(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 2. 일반 사례

이 절차의 전반적인 목표는 플라그 분석법을 예로 들어 생물안전 4등급(BSL-4) 보호복 실험실에서 작업할 때의 안전 수칙을 시연하는 것입니다. 본 절차는 생물안전 4등급 환경에서 표준 플라그 분석법을 수행하기 위해 필요한 수정 사항들을 보여줍니다. 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)의 기술자인 Tracey Burdette가 함께 절차를 시연하겠습니다.

일일 내부 시스템 점검 목록을 완료한 후, 5% dual quaternary ammonium 소독액을 분무하여 섀시를 포함한 클래스 II 생물안전작업대의 내부를 세척하십시오. 그 다음, 페이퍼 타월로 작업대를 닦아내되, 분석 과정 중 및 완료 후에 장갑 낀 손을 소독할 수 있도록 소독액이 담긴 분무기를 작업대 내부에 남겨두십시오. 작업대 내부와 섀시에 70% ethanol 용액을 분무하여 끈적이는 소독액을 제거하십시오.

생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 사용할 폐기물 용기를 준비합니다. 추가로 투입되는 액체를 고려하여 폐기물 용기 내 이중 4차 암모늄 소독액의 최종 농도가 5% 이상이 되도록 합니다. 5% 이중 4차 암모늄 소독액이 담긴 폐기물 용기를 class II 생물안전작업대 내부에 배치합니다.

모든 작업은 2급 생물안전작업대(class II biosafety cabinet)의 내부 중앙에 최대한 가깝게 수행하십시오. 내부 중앙은 작업자를 보호하는 데 가장 효과적인 위치로 설계되었습니다. 바이러스 시료와 대조군 바이러스를 각각 50 µL씩 취해, 2% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's medium 450 µL가 들어 있는 희석 웰(dilution wells)에 넣으십시오.

필요한 범위까지 단계 희석을 진행하십시오. 각 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하며 바이러스 샘플을 최소 5회 이상 혼합하십시오. 샘플 내에 기포가 생기지 않도록 천천히 혼합하십시오.

완료 후, 희석 웰들을 따로 둡니다. 팁을 폐기할 때, 팁을 폐기 용기에 배출하기 전 폐기 용기에 담긴 소독액으로 각 팁을 헹구어 팁의 내부와 외부를 오염 제거하십시오. 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰에서 배지를 대부분 제거합니다.

미리 라벨을 붙인 플레이트의 해당 웰에 정확한 샘플 100 µL를 2회 반복하여 첨가합니다. 작업이 완료되면 장갑을 낀 손에 소독액을 분사합니다. 소독액을 적신 종이 타월로 모든 플레이트의 외부를 닦아낸 후, 플레이트를 손으로 직접 인큐베이터에 넣습니다.

1시간 동안 15분마다 플레이트를 8자 모양으로 흔들어 샘플이 세포에 적절히 분산되도록 합니다. 각 웰에 2 mL의 오버레이 혼합물을 첨가하고, 오버레이가 웰 표면에 균일하게 분포되도록 다시 한번 8자 모양으로 흔들어 줍니다. 모든 폐기물은 5% 소독액이 담긴 폐기물 버킷에 완전히 담가 최소 10분 동안 접촉시킵니다.

폐기물 버킷의 내외부, 2등급 생물안전작업대 내부, 장비 외관 및 장갑을 낀 손에 5% 소독액을 분무합니다. 소독액이 폐기물 버킷과 기타 표면에 10분 동안 접촉하도록 둡니다. 그 후 항목들을 생물안전작업대에서 꺼내 싱크대로 옮깁니다.

사용한 피펫을 오토클레이브용 피펫 트레이에 넣습니다. 폐액통의 내용물을 싱크대의 거름망에 붓습니다. 그다음 빨간색 생물학적 위험물 폐기물 봉투가 깔린 생물학적 위험물 폐기물 전용 용기를 싱크대로 가져와 거름망의 내용물을 빨간색 생물학적 위험물 폐기물 봉투에 버립니다.

카트 위의 오토클레이브 트레이에 생물학적 위험물 폐기물 봉투를 놓습니다. 증기가 봉투 내부로 들어갈 수 있도록 오토클레이브 봉투를 테이프로 느슨하게 닫습니다. 그리고 오토클레이브 테이프 중 하나에 본인의 이니셜과 날짜를 기입합니다.

