(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 2. 일반 사례

이 절차의 전반적인 목표는 플라크 분석을 예로 들어 생물 안전 레벨 4 보호복 실험실에서 작업할 때 안전한 관행을 입증하는 것입니다. 이 절차는 생물 안전성 레벨 4 환경에서 표준 플라크 분석을 수행하는 데 필요한 수정 사항을 보여줍니다. 저와 함께 절차를 시연한 사람은 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)의 기술자인 트레이시 버데트(Tracey Burdette)입니다.

일일 내부 시스템 점검 목록을 완료하면 새시를 포함한 내부에 5% 이중 4차 암모늄 소독액을 분사하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 청소합니다. 그런 다음 종이 타월로 캐비닛을 닦고 소독액이 들어있는 스프레이 병을 캐비닛 내부에 남겨 두어 분석 중 및 분석 완료 후에 장갑을 낀 손에 스프레이를 뿌립니다. 캐비닛과 창틀 내부에 70%에탄올 용액을 분사하여 끈적한 소독 용액을 제거합니다.

생물 안전 캐비닛에 폐기물 용기를 준비하십시오. 폐기물 용기에 있는 이중 4차 암모늄 소독 용액의 최종 농도가 5% 이상인지 확인하십시오.추가되는 추가 액체를 고려하십시오. 5% 이중 4차 암모늄 소독 용액이 들어 있는 폐기물 용기를 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내부에 넣습니다.

모든 작업은 가능한 한 2등급 생물 안전 작업대의 내부 중앙에 가깝게 수행하십시오. 안쪽 중앙은 자신을 보호하기 위해 가장 정서적인 위치로 설계되었습니다. 50마이크로리터의 바이러스 샘플을 제거하고 바이러스를 제어하고 희석 웰에 2%태아 소 혈청이 있는 Dulbecco의 Modified Eagle's 배지 450마이크로리터에 넣습니다.

필요한 만큼 연속 희석을 진행하십시오. 바이러스 샘플을 피펫 팁과 최소 5회 혼합하고 각 희석 후 피펫 팁을 교체합니다. 샘플에서 기포 생성을 최소화하기 위해 천천히 혼합합니다.

완료되면 희석 웰을 따로 보관하십시오. 팁을 폐기할 때는 쓰레기통의 소독액으로 각 팁을 헹구어 팁 내부와 외부의 오염을 제거한 후 팁을 쓰레기통에 버리십시오. 6개의 웰 세포 배양 플레이트의 웰에서 대부분의 배지를 제거합니다.

100마이크로리터의 올바른 샘플을 미리 라벨링된 플레이트의 적절한 웰에 복제하여 추가합니다. 완료되면 장갑을 낀 손에 소독액을 뿌립니다. 소독액을 적신 종이 타월을 사용하여 모든 플레이트의 외부를 닦은 후 플레이트를 손으로 인큐베이터에 넣으십시오.

으로 플레이트를 흔들어 1시간 동안 15분마다 샘플이 세포 위로 적절하게 분산되도록 합니다. 각 우물에 오버레이 혼합물 2ml를 추가하고 우물 표면 전체에 오버레이를 균등하게 분포시키기 위해 8자 동작으로 다시 한 번 암석을 만듭니다. 모든 폐기물을 폐기물 양동이의 5% 소독액에 최소 10분의 접촉 시간 동안 완전히 담그십시오.

폐기물 양동이의 안팎, 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내부, 장비 외부 및 장갑을 낀 손에 5% 소독액을 분사합니다. 용액을 폐기물 통과 다른 표면에 10분의 접촉 시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 생물 안전 캐비닛에서 항목을 제거하고 싱크대로 가져 가십시오.

사용한 피펫을 고압증기멸균을 위해 피펫 트레이에 넣습니다. 쓰레기 통의 내용물을 싱크대의 여과기에 넣으십시오. 그런 다음 빨간색 생물학적 위험 봉투가 깔린 생물학적 위험 폐기물 용기를 싱크대로 가져오고 여과기의 내용물을 빨간색 생물학적 위험 봉투에 버리십시오.

생물학적 위험 백을 카트의 오토클레이브 트레이에 놓습니다. 증기가 백에 들어갈 수 있도록 테이프로 오토클레이브 백을 느슨하게 닫습니다. 그리고 오토클레이브 테이프 중 하나에 자신의 이니셜과 날짜를 표시하십시오.

