토클레이브의 작동 화면에 해당 운전의 남은 시간이 표시됩니다. 필요한 배양 기간이 완료되면 플라크 분석 플레이트를 배양기에서 조심스럽게 꺼내어 깨끗한 II등급 생물안전작업대로 직접 옮깁니다.피펫을 사용하여 배지와 오버레이 물질을 흡입하여 소독액 용기에 넣습니다. 바이러스를 불활성화하기 위해 10% 중성 완충 포르말린과 0.8% 크리스탈 바이올렛 혼합액으로 배지를 교체하고 30분 동안 접촉시킵니다. 불활성화 후, 중성 완충 포르말린/크리스탈 바이올렛 혼합액을 조심스럽게 제거하여 별도의 폐기물 용기에 담고, 폐기 전 중화 과정을 거칩니다.싱크대에서 플레이트를 헹구어 과잉 염색액을 제거한 후, 플레이트를 트레이에 담아 완전히 건조시킵니다. 라이트 박스를 사용하여 플라크 수를 측정합니다. 모든 측정값을 기록하고, 표준 공식을 사용하여 바이러스 역가를 계산합니다.불활성화된 시료를 BSL-4 실험실 외부로 반출하기 위해 튜브나 플레이트를 열 밀봉 백에 넣습니다. 백 내부와 시료 튜브 외부를 소독하기 위해 백 내부에 5% 소독제 또는 고정액 용액을 분무합니다. 그 후 백을 열 밀봉합니다.동일한 절차에 따라 이 파우치를 다른 파우치 안에 넣습니다. 두 번째 파우치를 열로 밀봉하고, 파우치 외부를 소독하기 위해 5% 소독액이 담긴 침적 탱크(dunk tank)에 이 이중 밀봉된 파우치들을 최소 10분 동안 담가둡니다. 실험실 내의 침적 탱크 기록부에 튜브의 개수와 크기, 튜브 내 부피, 사용된 제제, 사용된 불활성화 방법, 그리고 샘플이 옮겨질 방을 상세히 기록하십시오.생물안전 4등급(BSL-4) 실험실 내에서 적절한 절차를 준수하는 것은 분석을 안전하고 효과적으로 완료하는 데 매우 중요합니다. 실험실 직원은 완료된 일일 내부 체크리스트를 참조하여 장비가 완전히 작동하는지 확인합니다. 바이러스 역가를 결정하고 웰당 30에서 300개의 플라크가 형성된 플레이트를 얻기 위해 바이러스 샘플을 단계별로 희석합니다.숙주 세포주에 대한 바이러스 친화성, 접종 기술, 바이러스 성장을 위한 조건, 적절한 희석 범위 및 오버레이 선택을 포함한 여러 요인이 플라크 형성에 영향을 미칩니다. 절차 도중 생물안전작업대에서 발생한 폐기물은 두 번 소독합니다. 폐기물은 생물안전작업대에서 제거하기 전에 먼저 한 번 적절히 소독합니다.그 후, 폐기물은 동물 생물안전 4등급 환경을 벗어나기 전에 오토클레이브로 멸균합니다. 이러한 절차를 준수함으로써 Frederick의 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)에서 수행된 동물 생물안전 4등급 연구 동안 실험실 획득 감염 사례는 기록되지 않았습니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 샘플 수에 따라 3~4시간 내에 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 안전하고 성공적인 실험을 위해 희석을 정확하게 수행하고 그에 따라 플라크 수를 계산하며, 모든 안전 예방 조치를 준수하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 양압복으로 인해 발생하는 물리적 제약과 표준 플라크 분석을 완료하는 데 필요한 추가 시간에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

safety-precautions-operating-procedures-an-bsl-4-laboratory-2-general

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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