오토클레이브에서 타공 금속봉을 꺼내고 상단을 엽니다. 오토클레이브 멸균 사이클이 성공적으로 완료되었는지 확인하기 위해 Geobacillus stearothermophilus 포자가 포함된 생물학적 지표 바이알을 금속봉 안에 넣습니다. 폐기물이 담긴 오토클레이브 트레이를 오토클레이브에 넣습니다.

오토클레이브를 작동시키고 사이클이 시작되었는지 확인합니다. 오토클레이브의 작동 화면에 해당 운전의 남은 시간이 표시됩니다. 필요한 배양 기간이 완료되면 플라크 분석 플레이트를 배양기에서 조심스럽게 꺼내어 깨끗한 II등급 생물안전작업대로 직접 옮깁니다.

피펫을 사용하여 배지와 오버레이 물질을 흡입하여 소독액 용기에 넣습니다. 바이러스를 불활성화하기 위해 10% 중성 완충 포르말린과 0.8% 크리스탈 바이올렛 혼합액으로 배지를 교체하고 30분 동안 접촉시킵니다. 불활성화 후, 중성 완충 포르말린/크리스탈 바이올렛 혼합액을 조심스럽게 제거하여 별도의 폐기물 용기에 담고, 폐기 전 중화 과정을 거칩니다.

싱크대에서 플레이트를 헹구어 과잉 염색액을 제거한 후, 플레이트를 트레이에 담아 완전히 건조시킵니다. 라이트 박스를 사용하여 플라크 수를 측정합니다. 모든 측정값을 기록하고, 표준 공식을 사용하여 바이러스 역가를 계산합니다.

불활성화된 시료를 BSL-4 실험실 외부로 반출하기 위해 튜브나 플레이트를 열 밀봉 백에 넣습니다. 백 내부와 시료 튜브 외부를 소독하기 위해 백 내부에 5% 소독제 또는 고정액 용액을 분무합니다. 그 후 백을 열 밀봉합니다.

동일한 절차에 따라 이 파우치를 다른 파우치 안에 넣습니다. 두 번째 파우치를 열로 밀봉하고, 파우치 외부를 소독하기 위해 5% 소독액이 담긴 침적 탱크(dunk tank)에 이 이중 밀봉된 파우치들을 최소 10분 동안 담가둡니다. 실험실 내의 침적 탱크 기록부에 튜브의 개수와 크기, 튜브 내 부피, 사용된 제제, 사용된 불활성화 방법, 그리고 샘플이 옮겨질 방을 상세히 기록하십시오.

생물안전 4등급(BSL-4) 실험실 내에서 적절한 절차를 준수하는 것은 분석을 안전하고 효과적으로 완료하는 데 매우 중요합니다. 실험실 직원은 완료된 일일 내부 체크리스트를 참조하여 장비가 완전히 작동하는지 확인합니다. 바이러스 역가를 결정하고 웰당 30에서 300개의 플라크가 형성된 플레이트를 얻기 위해 바이러스 샘플을 단계별로 희석합니다.

숙주 세포주에 대한 바이러스 친화성, 접종 기술, 바이러스 성장을 위한 조건, 적절한 희석 범위 및 오버레이 선택을 포함한 여러 요인이 플라크 형성에 영향을 미칩니다. 절차 도중 생물안전작업대에서 발생한 폐기물은 두 번 소독합니다. 폐기물은 생물안전작업대에서 제거하기 전에 먼저 한 번 적절히 소독합니다.

그 후, 폐기물은 동물 생물안전 4등급 환경을 벗어나기 전에 오토클레이브로 멸균합니다. 이러한 절차를 준수함으로써 Frederick의 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)에서 수행된 동물 생물안전 4등급 연구 동안 실험실 획득 감염 사례는 기록되지 않았습니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 샘플 수에 따라 3~4시간 내에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 안전하고 성공적인 실험을 위해 희석을 정확하게 수행하고 그에 따라 플라크 수를 계산하며, 모든 안전 예방 조치를 준수하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 양압복으로 인해 발생하는 물리적 제약과 표준 플라크 분석을 완료하는 데 필요한 추가 시간에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.