오토클레이브에서 천공된 금속 막대를 제거하고 상단을 엽니다. Geobacillus stearothermophilus의 포자가 들어있는 생물학적 지표 바이알을 금속 막대에 넣어 오토클레이브 멸균 주기가 성공적으로 완료되었는지 확인합니다. 폐기물로 채워진 오토클레이브 트레이를 오토클레이브에 넣습니다.

오토클레이브를 시작하고 사이클이 시작되었는지 확인합니다. 오토클레이브의 작동 화면에는 해당 실행에 대한 남은 시간이 표시됩니다. 필요한 배양 기간이 완료된 후 인큐베이터에서 플라크 분석 플레이트를 조심스럽게 제거하고 깨끗한 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 손으로 넣습니다.

배지를 흡입하고 피펫으로 재료를 오버레이하고 소독 용액 용기에 분배합니다. 배지를 10% 중성 완충 포르말린과 0.8% 크리스탈 바이올렛의 혼합물로 교체하여 30분의 접촉 시간 동안 바이러스를 비활성화합니다. 불활화 후, 중성 완충 포르말린/결정 바이올렛 혼합물을 조심스럽게 제거하고 폐기하기 전에 중화할 별도의 폐기물 용기에 넣으십시오.

싱크대에서 접시를 헹구어 과도한 얼룩을 제거한 다음 접시를 트레이에 넣어 완전히 말리십시오. 라이트 박스를 사용하여 명판을 세십시오. 모든 계수를 기록하고 표준 방정식에서 바이러스 역가를 계산합니다.

BSL-4 실험실에서 비활성화된 샘플을 제거하려면 튜브 또는 플레이트를 열 밀봉 백에 넣습니다. 가방 내부에 5% 소독제 또는 고정 용액을 뿌려 가방 내부와 샘플 튜브 외부를 소독합니다. 그런 다음 가방을 열 밀봉합니다.

동일한 절차에 따라 이 파우치를 다른 파우치에 넣으십시오. 두 번째 파우치를 열 밀봉하고 이중 밀봉 파우치를 5% 소독 용액이 들어 있는 덩크 탱크에 최소 10분 동안 넣어 파우치 외부를 소독합니다. 실험실 내부의 덩크 탱크 일지에는 튜브의 수와 크기, 튜브의 부피, 사용된 에이전트, 사용된 불활성화 방법, 샘플이 이송될 방을 설명

생물 안전성 레벨 4 실험실에서 적절한 절차를 따르는 것은 분석의 안전하고 효과적인 완료를 보장하는 데 중요합니다. 완료된 일일 내부 체크리스트를 참조하여 실험실 직원은 장비가 완전히 작동하는지 확인합니다. 바이러스 샘플을 연속적으로 희석하여 웰당 30-300개의 플라크가 있는 플레이트를 얻고 바이러스 역가를 측정합니다.

플라크의 형성에 영향을 미치는 요인에는 숙주 세포주에 대한 바이러스 tropism, 접종 기술, 바이러스 성장 조건, 적절한 희석 범위, 중첩 선택 등 여러 가지 요인이 있습니다. 시술 중 생물 안전 캐비닛에서 생성 된 폐기물은 두 번 소독됩니다. 폐기물은 생물 안전 캐비닛에서 꺼내기 전에 한 번 적절하게 소독됩니다.

그 후, 폐기물은 동물 생물 안전성 레벨 4 환경을 떠나기 전에 오토클레이브됩니다. 이러한 절차를 따름으로써, 프레더릭의 통합 연구 시설(Integrated Research Facility)에서 동물 생물안전성 레벨 4 연구 중 실험실에서 감염된 사례는 기록되지 않았습니다. 이 기술은 기술이 올바르게 수행될 경우 샘플 수에 따라 3-4시간 내에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 안전하고 성공적인 실험을 보장하기 위해 희석을 올바르게 수행하고, 그에 따라 플라크를 세고, 모든 안전 예방 조치를 준수하는 것을 기억하십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 양압 슈트로 인한 신체적 한계와 표준 플라크 분석을 완료하는 데 필요한 추가 시간을 잘 이해하게 될 것입니다.